程 靜，李麗嬋，陳 旭，蔡茜茜, ，余 劼，余立揚，汪少蕓,

（1.福州大學生物科學與工程學院，福建福州 350108；2.福建光陽蛋業(yè)股份有限公司，福建福清 350300）

皮蛋具有風味獨特，營養(yǎng)豐富，易于吸收的特點。皮蛋在腌制過程中，由于強堿的作用，蛋白質降解成多種小分子活性肽，因此皮蛋具有多種功能活性，如抗炎、抗氧化、抗癌等[1-2]。皮蛋的生產(chǎn)工藝最初是通過將新鮮的禽蛋包裹在泥、植物灰、純堿、生石灰和PbO 的混合物中4～6 周制備而成，但這種加工工藝復雜且含有對人體有害的鉛，限制了皮蛋的發(fā)展。隨后，皮蛋的生產(chǎn)使用NaOH 來代替純堿和生石灰；使用浸泡法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的“涂泥法”；使用ZnSO4、CuSO4、Fe2（SO4）3等來代替PbO 以降低其加工的復雜性和不安全性。

凝膠化是蛋白質的特性之一，是指蛋白質變性后，分子鏈展開，隨后通過疏水相互作用、二硫鍵和氫鍵等相互聚集和結合形成高度有序的凝膠結構。而皮蛋的加工原理就是利用了蛋白質的凝膠特性，通過利用強堿穿透蛋殼，作用于蛋清和蛋黃誘導其發(fā)生物理或化學變化。在物理層面表現(xiàn)為蛋清和蛋黃的凝固和變色。在化學層面表現(xiàn)為皮蛋的蛋白質和脂肪分解成多種肽、氨基酸和揮發(fā)性物質，然后通過各種相互作用或反應形成具有凝膠結構和特殊風味的物質。穿過蛋殼進入皮蛋的強堿受到金屬離子的調控[3-4]，主要調控方式為：a.蛋白質在高pH 條件下分解產(chǎn)生H2S，H2S 向外遷移至皮蛋殼與滲透到皮蛋殼內部的金屬離子反應生成沉淀顆粒從而堵塞蛋殼的氣孔，防止堿的過度滲透破壞凝膠。b.通過影響分子間作用力與蛋白質相互作用促進蛋白質凝膠的形成，從而控制堿液的滲透速率[5]。Ksp 是難溶電解質的溶解度，其值越小說明形成的沉淀越穩(wěn)定[6]。相同溫度下，各種金屬硫化物的Ksp 值的大小為：KspFe2S3＞KspZnS＞KspPbS＞KspCuS。由于沉淀的Fe2S3顆粒不穩(wěn)定，因此Fe2（SO4）3的腌制效果較差，其次是ZnS。雖然CuS 和PbS 的Ksp 較小，但鉛對人體毒性較大，因此CuSO4常被用來生產(chǎn)皮蛋。

近來學者們綜述了皮蛋的營養(yǎng)活性以及常規(guī)的加工工藝，對皮蛋的應用與普及具有很大的推動作用。然而，目前還沒有對皮蛋加工過程中凝膠和風味形貌形成機制的系統(tǒng)綜述。本文針對金屬化合物對堿液的調控機制、凝膠、色澤、風味形貌以及松花形成的機制展開了系統(tǒng)全面的綜述，旨在為皮蛋的生產(chǎn)加工技術和產(chǎn)品開發(fā)提供理論支持。

1 皮蛋凝膠形成機制

皮蛋凝膠主要包括蛋清凝膠和蛋黃凝膠。因為蛋清和蛋黃的成分差別顯著，使其凝膠形成機制也有較大差異。綜述皮蛋凝膠形成機制，對皮蛋加工工藝改進和功能性皮蛋產(chǎn)品開發(fā)具有重要的理論指導意義。

1.1 皮蛋清凝膠的形成機制

鴨蛋清中含有大量的蛋白質，主要包括卵清蛋白、卵轉鐵蛋白、卵粘蛋白、卵類粘蛋白、溶菌酶等[7-9]，這些蛋白質是凝膠形成的物質基礎[10-11]?；谶@些蛋白質成膠性的研究中，Hu 等[12]將卵清蛋白琥珀酰化后使其富集電負離子，然后進行堿處理，使蛋白分子膨脹，蛋白質內部的疏水結構暴露，最后通過熱誘導使其形成凝膠。Wang 等[13]研究表明，卵轉鐵蛋白可以與溶菌酶通過靜電相互作用形成438 nm的球形微粒；與卵清蛋白在靜電相互作用下可以組裝形成137 nm 的球形納米凝膠。Xue 等[6]研究表明，在強堿的誘導下蛋清蛋白發(fā)生膨脹，在表面聚集大量的負電荷，蛋白之間的靜電斥力增加，從而抑制蛋白質的聚集形成透明凝膠。Eiser 等[14]從材料科學的角度出發(fā)，闡明了蛋清在加工過程中的物相變化，推斷出皮蛋清凝膠是一種膠體粒子通過長程靜電斥力和短程吸引力而聚集形成的高度無定形且結構穩(wěn)定的精細鏈狀結構，以上研究均證明蛋清蛋白具有凝膠特性。

