史 琳 楊傳華

（山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250011）

老年高血壓多以收縮壓升高、脈壓差大、血壓晝夜節(jié)律異常、易發(fā)生直立性低血壓和并發(fā)癥多等為特征［1］，是腦出血、腦梗死、阿爾茲海默病、心力衰竭、腎功能衰竭等最常見的基礎(chǔ)病因，也是誘發(fā)心腦血管意外疾病的主要原因。從中醫(yī)角度而言，高血壓屬于中醫(yī)學(xué)“眩暈病”范疇，“腎虛”為老年高血壓病機(jī)之本，“絡(luò)脈自病”為老年高血壓的病機(jī)。楊傳華教授在多年的臨床實(shí)踐和實(shí)驗(yàn)研究中，總結(jié)并提出了老年高血壓的病機(jī)關(guān)鍵在于“腎氣虧虛，血脈自病”“補(bǔ)腎氣，和血脈”的重要治療方法，制定補(bǔ)腎和脈方。既往研究證實(shí)補(bǔ)腎和脈方可有效地降低老年高血壓患者24 h 血壓、脈壓、脈搏波速度，明顯改善左室舒張功能、大動(dòng)脈彈性和功能，對(duì)老年高血壓、高血壓腎虛證的療效甚佳［2-5］。本研究旨在通過觀察補(bǔ)腎和脈方對(duì)老年自發(fā)性高血壓大鼠下丘腦蛋白質(zhì)組學(xué)的干預(yù)作用，探尋補(bǔ)腎和脈方的分子機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)16 月齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）20只，體質(zhì)量347～372 g，同月齡雄性血壓正常的WKY 大鼠10 只，體質(zhì)量482～502 g。SHR 和WKY 均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，經(jīng)動(dòng)物檢驗(yàn)、檢疫合格。動(dòng)物合格證編號(hào)：SCXK（京）2012-0001。

1.2 藥物

補(bǔ)腎和脈方組成：生黃芪15 g，黃精15 g，桑寄生15 g，女貞子15 g，懷牛膝15 g，炒杜仲15 g，澤瀉9 g。藥材均購自山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，由醫(yī)院煎藥室統(tǒng)一煎制濃縮。

1.3 儀器及試劑

全自動(dòng)大小鼠無創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)（型號(hào)：BP-300A），成都泰盟公司；96 孔型PCR 儀（型號(hào)：Arktik Thermal Cycler），美國Thermo Scientific 公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（型號(hào)：LightCycler 480Ⅱ），美國Roche 集團(tuán)；低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（型號(hào)：ST8），美國Thermo Scientific 公司；高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)：5424R），德國Eppendorf公司；渦旋振蕩器（型號(hào)：QL-901），海門市其林貝爾儀器制造有限公司；離心機(jī)（型號(hào)：PICO17），美國Thermo Scientific 公司；超聲波細(xì)胞破碎儀（型號(hào)：XO），南京先歐儀器制造有限公司；酶標(biāo)儀（型號(hào)：Multiskan MK3），Thermo；恒溫孵浴器（型號(hào)：HH.S4），上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；10K 超濾管（型號(hào)：PN：UFC5010BK），Milipore；高效液相色譜儀（型號(hào)：EASYnLC 1000 System），Thermo Scientic；質(zhì)譜系統(tǒng)（型號(hào)：Q-Exactive），Thermo。RNA 提取試劑TRIzoI，美國Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，Invitrogen 公司；dNTP，OligodT，Promega 公司；2XTaq PCR Master Mix，天根生化科技（北京）有限公司；山羊超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒，編號(hào)PV 9003，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；酶底物顯色劑DAB 顯色試劑盒；丹麥DAKO，基因科技（上海）有限公司；封閉血清，羊封閉血清原液，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Cdc42 兔多克隆抗體（型號(hào)：10155-1-AP），SIRT2 兔多克隆抗體（型號(hào)15345-1-AP），PYK2兔多克隆抗體（型號(hào)：17592-1-AP），辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）ZB-2305，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）ZB-2301，DAB 顯色試劑盒ZLI-9018，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4 給藥方法

