高航，柴貝貝，張春杰，張麗媛

鄭州賽科藥業(yè)科技有限公司，鄭州 450000

鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌(Riemerellaanatipestifer)引起的1 種接觸性傳染性疾病，又稱為鴨傳染性漿膜炎、鴨疫綜合癥等[1]。多發(fā)于1～6 周齡的小鴨，發(fā)病率可達(dá)90%，若不及時(shí)控制，死亡率可達(dá)80%。該病的主要癥狀有急性或慢性敗血癥、鼻分泌物增多、咳喘、下痢、頭頸震顫，少數(shù)慢性病例出現(xiàn)頭頸歪斜等癥狀，會(huì)形成較明顯的“淚痕”，且大多生長(zhǎng)緩慢形成“僵鴨”[2]。剖檢主要有纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、關(guān)節(jié)炎等癥狀，常引起小鴨的大批發(fā)病和死亡，目前已成為危害肉鴨養(yǎng)殖業(yè)的一種最常見細(xì)菌病[3]，并且不僅感染鴨類，鵝、火雞等禽類也可感染發(fā)病[4]。

該病的控制難點(diǎn)在于鴨疫里默氏桿菌的血清型較多，目前較認(rèn)同的有25 種，不同時(shí)期、不同地區(qū)、不同場(chǎng)址的主要流行血清型都有所不同，并且在同一鴨場(chǎng)，甚至是同一批鴨群也可能同時(shí)存在多個(gè)血清型，且不同血清型之間的交叉保護(hù)性較低，而且難以凈化，較為有效的方法是分離流行菌株進(jìn)行疫苗研制，疫苗的抗原血清型與養(yǎng)殖中流行菌株的血清型最大程度吻合，才能保證免疫效果最佳[5]。防治該病最根本的是做好預(yù)防工作，加強(qiáng)鴨場(chǎng)的飼養(yǎng)管理，改善衛(wèi)生條件，減少鴨群應(yīng)激，建立完善的防疫和消毒制度[6]；在上述情況滿足的條件下合理進(jìn)行疫苗免疫，合理用藥，綜合防治，有效減少鴨群的發(fā)病和死亡[7]。

河南周口的鴨場(chǎng)在2023 年3–4 月階段性暴發(fā)該病，發(fā)病率33.43%，死亡率11.12%，癱瘓率23.57%，損失嚴(yán)重，通過臨床癥狀和剖檢癥狀初步判定為鴨疫里默氏桿菌病，然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷，確診為鴨疫里默氏桿菌引起的鴨疫里默氏桿菌病。通過對(duì)發(fā)病鴨群進(jìn)行中西藥結(jié)合治療，延緩了病情發(fā)展，同時(shí)采集病料進(jìn)行鴨漿膜炎口服制劑的制備，通過灌服或飲水飼喂后，疾病得到明顯地控制，死亡率和癱瘓率顯著下降。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）樣品來源：河南周口某鴨場(chǎng)發(fā)病死亡鴨3 只（3～4周齡）。

2）試驗(yàn)鴨來源：河南周口某鴨場(chǎng)櫻桃谷鴨，4 周齡、6周齡SPF雛鴨各9只，2周齡SPF雛鴨39只。

3）試劑與培養(yǎng)基：無菌蒸餾水、無菌生理鹽水、甲醛、胎牛血清、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、市售蜂膠、95%乙醇。

4）儀器與工具：MD30-B 顯微鏡（江南）、WJ-160A 二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（上海誦誠）、XFS-280 高壓滅菌鍋（浙江新豐）、低溫離心機(jī)（Sigma）、SHA-C恒溫?fù)u床（常州普天司）、錐形瓶、250 mL 和500 mL滅菌疫苗瓶、移液器、剪刀、鑷子。

2.2 方 法

1）剖檢：將病鴨置于無菌托盤，腹部向上，使用滅菌后的剪刀剖開腹腔，檢查腹腔與內(nèi)臟情況。

2）菌株純化：將3株保藏菌株進(jìn)行活化，分別抽取200 μL 保藏菌液加入含5%胎牛血清的TSB 中，37 ℃的恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h 后，接種于含有5%胎牛血清的TSA，并于37 ℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察是否有污染，并挑取單個(gè)菌落鏡檢。將挑取的單個(gè)菌落在37 ℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48 h，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后備用。