皮蛋凝膠形成過程中，其凝膠機制如圖1A 所示，腌制初期，強堿進入蛋清中導致蛋白質變性和展開，但初級和次級結構尚未受損，由此產(chǎn)生的構象變化暴露了分子內的疏水基團，使蛋清中的游離水逐漸增加，黏稠度逐漸降低。隨著腌制的進行，一些蛋白質基團被電離，與周圍的其他離子形成離子鍵。同時蛋白質二級結構受損，氫鍵斷裂，暴露的巰基會生成二硫鍵。這時大量的游離水通過離子鍵與電離后的蛋白質再次結合形成結合水，促進皮蛋清凝膠的形成。除堿外，金屬離子還可與蛋白質結合影響其二級結構，增加β-折疊，促進蛋白質的交聯(lián)[15]，且不同金屬離子對皮蛋清凝膠具有不同的影響。Shao 等[15]表明，銅離子主要通過影響蛋清蛋白間的疏水相互作用和二硫鍵來影響凝膠的微觀結構和質構特性。銅離子低于0.1%時，在一定程度上有利于凝膠形成均勻、致密網(wǎng)狀結構。Deng 等[16]在不同金屬離子對皮蛋清凝膠特性的影響研究中發(fā)現(xiàn)，凝膠樣品中氫鍵含量較低，表明氫鍵極少參與蛋清凝膠的形成，二硫鍵、離子鍵最多，疏水作用次之。蛋清凝膠中的離子鍵主要來自蛋白質分子離子基團與水分子之間的離子鍵；蛋白質之間的靜電斥力；以及蛋白分子和金屬陽離子之間的靜電吸引力。金屬離子主要通過以下三種方式顯著影響蛋清凝膠中的離子鍵、二硫鍵和疏水相互作用：a.與蛋清蛋白中的巰基反應導致巰基含量降低，從而導致二硫鍵的含量降低；b.屏蔽蛋白質分子之間的靜電作用力，導致離子鍵降低；c.改變蛋白質的二級結構，導致蛋白β-折疊結構增多，疏水相互作用增加。Deng 等[16]還發(fā)現(xiàn)高價離子容易增大皮蛋清凝膠的顆粒，促進凝膠聚合物的形成，而低價金屬離子有利于改善凝膠特性，增加皮蛋清可溶性蛋白含量，提升凝膠的持水力、硬度和彈性。此外，腌制后的蛋清，水分明顯減少，這也有利于皮蛋凝膠的形成。

圖1 皮蛋凝膠的形成機制Fig.1 Formation mechanism of preserved egg gel

盡管皮蛋清凝膠形成的機理已經(jīng)闡明，但仍有許多問題需要解決。首先，雖然皮蛋清凝膠的形成和維持的主要力是離子鍵和二硫鍵，但這一過程中蛋白質（或其他物質）之間的結合模式或結合位點還不清楚。第二，金屬離子促進蛋白質交聯(lián)的具體機制是什么。這對皮蛋清凝膠的研究和開發(fā)具有重要作用。未來的研究可以更多地運用分子對接和分子動力學模擬來分析小分子蛋白質與小分子化合物（如水、金屬離子和堿）之間的相互作用，并探索結合模式和結合位點，從而對皮蛋清凝膠的形成機理進一步研究，為皮蛋制品的加工與開發(fā)提供理論指導。

1.2 皮蛋黃凝膠的形成機制

皮蛋黃在腌制一段時間后可分為凝膠狀的外蛋黃和溶膠狀的內蛋黃，其凝膠機制見圖1B。在腌制過程中，內蛋黃的蛋白條帶沒有顯著變化；而外蛋黃的蛋白條帶逐漸減弱，出現(xiàn)高分子量和低分子量條帶，這表明，外蛋黃蛋白逐漸分解成低分子量肽或氨基酸，并有部分重新聚集形成高分子聚合物[17]。維持內蛋黃溶膠結構的力主要有離子鍵和氫鍵，而維持外蛋黃的力主要是離子鍵、疏水相互作用、二硫鍵和其他形式的共價鍵[17]。從微觀結構來看，內蛋黃形成了均勻且致密的網(wǎng)絡結構，而外蛋黃形成了不規(guī)則的凝膠結構但比內蛋黃更致密[18]。內蛋黃和外蛋黃的蛋白質二級結構也發(fā)生了改變，內蛋黃和外蛋黃的分子內β-折疊含量隨著分子間β-折疊的增加而顯著降低，表明蛋白質分子先展開后聚集[17]。內蛋黃和外蛋黃的β-轉角增加，而α-螺旋和無規(guī)卷曲減少。這可能是因為在參與聚集的蛋白質分子凝膠化過程中，α-螺旋轉化為β-轉角。雖然內部蛋黃沒有形成凝膠，但內部蛋黃中蛋白質和脂質的相互作用形成了穩(wěn)定和均勻的粘性流體。堿處理后內蛋黃的離子鍵顯著降低，主要由于在弱堿環(huán)境下，帶負電荷的蛋白質分子表面會形成靜電排斥力。而添加的金屬陽離子能在一定程度上削弱蛋白質分子之間的排斥力，促進蛋白質聚集。在內部蛋黃中，氫鍵的數(shù)量隨腌制時間的增加而增加。一方面由于外蛋黃凝膠形成時一部分水遷移到了內部蛋黃中，同時也阻礙了內蛋黃中的水向外部遷移；另一方面由于內部蛋黃形成凝膠時一部分結合水變成自由水，導致內蛋黃保持較高的水分含量，導致氫鍵含量增加。由于靜電斥力降低促進了二硫鍵的形成，導致內蛋黃中的二硫鍵逐漸增加。但二硫鍵的含量相對較少。因此，離子鍵和氫鍵可能是穩(wěn)定內部蛋黃溶膠系統(tǒng)的主要分子間作用力。