補(bǔ)腎和脈方組給予藥物濃度為14.22 g/（kg·d），模型組和正常對(duì)照組給予等量生理鹽水，給藥容積為10 mL/kg，每天上午定時(shí)灌胃給藥，每周給藥6 d，連續(xù)8周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.5.1 血壓 整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期采用尾套式尾動(dòng)脈加壓法測(cè)量大鼠清醒和安靜狀態(tài)下的血壓，包括收縮壓、舒張壓、脈壓差、平均動(dòng)脈壓。

1.5.2 血清中神經(jīng)肽（NPY）、去甲腎上腺素（NE）、C反應(yīng)蛋白（CRP）和血管緊張素Ⅱ（AngⅡ） ELISA 法檢測(cè)大鼠血清中NPY、NE、CRP和AngⅡ的濃度。

1.5.3 下丘腦蛋白質(zhì)組學(xué) 1）組織蛋白提?。焊深A(yù)結(jié)束后處死動(dòng)物，取下丘腦組織，剪碎后用4℃預(yù)冷的生理鹽水反復(fù)沖洗。加入適量的液氮，按照1∶10（W/V）加入樣品裂解緩沖液（7 mol/L 尿素，2 mol/L 硫脲，0.1%CHAPS）及蛋白酶抑制劑PMSF研磨。4 ℃，15 000 r/min，離心15 min，吸取上清，分裝后，置于-80 ℃保存。2）蛋白定量（蛋白質(zhì)濃度測(cè)定）：采用Bradford 法（考馬斯亮藍(lán)法）測(cè)定樣本蛋白濃度。準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)曲線，設(shè)置10個(gè)管的標(biāo)準(zhǔn)品，每孔依次加0.2 μg/μL BSA為0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 μL，補(bǔ)加PBS至最終體積為20 μL，各孔濃度為0.4、0.8、1.2、1.6、2、2.4、2.8、3.2、3.6 μg 蛋白。將樣本按照說明書用裂解緩沖液（7 mol/L 尿素，2 mol/L 硫脲，0.1% CHAPS）稀釋至一定倍數(shù)，使終濃度落在測(cè)量范圍內(nèi)，稀釋好的樣本和標(biāo)準(zhǔn)品的每個(gè)樣品各取10 μL至管中。加300 μL蛋白定量染料，避光，室溫孵育20 min。595 nm測(cè)量吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品濃度。3）蛋白酶解：蛋白定量后取200 μg 蛋白溶液置于離心管中，加入終濃度為25 mmol/L DTT，60 ℃反應(yīng)1 h；反應(yīng)后加入終濃度50 mmol/L 碘乙酰胺，室溫10 min。將還原烷基化后的蛋白溶液加入10 K 的超濾管中，12 000 r/min 離心20 min，棄掉收集管底部溶液。加入溶解緩沖液100 μL，12 000 r/min 離心20 min，棄掉收集管底部溶液，重復(fù)3次。更換新的收集管，在超濾管中加入胰蛋白酶，總量4 μg（與蛋白質(zhì)量比1∶50），體積50 μL，37 ℃反應(yīng)過夜。12 000 r/min 離心20 min，將酶解消化后的肽段溶液離心于收集管底部；在超濾管中加入50 μL 溶解緩沖液，12 000 r/min再次離心20 min，與上一步合并，收集管底部共得到100 μL酶解后的樣品。凍干待上樣。4）鈉升級(jí)反相色譜-Q Exactive進(jìn)行蛋白質(zhì)分析：將高PH反相分離得到的組分用20 μL 12%甲醇，0.1%甲酸復(fù)溶；12 000 r/min 離心10 min，吸取上清上樣；上樣體積10 μL，采取夾心法上樣；Loading Pump 流速350 nL/min，15 min；分離流速300 nL/min，分離梯度見表1。

表1 分離梯度

質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析：選擇SwissProt數(shù)據(jù)庫，質(zhì)譜分析由Thermo Q-Exactive 型質(zhì)譜完成。使用Western blotting分析驗(yàn)證差異蛋白結(jié)果。具體步驟：12%SDS-PAGE，上樣量為40 μg；電轉(zhuǎn)印后，以5%脫脂奶的TBST 室溫封閉1h。加入Cdc42（1∶1 000 稀釋）、SIRT2（1∶500 稀釋）、Ptk2b（1∶500稀釋），以GAPDH 為內(nèi)參，4℃孵育過夜。次日，1×TBST洗滌5 min×5次，加入山羊抗兔IgG二抗（1∶10 000）室溫孵育1.5 h，1×TBST 洗滌5min×4 次。ECL顯色，F(xiàn)luor Chem Q下曝光、條帶半定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血壓比較

