李國萍，李家鋒，朱海燕,

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學茶學教育部重點實驗室，湖南長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學園藝學院，湖南長沙 410128）

盈江縣野生茶資源豐富，境內(nèi)具有飲用價值的野生茶屬云南大理種。目前，共發(fā)現(xiàn)了12 個具有代表性的野生茶樹居群，涵蓋面積12.695 萬畝，有野生茶樹39.35 萬株左右，是德宏州內(nèi)野生茶樹分布面積最大的縣市[1-2]。近年來，隨著茶行業(yè)的蓬勃發(fā)展，云南省的大理茶種也迎來了良好的發(fā)展前景，盈江縣野生茶優(yōu)越的環(huán)境和優(yōu)良的品質(zhì)得到了市場的認可，當?shù)匾吧挪铇滟Y源的合理開發(fā)利用已成為當務之急。

茶葉香氣物質(zhì)的差異及成茶品類的香型與茶樹品種密切相關(guān)[3]。艾安濤等[4]分析了3 個品種加工制作成的遵義紅茶，研究認為金牡丹制成的“遵義紅”品質(zhì)最佳；湯海昆等[5]分析了10 個不同茶樹品種曬紅茶的香氣成分，為曬紅茶篩選適制茶樹品種提供了理論依據(jù)；徐夢婷等[6]對5 個茶樹品種的工夫紅茶揮發(fā)性成分進行分析，并篩選出了關(guān)鍵呈香物質(zhì)；李金龍等[7]研究了斯里蘭卡紅碎茶與滇紅碎茶香氣成分及含量，探明了兩地紅碎茶差異的主要香氣成分；林燕萍等[8]的研究結(jié)果表明，以梅占品種所制的紅茶香氣呈甜花香，梅占白茶香氣呈清花香。諸多研究皆表明：茶樹品種影響茶葉香氣[9]，香氣研究對品種的適制篩選和開發(fā)利用具有重要意義。但當前鮮有針對大理茶種揮發(fā)性化合物及有關(guān)大理茶種芽孢茶揮發(fā)性化合物的研究。

本研究以盈江縣大理茶種代表性樣品（芽孢紅茶和芽孢白茶），以云南省鳳慶大葉種代表性樣品（鳳慶紅茶和鳳慶白茶）為對照，采用全自動HS-SPMEGC-MS 分析各茶樣的揮發(fā)性成分，結(jié)合感官審評方法對茶樣沖泡后的香氣進行描述分析，采用PCA、OPLS-DA 和OAV 比較分析樣品的香氣成分差異和主要香氣貢獻物質(zhì)，為盈江大理茶種芽孢茶揮發(fā)性代謝物的進一步研究和該地野生古茶樹的資源開發(fā)和利用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

以云南省盈江縣勐弄鄉(xiāng)龍門寨野生茶居群的，大理茶種野生古茶樹為供試組材料，以云南省鳳慶縣鳳慶大葉種為對照進行實驗；氯化鈉 中國國藥集團；正己烷（純度＞95%）德國Merck 公司；3-己酮（純度＞95%）美國密蘇里州西格瑪-奧爾德里奇公司。

8890-7000D GC-MS、DB-5MS 色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、120 μm DVB/CWR/ PDMS 萃取頭 Agilent Technologies Inc；MM400 球磨儀Retsch；MS105DU 電子天平 Mettler Toledo；SPME Arrow 固相微萃取裝置、Fiber Conditioning Station 老化裝置、Agitator 樣品加熱箱 CTC Analytics AG。

1.2 實驗方法

1.2.1 茶樣制備 取大理茶種野生古茶樹的芽頭，分別制作成代表性樣品芽孢紅茶（以下簡稱芽孢紅，YBH）和芽孢白茶（以下簡稱芽孢白，YBB）；以近似緯度（北緯24°）鳳慶大葉種制成的紅茶（以下簡稱鳳慶紅，F(xiàn)QH）和白茶（以下簡稱鳳慶白，F(xiàn)QB）為對照，樣品均于2023 年3 月按單芽標準進行采摘制作。實驗茶樣見圖1。對茶樣進行液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 感官審評方法 按照GB/T 23776-2018《茶葉感官審評方法》和GB/T 14487《茶葉感官審評術(shù)語》，由湖南農(nóng)業(yè)大學6 名經(jīng)驗豐富的評茶員采用密碼審評的方式進行感官審評并評分。