蛋黃是一種天然的脂蛋白組合體。通過簡單的離心可以被分成上下兩層，上層為蛋黃漿部分，下層為顆粒部分[18]。為了進一步研究皮蛋黃的凝膠機制，Yang 等[18]使用堿分別處理蛋黃、蛋黃漿和顆粒，結果發(fā)現(xiàn)三者都能形成凝膠，且顆粒凝膠的硬度大于蛋黃和蛋黃漿凝膠，這表明顆粒凝膠具有更穩(wěn)定的網(wǎng)絡結構。堿處理后，蛋黃、蛋黃漿和蛋黃顆粒的蛋白條帶變淺，且在高分子量處出現(xiàn)條帶，表明堿處理使蛋白質降解后重新聚合成大的聚合物。維持蛋黃漿凝膠的力主要是離子鍵和氫鍵，而維持顆粒凝膠的力主要是離子鏈、疏水相互作用和二硫鍵。Xue 等[6]表明蛋黃漿凝膠的分子間相互作用力的組成和變化規(guī)律與內部蛋黃基本相同，而蛋黃顆粒凝膠的組成和變化規(guī)律與外部蛋黃凝膠基本相同。Yang 等[18]通過電泳實驗發(fā)現(xiàn)蛋黃漿由大量的低密度脂蛋白（LDL）和少量的卵黃蛋白組成；顆粒由大量的高密度脂蛋白（HDL）、少量的LDL 和卵黃高磷蛋白組成[18-19]。Yang 等[17]也對皮蛋的內蛋黃和外蛋黃的組成進行了分析，結果也發(fā)現(xiàn)內蛋黃主要成分為LDL，外蛋黃主要成分為HDL[18]，分別與蛋黃漿和顆粒的成分類似。Yang 等[20]表明HDL 和LDL 在強堿處理下都可以形成凝膠。且HDL 和蛋黃顆粒凝膠均具有較大的硬度。LDL 是一種球形分子，在強堿的作用下，LDL 結構被破壞，甘油三酯、膽固醇酯、膽固醇和蛋白質被釋放，然后通過化學鍵緊密結合，形成非球形LDL 聚集體。LDL 聚集體之間存在靜電排斥，因此內部蛋黃經(jīng)常呈現(xiàn)溶膠狀態(tài)。HDL 通過離子鍵、疏水作用力、二硫鍵和其他共價作用力可以形成均勻且致密的網(wǎng)絡結構。最后，在強堿和金屬離子的作用下，HDL 和LDL 中的脂質和蛋白質逐漸遷移，最終形成蛋黃凝膠，如圖1B 所示。

雖然蛋黃凝膠的形成機制已經(jīng)有一些研究，但研究仍然存在不足。首先，蛋黃具有復雜的結構，蛋黃干物質中含量最多的是脂質，其次是蛋白質，但目前蛋黃凝膠形成的主要研究對象仍然是蛋白質，缺乏對脂質的研究。除此外，金屬離子以及水分遷移規(guī)律對蛋黃凝膠的形成也具有重要作用。未來，為了進一步探索蛋黃凝膠的形成機制，應綜合考慮各方面因素，尤其是脂質在皮蛋黃凝膠形成中的作用。可以利用同位素標記研究皮蛋黃凝膠形成過程中脂質和蛋白質的變化過程。