見表2。與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠收縮壓、舒張壓、脈壓差、平均動(dòng)脈壓均顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，補(bǔ)腎和脈方組大鼠收縮壓、舒張壓、脈壓、平均動(dòng)脈壓均顯著下降（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血壓比較（mmHg，±s）

表2 各組大鼠血壓比較（mmHg，±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05。下同。1 mmHg≈0.133 kPa。

組 別正常對(duì)照組模型組補(bǔ)腎和脈方組n 10 10 10收縮壓122.33±1.59 193.51±1.82*164.53±1.34△舒張壓76.29±2.79 133.09±1.30*112.58±0.82△脈壓差45.57±1.88 60.48±1.73*52.06±1.72△平均動(dòng)脈壓91.86±1.94 153.19±1.20*131.21±3.49△

2.2 各組大鼠血清NPY、NE、CRP、AngⅡ表達(dá)比較

見表3。與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠NPY、NE、CRP、AngⅡ均顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，補(bǔ)腎和脈方組大鼠NPY、NE、CRP、AngⅡ均顯著下降（P＜0.05）。

表3 各組大鼠血清NPY、NE、CRP、AngⅡ表達(dá)比較（±s）

表3 各組大鼠血清NPY、NE、CRP、AngⅡ表達(dá)比較（±s）

組 別正常對(duì)照組模型組補(bǔ)腎和脈方組n 10 10 10 NPY（pg/mL）120.01±7.37 146.66±8.74*130.06±8.34△NE（pg/mL）192.02±5.82 214.27±7.56*201.92±7.16△CRP（μg/mL）4.29±0.62 9.71±0.82*6.13±0.75△Ang Ⅱ（ng/L）142.28±5.68 188.06±8.18*166.02±6.25△

2.3 各組大鼠下丘腦蛋白質(zhì)組學(xué)情況

與模型組相比，補(bǔ)腎和脈方組大鼠的下丘腦中共檢出2 753 個(gè)差異蛋白點(diǎn)，其中有316 個(gè)蛋白有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），其中201 個(gè)蛋白表達(dá)升高，115 個(gè)蛋白表達(dá)降低。下丘腦差異最大的前30 個(gè)蛋白為：Acan、Serpinh1、Nub1、Slc25a25、Hapln1、Syt2、Rpl23、Pvalb、Ahnak、Uqcrh、Nbas、Cpm、Ggt7、Sez6l、Aarsd1、Lgi3、Esyt1、Nefh、Ptges2、Cst3、Cdc42、Metap2、Mag、RGD1302996、Pacsin3、Epm2aip1、Tfrc、Tstd3、Coq9、Gabrg2（均為表達(dá)上調(diào)）；Dgkb、Vps51、C2cd2l、Limch1、Ptk2b、Lactb、Npy、Cpne7、Arhgap21、Cpne5、Trio、Golga2、Ccdc177、Nop56、Sarm1、Ntrk2、Sec16a、Adgrg1、Dclk1、Nup50、Chgb、Ngef、Coro2a、Rab3b、Btbd8、Zc2hc1a、Txndc12、Wfs1、Ift172、Syngap1（均為表達(dá)下調(diào)）。

2.3.1 下丘腦差異蛋白功能分析 下丘腦中差異蛋白主要集中在轉(zhuǎn)運(yùn)酶活性和離子通道活性方面（表4），差異蛋白主要集中在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜方面（表5）；生物學(xué)功能主要集中在代謝、磷酸化和發(fā)育方面（表6、圖1）。

圖1 下丘腦中差異蛋白的GO富集分析

表4 下丘腦中蛋白分子功能注釋分類

表5 下丘腦中蛋白細(xì)胞定位注釋分類

表6 下丘腦中蛋白生物學(xué)途徑注釋分類

2.3.2 下丘腦KEGG 通路分析 見表7、圖2。采用DAVIA網(wǎng)站分析了差異蛋白在KEGG通路中的富集情況。結(jié)果如下，與模型組相比，補(bǔ)腎和脈方干預(yù)后的SHR 下丘腦中差異蛋白涉及的信號(hào)通路涉及cAMP 信號(hào)傳導(dǎo)途徑、GABA突觸和酒精中毒通路。