3）蜂膠提純：將市售蜂膠放置4 ℃儲(chǔ)存，用時(shí)取出，及時(shí)粉碎后過篩，按照重量比1:2 加入95%乙醇，室溫浸泡24～48 h，浸泡期間可以超聲，增加溶解，浸泡后4 ℃ 8 000 r/min 離心取上清，用無菌紗布過濾，得到清澈透明的純凈蜂膠浸液。

4）口服制劑的制備：將擴(kuò)大培養(yǎng)后的3 種菌液培養(yǎng)至濃度為109cfu/mL 時(shí)加入0.2%甲醛進(jìn)行滅活，繼續(xù)37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h 后取100 μL 涂板鑒定菌液是否完全滅活。將滅活后的菌液進(jìn)行離心，留下菌體沉淀備用。將所有菌體用無菌生理鹽水重懸后混勻，然后緩慢加入已處理好的蜂膠液，邊加邊混勻，使蜂膠液終濃度為10 mg/mL，最后根據(jù)需求量補(bǔ)足無菌生理鹽水。

5）口服制劑的效果驗(yàn)證：①無菌檢測(cè)：用移液器吸取250 μL 口服制劑，分別接種于TSA，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h。

②緊急接種：將制備好的口服制劑按照每只灌服或飲水300 μL應(yīng)用在鴨場(chǎng)，同時(shí)增加鴨群日糧中的蛋白質(zhì)和維生素含量，可適量配合黃芪多糖[8]，控制飲水量。

③安全性試驗(yàn)：分別取2、4、6周齡SPF雛鴨各9只，分3 組，每組3 只，一共9 組，按照低、中、高劑量進(jìn)行灌服，即：第1、2、3 組處理分別在2 周齡飼喂200、500、1 000 μL，第4、5、6組處理分別在4周齡飼喂200、500、1 000 μL，第7、8、9 組處理分別在6 周齡飼喂200、500、1 000 μL。觀察飼喂后0.5、6.0、24.0 h，是否有鴨只出現(xiàn)不良反應(yīng)，如嘔吐、拉稀、癱瘓、死亡等情況。

④免疫試驗(yàn)：選取60 只2 周齡SPF 雛鴨分為5組，每組12 只，分組名稱為第1、2、3、4、5 組，第1 組處理為生理鹽水，第2組為市售鴨漿膜炎產(chǎn)品組，按照說明書要求每只肌注200 μL，第3、4、5 組均為口服制劑，劑量分別為200、500、1 000 μL。免疫當(dāng)天為第0 天，于免疫后7、14、24 d 鴨跖骨內(nèi)側(cè)靜脈采血，分離血清檢測(cè)抗體。

⑤攻毒試驗(yàn)：將已免疫過的5 組雛鴨每組隨機(jī)選取6 只進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，每只肌肉注射200 μL，觀察鴨只是否出現(xiàn)癱瘓、下痢、死亡等癥狀，并計(jì)算保護(hù)率。保護(hù)率=（對(duì)照組發(fā)病率－接種組發(fā)病率）/對(duì)照組發(fā)病率。

2 結(jié)果與分析

2.1 剖 檢

解剖發(fā)現(xiàn)纖維素性心包炎、肝周炎、關(guān)節(jié)炎癥狀，見圖1。

圖1 肝周炎病變

2.2 菌株純化

鏡檢沒有發(fā)現(xiàn)雜菌污染，見圖2。

圖2 革蘭氏陰性菌（10×100）

2.3 蜂膠提純

稱取500 g 市售蜂膠，加入1 L 95%乙醇，25 ℃浸泡48 h后，4 ℃ 8 000 r/min離心取上清，用無菌紗布過濾，最終得到0.5 g/mL 的清澈透明蜂膠液800 mL 放置4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.4 口服制劑制備