2 金屬化合物在皮蛋加工過程中的遷移規(guī)律及動態(tài)調節(jié)過程

2.1 金屬化合物在皮蛋加工過程中的遷移規(guī)律

金屬化合物在皮蛋的生產(chǎn)加工中具有重要作用，其在腌制過程中會隨著腌漬液逐漸滲透到皮蛋內部，探明金屬化合物的遷移規(guī)律對優(yōu)化皮蛋的加工工藝具有重要意義。有研究表明新鮮鴨蛋的蛋殼、蛋清和蛋黃均含有一定量的銅，其可能來自飼料[21]。CuSO4和CuSO4/ZnSO4腌漬的蛋清中的銅含量均呈現(xiàn)先增加后減少，再增加的趨勢。蛋清中銅含量下降可能由于不溶性銅硫化物沉積在蛋殼的氣孔和蛋殼膜上，減緩了銅從腌漬液向蛋清的滲透，而蛋清中的銅會繼續(xù)向蛋黃中滲透，因此蛋清中銅含量下降。隨著蛋清和蛋黃之間的滲透壓逐漸減小，銅從蛋清滲透到蛋黃的速度也會降低，直到達到動態(tài)平衡，蛋清和蛋黃中的銅保持穩(wěn)定。隨著外蛋黃的凝固，銅從腌漬液滲透到蛋清的速率大于蛋清向蛋黃滲透的速率，導致蛋清中的銅再次升高。隨著腌制的進行，蛋清和外蛋黃中的銅逐漸滲透到內蛋黃中，導致內蛋黃中銅含量逐漸增加。用CuSO4/ZnSO4腌制的皮蛋殼中的銅含量隨著腌制天數(shù)的增加而升高，且低于用CuSO4腌制皮蛋蛋殼的銅含量?？赡苡捎阡\產(chǎn)生的不溶性物質穩(wěn)定性差，在強堿作用下會重新溶解，從而失去堵孔效果[22]，這些孔再次被形成的更穩(wěn)定的銅硫化物堵塞，從而導致蛋殼中銅含量在腌制后期快速增加[3]。CuSO4/ZnSO4腌制的皮蛋殼中的鋅含量隨著腌制天數(shù)的增加而增加。蛋殼中的鋅含量先迅速增加，隨后略有波動，可能由于ZnS 穩(wěn)定性差，在強堿作用下溶解，鋅鹽的形成和溶解存在動態(tài)平衡。在腌制后期，由于孔隙逐漸填滿，溶解的沉淀物減少，導致蛋殼中鋅含量再次增加。蛋清中鋅含量呈現(xiàn)先升高再降低后不變的趨勢。與蛋清中銅含量的降低類似，鋅含量的降低可能由于CuSO4/ZnSO4產(chǎn)生的不溶性化合物堵塞蛋殼和蛋殼膜孔阻礙了鋅的滲透，而蛋清中的鋅仍然以相同的速度向蛋黃滲透，導致鋅含量下降。在腌制后期，由于銅和鋅形成的不溶物質的堵塞作用、蛋清凝膠以及外部蛋黃的凝固，使蛋清中的鋅含量幾乎不變。內蛋黃中鋅含量逐漸增加。由于鉛對人體健康具有嚴重危害，因此鉛在皮蛋中的遷移規(guī)律這里不做說明。除銅和鋅外，鉀、鈣、鐵等金屬化合物也會影響皮蛋清凝膠的形成[16]，但其在皮蛋中的遷移規(guī)律目前還沒有研究。未來，可以研究鉀、鈣、鐵等金屬化合物在皮蛋中的遷移規(guī)律，以期開發(fā)出無重金屬化合物皮蛋加工技術。

綜上所述，皮蛋腌制過程中，腌漬液的金屬元素會滲透到皮蛋清和皮蛋黃中，因此要合理食用皮蛋。除此外，研究者可以探索具有與銅和鋅相似遷移規(guī)律的金屬離子，在保持皮蛋品質和風味的同時減少重金屬離子的使用。

2.2 金屬化合物在皮蛋加工過程中對堿液的動態(tài)調控

在皮蛋的凝固過程中，堿滲透的速度和量直接決定了皮蛋的質量。如果滲透量過低，則蛋白質變性不足以使皮蛋正常凝固；相反，滲透量過高會進一步作用于形成的皮蛋凝膠，破壞凝膠結構。動態(tài)調節(jié)堿的滲透，能保護凝膠免受堿的損害。重金屬化合物（如CuSO4、ZnSO4、PbO）經(jīng)常會被加入到腌漬液中去調控堿的滲透。然而，添加金屬化合物會在皮蛋中引入大量的這種金屬元素，特別是在皮蛋清中。由于PbO 對人類的嚴重危害，已禁止其在皮蛋生產(chǎn)中使用[23]。目前使用最多的腌制皮蛋的重金屬化合物是CuSO4和ZnSO4[24]。金屬化合物已被證實在皮蛋加工過程中具有“堵孔”的調節(jié)作用，其具體作用機制是金屬化合物逐漸與蛋白降解產(chǎn)生的H2S 反應形成金屬硫化物沉淀顆粒，形成的沉淀顆粒會黏附在蛋殼上，堵塞皮蛋蛋殼上的微孔或加工過程中的堿腐蝕孔，從而動態(tài)調節(jié)堿的滲入[5]。雖然已經(jīng)有很多皮蛋相關的研究，但仍然缺乏對不同的金屬元素在腌制過程中對堿液的調控，以及“堵孔”具體過程的系統(tǒng)綜述，這對于無重金屬皮蛋加工技術的開發(fā)具有重要意義。Tan 等[3]研究了腌制液的堿度，結果發(fā)現(xiàn)腌制液的堿度先迅速下降再緩慢下降。在開始階段，大量的NaOH 通過蛋殼的孔隙滲透到皮蛋中，導致腌制液的堿度迅速下降。隨著腌漬的進行，由于“堵孔”效應阻止了堿的滲透，導致腌制液的堿度緩慢下降。而長時間浸泡在堿中會對蛋殼和蛋殼膜產(chǎn)生一定的腐蝕作用，形成“腐蝕孔”[25]?！岸氯住焙汀案g孔”共同作用調節(jié)堿液的滲透。在“腐蝕孔”形成初期，硫化物沉積速率大于腐蝕速率，腌漬液堿度下降速率減小。隨著腌漬時間的增加，沉積速率和腐蝕速率達到動態(tài)平衡，腌漬液堿度的下降速率基本不變。隨著腌漬時間進一步增加，堿度顯著降低，可能是由于連續(xù)浸泡導致腐蝕速率高于堵塞速率，導致腐蝕孔數(shù)量和孔徑增加。由CuSO4制備的腌漬溶液的堿性略高于由CuSO4/ZnSO4制備的，表明Zn 的存在可能使堵塞效率降低。一方面由于鋅鹽形成的沉淀物容易溶解在堿溶液中，另一方面是由于Zn 和NH3形成了可溶且不穩(wěn)定的絡合離子[Zn（NH3）4]2+。進入皮蛋內部的腌制液，首先會引起皮蛋清pH 的急劇升高，而隨著腌制的進行，pH 顯著降低，主要由于“堵孔”效應引起的腌制液滲透到蛋清的速率小于蛋清滲透到蛋黃中的速率。隨著腌制的進行，堿度變化不明顯，可能由于從腌制液進入蛋清的堿液和從蛋清進入蛋黃的堿液達到了動態(tài)平衡。隨后，金屬離子產(chǎn)生的不溶性化合物“堵孔”速率增加，從腌制液進入蛋清的堿液小于從蛋清進入蛋黃的堿液[4]，這時蛋清pH再次降低。隨著腌制的進行，蛋清和蛋黃中的堿濃度達到動態(tài)平衡，而少量的堿仍能從腌制溶液中滲透到蛋清中，導致蛋清不斷脫水，蛋清pH 再次升高。