圖2 下丘腦中差異蛋白信號(hào)通路

表7 各組大鼠下丘腦差異蛋白的mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較（分，±s）

表7 各組大鼠下丘腦差異蛋白的mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較（分，±s）

組 別正常對(duì)照組模型組補(bǔ)腎和脈方組Cdc42 1.00±0.04 0.30±0.10*0.77±0.18△SIRT2 1.00±0.04 0.58±0.12*0.87±0.10△Ptk2b 1.00±0.09 4.13±0.16*2.16±0.45△

表7 下丘腦中差異蛋白信號(hào)通路

2.3.3 String 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫建立差異蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 通過String 在線數(shù)據(jù)庫分析差異蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)，具體分析結(jié)果如圖3所示。

圖3 下丘腦中String蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.4 各組大鼠下丘腦差異蛋白的mRNA 相對(duì)表達(dá)水平比較

見表7。與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠Cdc42、SIRT2 mRNA 水平顯著下降（P＜0.05），Ptk2b mRNA 相對(duì)表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，補(bǔ)腎和脈方組大鼠Cdc42、SIRT2 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）及Ptk2b mRNA 相對(duì)表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。

3 討 論

老年高血壓病的病機(jī)在于“腎虛為本，絡(luò)脈自病”，腎虛為病機(jī)根本，標(biāo)實(shí)為痰濁瘀血，屬本虛標(biāo)實(shí)之證。高血壓病多起病隱匿，病程較長，“初病在氣，久病在血；初病在經(jīng)，久病入絡(luò)”，絡(luò)脈“溝通表里、滲灌氣血”，而絡(luò)病久、瘀、頑、雜，使得疾病遷延難愈。治療原則應(yīng)遵循“平衡陰陽，調(diào)整氣血”。治法上應(yīng)補(bǔ)益腎氣，調(diào)和血脈。方中重用生黃芪為君藥，“補(bǔ)一身之虛”，氣血通暢調(diào)達(dá)，脈絡(luò)自和，乃補(bǔ)腎和脈之首要，配合黃精、桑寄生，共奏滋腎填精、補(bǔ)腎通絡(luò)之功?！吧蒲a(bǔ)陽者，必于陰中求陽，則陽得陰助，而生化無窮；善補(bǔ)陰者，必于陽中求陰，則陰得陽升，而泉源不竭”，故方中臣以女貞子、炒杜仲合用以陰陽雙補(bǔ)，平補(bǔ)腎之陰陽氣血，使腎氣充盛，懷牛膝引血下行，佐以甘寒之澤瀉，補(bǔ)腎虛，泄腎濁，既能降濕濁，又可制約溫燥諸藥化熱傷津、防補(bǔ)品滋膩戀邪之弊?？v觀本方，共奏補(bǔ)腎益氣、陰陽雙補(bǔ)、活血行氣通絡(luò)之功。

下丘腦是血壓調(diào)節(jié)的內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的接口，下丘腦室旁核（PVN）是通過調(diào)節(jié)心血管、神經(jīng)內(nèi)分泌和其他功能來維持體內(nèi)平衡的關(guān)鍵區(qū)域［6］。有證據(jù)支持下丘腦神經(jīng)元活動(dòng)的改變是導(dǎo)致交感神經(jīng)驅(qū)動(dòng)力增加和血壓升高的主要因素［7］，下丘腦可以調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)元信號(hào)傳導(dǎo)、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、血管緊張素分泌等過程。