1.2.3 樣品前處理 從-80 ℃冰箱中取出樣品進行液氮研磨，渦旋混合均勻，每個樣本稱取約500 mg（液體1 mL）于頂空瓶中，分別加入飽和氯化鈉溶液，10 μL（50 μg/mL）內(nèi)標溶液，全自動頂空固相微萃取HS-SPME 對樣本進行萃取，以供GC-MS 分析。每個樣品重復測定3 次[10]。在分析過程中，每10 個檢測分析樣本中插入一個質(zhì)控樣本，以監(jiān)測分析過程的重復性。

1.2.4 HS-SPME 萃取 HS-SPME 萃取條件：在60 ℃恒溫條件下，震蕩5 min，120 μm DVB/CWR/PDMS萃取頭插入樣品頂空瓶，頂空萃取15 min，于250 ℃下解析5 min，然后進行GC-MS 分離鑒定。采樣前萃取頭在Fiber Conditioning Station 中250 ℃下老化5 min[11]。

1.2.5 GC-MS 分析方法 色譜條件：DB-5MS 毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent J&W Scientific，F(xiàn)olsom，CA，USA），載氣為高純氦氣（純度不小于99.999%），恒流流速1.2 mL/min，進樣口溫度250 ℃，不分流進樣，溶劑延遲3.5 min。程序升溫：40 ℃保持3.5 min，以10 ℃/min 升至100 ℃，再以7 ℃/min 升至180 ℃，最后以25 ℃/min 升至280 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源（EI），離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，質(zhì)譜接口溫度280 ℃，電子能量70 eV，掃描方式為選擇離子檢測模式（SIM），定性定量離子精準掃描[12]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以MassHunter 軟件處理質(zhì)譜分析后的下機原始數(shù)據(jù)，用于定性定量分析。通過邁維（武漢）生物技術(shù)有限公司自建數(shù)據(jù)庫和公共數(shù)據(jù)庫對代謝物進行鑒定。包含確定的RT 以及定性定量離子進行選擇離子檢測模式進行精準掃描，每種化合物分別選擇1 個定量離子，2～3 個定性離子。每組所有需要檢測的離子按照出峰順序，分時段分別檢測，如果檢出的保留時間與標準參考相一致，并且在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中，所選擇的離子均出現(xiàn)，判定為該物質(zhì)[13]。采用內(nèi)標法（內(nèi)標為3-己酮（10 μL，50 μg/mL））對其進行相對定量，選擇定量離子進行積分和校正工作，增強定量的準確性。氣味活度值（OAV）指某香氣物質(zhì)成分的質(zhì)量濃度與其氣味閾值的比值，計算公式為[14-15]：

式中：C 為香氣成分的質(zhì)量濃度，μg/kg；OT 為該香氣成分的氣味閾值，μg/kg。

OAV＞1，則某揮發(fā)性成分對整體香氣有一定影響，OAV 數(shù)值與其對整體香氣的貢獻呈正比。

用Excel Office 2019、IBM SPSS Statistics 26（IBM，美國）進行數(shù)據(jù)處理。以峰面積歸一法對4 個茶樣YBH、FQH、YBB、FQB 的揮發(fā)性代謝物進行比較分析。對鑒定的揮發(fā)性代謝物進行多元統(tǒng)計分析以初步探析4 個茶樣的揮發(fā)性代謝物特征，以R軟件（https://www.r-project.org/）對鑒定的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物進行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）。根據(jù)正交偏最小二乘法判別分析模型（OPLS-DA）獲得的變量重要性投影（Variable importance in projection，VIP）評分，將VIP＞1，差異倍數(shù)（Fold change，F(xiàn)C）值大于等于2 或小于等于0.5 的揮發(fā)性代謝物定義為差異代謝物（Significant changed metabolites，SCMs）。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官品質(zhì)特征分析