綜上所述，金屬離子可以動態(tài)調控堿液的滲透，通過“堵孔”和“腐蝕孔”以及滲透壓差來調節(jié)堿液的滲透。

2.3 腌制過程中皮蛋殼上孔隙堵塞物質的成分分析

人們普遍認為，在腌制液中加入金屬化合物的目的是“堵孔”，防止堿液破壞凝膠[4,26]。為了探索皮蛋中孔隙堵塞物質的具體成分，并闡明金屬化合物的作用機制，Tan 等[3]通過人工合成模擬了皮蛋腌制過程中蛋殼表面斑點的形成（圖2A）。簡而言之，把鴨蛋一端開孔，倒出蛋清和蛋黃并加入CH3CSNH2、NaOH 和甘油混合溶液，90 ℃水浴1 min，然后將其放入含金屬化合物的腌制液中。該實驗利用反應方程 式：CH3CSNH2+3OH-?CH3COO-+NH3+H2O+S2-來模擬皮蛋中含硫氨基酸降解產(chǎn)生的H2S。結果發(fā)現(xiàn)，皮蛋殼內未添加CH3CSNH2的蛋殼表面沒有明顯斑點，而含有CH3CSNH2的蛋殼表面均出現(xiàn)明顯的黑點，并逐漸增加。這表明黑點的形成和S2-相關。使用SEM 觀察到新鮮蛋殼表面有許多分布不均勻的氣孔（圖2A），這些孔是腌制液滲透的通道，也是鴨蛋內外物質運輸和交換的通道[27]。蛋殼的橫截面圖顯示，新鮮鴨蛋殼側面有明顯開放的氣孔通道（如箭頭所示）。而CuSO4和CuSO4/ZnSO4腌制的皮蛋蛋殼和模擬皮蛋蛋殼的氣孔中或多或少可見沉積物（圖2A）。為了確定蛋殼上黑點的主要成分，Tan 等[3]使用XPS 分析了黑點中的元素組成。結果發(fā)現(xiàn)新鮮蛋殼主要含有C、N、O 和Ca。CuSO4腌制的皮蛋蛋殼以及模擬皮蛋蛋殼斑點中主要元素為C、N、O、Ca、Cu、S 等以及少量的P 和Zn。蛋殼非黑點的Cu 和S 含量低于黑斑區(qū)，表明蛋殼上的黑點與Cu 和S 有關。由于CuSO4/ZnSO4腌制液中含有CuSO4和ZnSO4，在CuSO4/ZnSO4腌制的皮蛋蛋殼和模型皮蛋蛋殼上的黑點中不僅發(fā)現(xiàn)了與CuSO4腌制的含有類似的元素外，還發(fā)現(xiàn)含有的Zn 主要以Zn2+的形式存在，S 主要以S2-形式存在。綜上所述，與之前的假設類似，蛋殼上形成的黑點主要是金屬硫化物。

圖2 金屬化合物對皮蛋加工過程中的動態(tài)調控[3]Fig.2 Dynamic regulation of metal compounds in Pidan processing[3]

2.4 金屬化合物對蛋清凝膠的動態(tài)調控

金屬離子對皮蛋凝膠的形成具有重要作用，Deng 等[16]研究了不同金屬離子與皮蛋清蛋白凝膠的結合，如圖2B 所示。結果發(fā)現(xiàn)，低濃度的Ca2+、Zn2+、Fe3+可以促進蛋清凝膠形成有序的微觀結構，并能提高皮蛋清的凝膠強度，但在高濃度下，它們起到了相反的作用。用K+腌制的皮蛋（與Ca2+、Zn2+、Fe3+相比）具有更高的凝膠強度和保水能力，和更致密的微觀結構。此外，低濃度的Cu2+可以通過改變蛋白質的二級結構來促進蛋白質分子之間的交聯(lián)，而高濃度的Cu2+會通過消耗巰基來抑制蛋白質凝膠的形成[15]。在腌制的初始階段，低濃度的Cu2+會促進強堿的滲透，從而加速皮蛋的形成?；谏鲜鲅芯浚梢酝茰y，低濃度的金屬離子可以通過促進蛋白質聚合物的形成來促進皮蛋的形成，這對于皮蛋的成熟至關重要。

3 腌制過程中皮蛋顏色的形成機制

成熟的皮蛋清是黃褐色或棕色凝膠，而皮蛋黃是黑綠色或黃色凝膠，在蛋白質凝膠化過程中，蛋清和蛋黃開始變色。皮蛋的顏色形成極其復雜，受許多因素的影響，如溫度、pH 和時間[8]。