本次制備了100 g 濕菌體，采用500 mL 生理鹽水重懸后，緩慢加入已處理好的蜂膠液，使蜂膠液終質(zhì)量濃度為10 mg/mL，邊加邊混勻，最后加入無菌生理鹽水，補(bǔ)足至40 L。

2.5 口服制劑效果驗(yàn)證

1）滅活檢測(cè)：將涂布的TSA 平板放入培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)12 h后無菌生長(zhǎng)，滅活檢測(cè)合格。

2）安全性試驗(yàn)：飼喂后鴨只沒有出現(xiàn)不良反應(yīng)，偶有應(yīng)激系抓取導(dǎo)致，待平靜后恢復(fù)正常狀態(tài)。

3）緊急接種：應(yīng)用該口服液后3 d，鴨群臨床無新增死亡鴨，發(fā)病率降低至7.3%，說明該口服制劑產(chǎn)生了較好的應(yīng)急免疫作用。

4）免疫試驗(yàn)：在免疫后7、14、21 d 跖骨內(nèi)側(cè)靜脈采血，分離血清檢測(cè)抗體，結(jié)果采用SPASS 22.0分析。由表1 可知：該口服制劑中劑量組在第14 天就可以達(dá)到較高的抗體水平，高劑量組在第21天仍有較高的抗體水平，但考慮到成本問題，臨床使用時(shí)，可以在第1天使用中劑量，即每只鴨灌服或飲水500 μL，在第21天加強(qiáng)免疫1次。

表1 免疫后7、14、21 d抗體含量 ng/L

5）攻毒試驗(yàn)：在96 h 內(nèi)，第2 組和第3 組處理的保護(hù)率為60.1%，第4 組和第5 組處理的保護(hù)率為100%。

3 討 論

鴨疫里默氏桿菌病對(duì)肉鴨行業(yè)的危害很大，在預(yù)防和治療上雖然使用抗菌藥物有一定的效果，但抗菌藥物的長(zhǎng)期使用，會(huì)導(dǎo)致鴨疫里默氏桿菌的耐藥性增加，治療效果不明顯[9]。因此，通過增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病菌的抵抗力，降低藥物使用量，是預(yù)防鴨疫里默氏桿菌病及降低發(fā)病率的重要措施之一[10]。本次制備的口服制劑選擇的菌株均是從該養(yǎng)殖場(chǎng)分離的，針對(duì)性強(qiáng)，可以改善普通疫苗血清型不同導(dǎo)致的保護(hù)率低的問題，更好地發(fā)揮應(yīng)急免疫作用，且蜂膠免疫佐劑是1種天然產(chǎn)物，有研究表明，蜂膠本身無明顯抗原性和過敏性，毒副作用較小[11]。作為1 種具有廣譜生物活性的物質(zhì)，不僅能夠提高機(jī)體的特異性免疫，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，而且還能增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫，促進(jìn)抗體的產(chǎn)生，應(yīng)用蜂膠配合抗原進(jìn)入機(jī)體可以增加抗體產(chǎn)量和保護(hù)率[12-13]，將蜂膠與抗原按比例混合接種于機(jī)體后，可以增強(qiáng)補(bǔ)體的功能，產(chǎn)生較多的抗體，提升血清抗體水平，是天然的免疫增效佐劑，并且具有抑菌性和更高的安全性[14]。但是市售的鴨漿膜炎產(chǎn)品多為注射劑，易造成鴨只的應(yīng)激反應(yīng)，并且鴨疫里默氏桿菌血清型較多，市售的注射劑不一定符合本場(chǎng)流行菌株，可能出現(xiàn)疫苗保護(hù)率低的問題[15]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，該口服制劑中劑量組在第14天可以達(dá)到較高的抗體水平，高劑量組在第21天仍有較高的抗體水平，能夠起到快速治療和應(yīng)急免疫的輔助作用。該口服制劑是針對(duì)個(gè)別養(yǎng)殖場(chǎng)的病原血清型制備，在一定程度上可以起到很好的應(yīng)急免疫作用，但也存在一定的應(yīng)用范圍制約，因此應(yīng)規(guī)范應(yīng)用，不隨意擴(kuò)大應(yīng)用范圍。