本研究顯示，GO功能富集分析提示下丘腦中差異蛋白主要集中在轉(zhuǎn)運(yùn)酶活性、離子通道活性、代謝、磷酸化和發(fā)育方面；差異蛋白主要集中分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜方面。采用DAVIA網(wǎng)站分析差異蛋白在KEGG通路中的富集情況，發(fā)現(xiàn)與SHR 模型組相比，補(bǔ)腎和脈方干預(yù)后的SHR 大鼠下丘腦中差異蛋白有關(guān)的信號(hào)通路涉及cAMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑、GABA 突觸和酒精中毒通路。cAMP 信號(hào)通路在代謝、分泌、鈣穩(wěn)態(tài)、肌肉收縮、細(xì)胞命運(yùn)和基因轉(zhuǎn)錄方面具有重要的調(diào)節(jié)作用。cAMP 是最普遍和多功能的第二信使之一，cAMP 信號(hào)通路對(duì)于細(xì)胞適應(yīng)復(fù)雜環(huán)境的過程非常重要，涉及多個(gè)下游信號(hào)分子家族，例如G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs），鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白（G 蛋白），腺苷酸環(huán)化酶（AC），PDE 和包括A 型激酶錨定蛋白（AKAPs）在內(nèi)的支架蛋白等［8］。cAMP 在細(xì)胞中的功能主要由蛋白激酶A（cAMP 依賴的蛋白激酶EPAC）和直接由cAMP 激活的交換蛋白（cAMP 調(diào)節(jié)的鳥嘌呤核苷酸交換因子cAMP-GEF）執(zhí)行。cAMP 可以嚴(yán)密地監(jiān)控包括代謝、分泌和肌肉收縮在內(nèi)的多種生理病理過程，在血壓的調(diào)節(jié)過程中具有重要的作用［9］。GPCRs 是cAMP 信號(hào)通路中重要的分子，是治療高血壓的重要靶標(biāo)。GPCRs 通過轉(zhuǎn)導(dǎo)激素信號(hào)改變細(xì)胞內(nèi)第二信使水平、效應(yīng)酶和通道活性。第二信使的降低可以抑制血管的擴(kuò)張［10］。下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞通過分泌抗利尿激素，增加腎臟對(duì)水的重吸收和收縮血管，增加血壓。當(dāng)血壓升高時(shí)，壓力反射通過激活γ-氨基丁酸（GABA）抑制血管升壓素神經(jīng)元活動(dòng)，進(jìn)而降低血壓。

Cdc42 編碼了含191 個(gè)氨基酸、21.3 kDa 的小GTPase 蛋白質(zhì)，屬于Ras GTP 酶超級(jí)家族中的Rho 家族。Cdc42 參與肌動(dòng)蛋白和細(xì)胞極性的調(diào)節(jié)。Cdc42與多種細(xì)胞過程密切相關(guān)，如軸突髓鞘、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)控。Cdc42 還參與細(xì)胞遷移和趨化，主要包括巨噬細(xì)胞，T 細(xì)胞，成纖維細(xì)胞等［11］。在原發(fā)性小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中，Cdc42 的缺失會(huì)導(dǎo)致異常細(xì)胞的擴(kuò)散，減少對(duì)纖維蛋白的黏附，導(dǎo)致傷口愈合的缺陷，并隨血清梯度下降其趨化性減弱［12］。有研究發(fā)現(xiàn)SIRT2 在神經(jīng)生長和神經(jīng)細(xì)胞神經(jīng)活動(dòng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用［13］。研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ和機(jī)械拉伸通過SIRT2 刺激內(nèi)皮細(xì)胞的微管再分布和去乙?；?，在高血壓誘導(dǎo)的血管重塑中發(fā)揮重要作用［14］。Ptk2b 與高血壓密切相關(guān)。與正常血壓小鼠相比，神經(jīng)源性高血壓小鼠下丘腦中Ptk2b 表達(dá)明顯減低［15］。AngⅡ誘導(dǎo)的Ptk2b 磷酸化促進(jìn)VSMC 增殖［16］。AngⅡ通過細(xì)胞膜上GPCR受體信號(hào)傳導(dǎo)，激活pyk2（ptk2b），通過MAPK 信號(hào)通路，磷酸化MEK 和ERK，間接促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化。大樣本的高血壓人群研究顯示Ptk2b 與高血壓相關(guān)［17］。有研究顯示血管緊張素、血管收縮、鈉/鉀調(diào)節(jié)與Ptk2b 相關(guān)［18］。

因此，研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎和脈方對(duì)下丘腦的保護(hù)可能是通過上調(diào)Cdc42 從而促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞活力實(shí)現(xiàn)的。SIRT2 可能通過抑制炎癥反應(yīng)和促進(jìn)細(xì)胞的活力促進(jìn)下丘腦組織的功能進(jìn)而影響大鼠的血壓。Ptk2b 可能通過改變下丘腦神經(jīng)元細(xì)胞活力對(duì)下丘腦起到保護(hù)性的作用，進(jìn)而延緩高血壓病的發(fā)生。