3.1 皮蛋清顏色的形成機制

關于皮蛋清顏色的形成機制研究，Zhao 等[4]使用全自動白度儀檢測了皮蛋清的顏色，分別使用L*表示亮度、a*表示紅色/綠色和b*表示黃色/藍色。結果發(fā)現(xiàn)腌制初期，蛋白質在堿的作用下變性并降解為小分子量蛋白質、肽和氨基酸導致L*顯著降低，隨后蛋清蛋白發(fā)生交聯(lián)聚合形成棕色半透明的凝膠。蛋清顏色的a*值和b*值先增加，后略有下降，顏色逐漸從白色變?yōu)樽厣?。其顏色的形成機制見圖3A。由于蛋白質被堿分解，產(chǎn)生H2S 和NH3，與腌制液中的金屬化合物和一些具有較大氧化還原活性的蛋白質復合物反應，可以形成各種色素物質，導致皮蛋清凝膠顯示為暗棕色[4]。分別使用三種不同金屬離子進行腌制皮蛋時發(fā)現(xiàn)，CuSO4腌制的皮蛋清的L*值顯著高于用CuSO4/ZnSO4和PbO 腌制的皮蛋。單獨使用CuSO4腌制的皮蛋清的a*和b*值顯著高于其他兩組。這表明金屬化合物與蛋白質、肽或氨基酸的復合反應可能形成不同的金屬離子復合物，從而導致皮蛋清顏色出現(xiàn)差異。除此外，皮蛋清中的還原糖與氨基酸、肽或蛋白質的游離氨基相互作用，通過糖基化或糖化可將糖共價連接到氨基酸或者蛋白質的氨基形成糖化蛋白，經(jīng)美拉德反應獲得多種中間產(chǎn)物，最終形成棕色物質，皮蛋的老化過程有利于棕色的形成[27-28]。Tan 等[7]在研究中也表明皮蛋清L*值的降低和顏色的形成是由于美拉德反應。Ganesan等[28]將儲存老化過程中的皮蛋放置在不同濃度的葡萄糖溶液中，結果發(fā)現(xiàn)與未浸泡葡萄糖的皮蛋比，浸泡葡萄糖的皮蛋游離氨基酸含量降低，還原糖含量增加，主要由于葡萄糖的滲透以及在堿性環(huán)境下游離氨基與還原糖發(fā)生了美拉德反應，最后導致蛋清褐變增加[28]。在貯藏期間用葡萄糖處理的皮蛋清中，b*和a*值較高，這很可能是由于黃色或棕色色素的形成。a*值的增加可能是由于棕色色素的形成，這可能來自蛋清的美拉德反應[28]，這與皮蛋清的褐變增加一致。因此，葡萄糖在蛋清顏色的形成過程具有至關重要的作用。Wang 等[9]使用UPLC-EIS-MS/MS 檢測到皮蛋蛋清中53 個糖基化蛋白上的142 個位點，而在鴨蛋清中只檢測到2 個糖基化蛋白上的9 個位點，并表明皮蛋在堿性條件下更容易發(fā)生糖基化。紅茶色素以及在高pH 條件下紅茶中黃酮醇易發(fā)生氧化褐變這也有助于皮蛋清顏色的形成[29-30]。除此外，水分含量的降低也會使褐色加深，有利于皮蛋清顏色的形成[31-32]。

圖3 皮蛋顏色形成機制Fig.3 Formation mechanism of Pidan color

3.2 皮蛋黃顏色的形成機制

皮蛋黃成分比較復雜，目前對皮蛋黃顏色形成的機理研究較少。Wang 等[33]表明皮蛋黃深綠色是由于硫化鐵的形成，卵黃高磷蛋白中的Fe3+被蛋白降解產(chǎn)生的S2-還原成Fe2+，同時S2-與Fe2+結合形成FeS，這使皮蛋黃呈現(xiàn)深綠色。當皮蛋切成兩半時，出現(xiàn)四個不同的顏色層，既有深色也有淺色。從外部到內部，第一層是深色，第二層是淺色，第三層是最暗的，第四層是最淺的。深色和淺色是由于不同層中的鐵含量不同，鐵含量越高，顏色越深。梁慶祥等[34]認為蛋黃在堿性環(huán)境下降解產(chǎn)生的兩種富含二硫醚（-S-S）和巰基（-SH）的氨基酸（胱氨酸和半胱氨酸）與蛋黃中的金屬離子結合會產(chǎn)生特殊的顏色，如黑色的硫化鐵。除此外，在強堿和H2S 存在的存在下，蛋黃色素的混合物會變成綠色。李樹青等[35]認為堿不穩(wěn)定的蛋黃蛋白質會在堿性條件下降解產(chǎn)生胱氨酸，與游離的胱氨酸一起分解產(chǎn)生S2-和NH3。S2-與蛋黃內氧化還原性大的鐵-卵黃高磷蛋白絡合體反應，使Fe3+還原為Fe2+。過多的S2-與Fe2+結合，生成FeS，使蛋黃呈綠色復合物。此外，蛋黃本身也含有顏色，這些綠色復合物與蛋黃的顏色一起賦予了蛋黃獨特的顏色[6]。

基于先前的研究，圖3 中顯示了皮蛋清和皮蛋黃顏色的形成機制。無論是皮蛋清還是皮蛋黃，蛋白質在其顏色形成中都具有重要作用。然而，由于蛋白質的復雜性，在皮蛋顏色形成過程中仍有許多問題需要研究。與蛋清相比，蛋黃的組成更加復雜，很難確定哪些物質起主要作用。同時，顏色形成過程中的美拉德反應過程較為復雜且難以控制。因此目前對皮蛋顏色的形成機制研究較少，尤其是對皮蛋黃顏色形成機制的研究。未來，可以構造腌制模型，研究純蛋白與還原糖或金屬離子在強堿作用下的反應，以及紅茶成分對皮蛋清和皮蛋黃顏色形成的影響，以此來探索皮蛋顏色的形成機制。

4 皮蛋風味的形成機制

風味是食品的主要屬性，也是食品的重要研究領域，對食品風味的研究可開發(fā)出更好的產(chǎn)品以滿足人們的需求。食品中的風味物質主要由非揮發(fā)性物質和揮發(fā)性物質構成[36]。目前對皮蛋的風味研究中，主要是對揮發(fā)性物質的研究[37]。趙燕等[38]采用GCMS 鑒定出皮蛋清中含有26 種風味物質，新鮮鴨蛋蛋清中含有27 種風味物質，共同含有的風味物質為17 種。與新鮮鴨蛋清相比，皮蛋清含有較多的酯類，且大多是短鏈脂肪酸酯，它們都具有獨特的水果風味。在皮蛋清中含有三種醛類物質，短鏈醛具有脂香和清香，高分子量的醛具有橘子皮的清香味。在皮蛋清中還含有少量酮，其是雜環(huán)化合物形成的中間體，在雜環(huán)化合物的形成中具有重要作用，其通過影響雜環(huán)化合物的形成影響皮蛋的風味。除此外，皮蛋清中還含有少量的醇類、含硫化合物以及胺類化合物，均具有特殊的風味，對皮蛋清氣味的形成具有重要作用。使用類似的方法，鄧文輝等[39]鑒定出皮蛋黃中含有74 種揮發(fā)性物質，而新鮮禽蛋黃中含有71 種，共有物質26 種，兩種蛋黃中脂肪含量均最高。脂肪氧化能促進皮蛋風味形成。皮蛋黃中還含有許多具有特殊風味的酯類、短鏈脂肪酸、不飽和長鏈脂肪酸、苯甲醛、苯乙醛以及一些高分子量的醛類等。除此外，皮蛋黃中還含有一些酮類有助于風味物質形成以及含有具有獨特清香氣味的醇類、含硫化物和含氮化合物。皮蛋腌制前后風味發(fā)生了巨大的變化，而腌制后的皮蛋清和皮蛋黃的風味也各不相同。這可能由于皮蛋黃中含有較多的脂質，其是食品中風味物質形成的重要前體[19]，因此皮蛋黃中的揮發(fā)性風味物質比皮蛋清中更多。Zhang 等[36]通過頂空固相微萃取法、溶劑輔助風味蒸發(fā)法等方法，鑒定出皮蛋黃中含有53 種氣味活性化合物，結合芳香提取物稀釋分析法，進一步確定了皮蛋蛋黃中對整體香氣起主要作用的物質是1-辛烯-3-酮、己醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、（E）-2-壬醛、（E,E）-2,4-癸二烯醛和（E,Z）-2,6-壬二烯醛[39]。總之，皮蛋中的風味物質主要來源于脂質氧化和蛋白質降解的雜環(huán)化合物（含氮、氧和硫）和揮發(fā)性物質（含羰基）。

目前皮蛋風味形成機制主要可以理解為，禽蛋中大量的蛋白質、脂肪和少量的糖類[6,40]，在強堿作用下分別降解或氧化形成短肽、氨基酸、還原糖以及一系列烴類、醇類、醛類、酯類等，如圖4 所示。Gao等[41]使用納米-HPLC-MS/MS 鑒定出皮蛋黃中含有5 種鮮味肽。氨基酸和脂肪酸不僅可以作為揮發(fā)性風味物質和揮發(fā)性風味物質的前體物質影響風味物質的形成，而且氨基酸和脂肪酸之間以及它們反應所形成的中間產(chǎn)物之間也可以發(fā)生一系列反應生成揮發(fā)性風味物質從而影響皮蛋風味的形成。關于氨基酸除了本身具有獨特的風味（酸、甜、苦、咸、鮮），彼此間可以相互協(xié)同共同促進食品風味的形成，還可以作為風味前體物質，通過脫氨、轉氨、脫羧、與還原糖發(fā)生美拉德反應，與油脂發(fā)生交互作用以及發(fā)生Strecker 降解產(chǎn)生一系列風味物質[42]。與氨基酸相比，游離氨基酸更容易發(fā)生Strecker 降解或與其他物質發(fā)生美拉德反應生成揮發(fā)性物質。氨基酸可以和還原糖發(fā)生美拉德反應形成醛、酮、內酯、呋喃、噻吩等揮發(fā)性物質。一些支鏈氨基酸會在反應中產(chǎn)生具有奶酪香味的α-酮酸，進一步會降解為具有特殊風味的醇、醛和羧酸類物質。一些芳香族氨基酸轉化的風味物質一般具有花香味、苦杏仁味以及一些化學物味、腐臭味等風味。

圖4 皮蛋風味形成機制Fig.4 Formation mechanism of Pidan flavor

與氨基酸作用類似，脂肪酸也可以直接作為呈味物質和揮發(fā)性風味物質的前體物影響皮蛋風味的形成。皮蛋腌制過程中脂肪會被水解產(chǎn)生游離脂肪酸，由于其不穩(wěn)定更容易被氧化或被酶/微生物利用產(chǎn)生大量揮發(fā)性化合物如醇、醛、酮、羧酸等。尤其是具有不飽鍵的游離脂肪酸更容易被氧化，這些不飽和的游離脂肪酸是形成風味物質的主要前體物質，如亞油酸、花生四烯酸等。其在發(fā)生氧化時會產(chǎn)生許多具有特殊風味的不含支鏈的醛，而且很不穩(wěn)定，容易被酶或微生物代謝生成的酶類氧化或還原產(chǎn)生揮發(fā)性風味物質的另外兩個重要成分——酸或醇。脂肪酸在氧化過程中除了可以生成風味物質外，其氧化產(chǎn)物還可以與美拉德反應中的中間體反應產(chǎn)生含有取代基的雜環(huán)化合物，如吡嗪、噻吩等具有獨特的風味的物質。氨基酸和脂肪酸除了可以單獨影響皮蛋風味外，還可以通過美拉德反應相互作用影響皮蛋的風味。主要是氨基酸上的氨基與脂肪酸轉化得到的羰基化合物上的羰基發(fā)生反應。美拉德反應過程較為復雜，形成的產(chǎn)物中大部分具有獨特的風味，還有一些可以進一步反應生成具有獨特風味的物質。如乙二醛、丙酮醛和甘油醛等，容易自身發(fā)生縮合反應，或與其它化合物反應。美拉德反應終產(chǎn)物中主要是含氧、氮和硫的雜環(huán)化合物，如呋喃、吡咯、吡嗪等。這些風味物質的風味特征與參加美拉德反應的氨基酸、脂肪酸和還原糖的種類密切相關。

目前對于皮蛋風味的形成機制研究還相對較少，皮蛋中特有的揮發(fā)性成分和非揮發(fā)性物質仍不清楚，關鍵反應機制尚未完全分析。這限制了對皮蛋風味的調控和研發(fā)。今后，研究者可以通過控制風味前體來模擬風味成分的反應，并將結果與原始的皮蛋風味成分進行比較，最終選擇具有特征風味的成分，為皮蛋風味控制提供理論依據(jù)。

5 皮蛋松花的形成機制

皮蛋成熟后會形成具有松枝狀的松花，這有利于皮蛋感官品質的提高。松花大多分布在皮蛋清凝膠的淺表層，少數(shù)分布在蛋清凝膠和蛋黃凝膠之間。馬力等[43]發(fā)現(xiàn)松花的紅外光譜與MgOH 完全一致，因此認為MgOH 是構成松花晶體的主要成分。隨后，Tung 等[44]采用SEM 結合能量散射光譜分析儀發(fā)現(xiàn)松花由鉀、鎂、鈉等的磷酸鹽組成。松花晶體中鎂離子占40.3%，還含有少量的磷酸鉀、磷酸鎂和磷酸鈉[6]。皮蛋中的鎂離子會促進松花的形成，其含量與松花的形成呈正相關。據(jù)報道，蛋殼主要由碳酸鈣、碳酸鎂、磷酸鈣和磷酸鎂組成，在腌制過程中，皮蛋黃和蛋殼中的鎂離子會逐漸轉移到皮蛋清中，導致皮蛋清中的鎂含量顯著增加。在強堿作用下皮蛋清中大量的鎂離子會在皮蛋清表面形成氫氧化鎂水合物，氫氧化鎂水合物與少量其他物質形成美麗的松花圖案，如圖5 所示。目前，松花是人工直接采集的，這會破壞松花的結構和性能，而影響實驗結果。因此，今后的研究中，可以通過改變采集松花的方法來保持松花的完整性，以便于收集松花。此外，對于提高皮蛋的感官質量，可以通過在腌制液中加入適量的鎂離子來調節(jié)松花的形成。

圖5 皮蛋松花的形成機制Fig.5 Formation mechanism of Pidan Songhua

6 結論

為了推進皮蛋的發(fā)展，人們對其進行了大量的研究，主要包括皮蛋生產(chǎn)工藝的優(yōu)化改進，皮蛋凝膠的形成機理，以及皮蛋或皮蛋提取物的功能活性。然而，盡管皮蛋已被廣泛研究，但目前關于加工過程中皮蛋的具體形成機制及腌制液對皮蛋形成的影響的機制研究仍然極其薄弱，仍需進一步研究。在皮蛋凝膠形成機制中，對于皮蛋清凝膠，可以通過簡化腌制系統(tǒng)來研究單個蛋白質，并且可以使用分子對接技術來研究蛋白質與蛋白質、水、金屬離子或堿性溶液之間的相互作用。在皮蛋黃凝膠的研究中，應考慮脂質在皮蛋黃凝膠形成中的作用。可以通過激光共聚焦技術研究皮蛋黃凝膠形成過程中蛋白質和脂質的遷移以及凝膠形成機制。在皮蛋顏色形成的研究中，可以簡化皮蛋的成分，通過控制其他成分，改變其中一個成分來研究其在皮蛋顏色形成中的作用?？梢越柚肿訉雍头肿觿恿W模擬蛋白質與還原糖或金屬離子的反應過程。在皮蛋風味的研究中，可以通過添加或減少蛋白質、脂質和多糖的前體物質來模擬關鍵風味成分的反應，最終識別出特征揮發(fā)性和非揮發(fā)性物質，為皮蛋風味的控制提供理論依據(jù)。在皮蛋松花的研究中，可以從液化皮蛋中收集完整的松花，來研究其具體成分。