盈江大理茶種芽孢茶和鳳慶大葉種的審評結(jié)果（表1）表明：大理茶種芽孢茶制成的紅茶、白茶綜合評分均高于對照組鳳慶大葉種。兩個品種的紅茶對比中，YBH 的香氣和滋味評分明顯高于FQH，YBH以果蜜香和花草香為主，滋味甜醇帶果香，F(xiàn)QH 香氣以甜花香為主，滋味醇厚，但二者在外形上的得分差異最小。兩個品種的白茶對比中，YBB 的香氣和滋味評分也高于FQB，YBB 香氣主要為自然清花香，滋味鮮甜帶花香，F(xiàn)QB 香氣則主要為毫香，滋味鮮淡帶毫香，但二者在外形項得分差異最小?？偟膩碚f，大理茶種芽茶的各項評分均高于90，且單項評分和綜合評分均高于對照樣鳳慶大葉種芽茶，說明芽孢茶具有較優(yōu)的感官品質(zhì)特征。在4 個茶樣中，YBH 的香氣馥郁，獲得香氣最高評分，明顯優(yōu)于對照品種FQH，可見芽孢茶的獨特香氣值得進一步研究。

表1 4 個茶樣感官審評結(jié)果Table 1 Sensory evaluation results of four tea samples

2.2 盈江大理茶種和鳳慶大葉種揮發(fā)性香氣成分組成分析

通過廣泛靶向代謝組學分析4 個茶樣，共檢測出616 種揮發(fā)性化合物，如表2 所示，4 個茶樣的醇類揮發(fā)性化合物含量均較高。在本研究中，YBH 的萜類揮發(fā)性代謝物相對含量顯著（P＜0.05）高于其他三個對比茶樣，與對照樣FQH 的差異性最大，綜合呈現(xiàn)出“木質(zhì)香”和“藥草香”；在芳烴和醛類揮發(fā)性代謝物的對比上FQH 的相對含量較YBH 高，綜合呈現(xiàn)火工香、清香、花香。YBB 呈花香、甜香的醇類和酮類揮發(fā)性代謝物含量高于對照茶樣；FQB 與YBB 在雜環(huán)類化合物相對含量上的差異最大，主要呈花香[16-17]。

表2 4 個茶樣的揮發(fā)性代謝化合物數(shù)量和相對含量Table 2 Quantity and relative content of volatile metabolic compounds in four tea samples

2.3 盈江大理茶種和鳳慶大葉種差異香氣物質(zhì)分析

2.3.1 盈江大理茶種和鳳慶大葉種揮發(fā)性化合物的PCA 和OPLS-DA 分析 本研究結(jié)合單變量統(tǒng)計分析（差異倍數(shù)，F(xiàn)C）、多變量統(tǒng)計分析（PCA、OPLSDA）和氣味活度值（OAV）評估的方法，探究各茶樣揮發(fā)性代謝物的差異。PCA 是一種用于無監(jiān)督模式識別的多維統(tǒng)計分析方法。本研究的PCA 得分圖（圖2）顯示，兩個主成分（PC1 和PC2）貢獻率分別為47.05%和34.35%，4 個茶樣分離趨勢明顯，說明以盈江大理茶種制成的紅茶和白茶與近似緯度鳳慶大葉種制成的紅茶和白茶的香氣組成存在較大差異。

圖2 4 個茶樣香氣化合物PCA 分析Fig.2 PCA analysis of four tea aroma compounds

為進一步探討盈江大理茶種和鳳慶大葉種的差異香氣成分，通過有監(jiān)督模式識別的多變量統(tǒng)計分析方法—OPLS-DA 模型（生物學重復≥3）得到變量重要性投影（VIP）。OPLS-DA 評價模型的預測參數(shù)中，R2X 和R2Y 分別表示所建模型對X 和Y 矩陣的解釋率，Q2表示模型的預測能力，這三個指標越接近于1 時表示模型越穩(wěn)定可靠。OPLS-DA 評分圖（圖3A）顯示，4 個茶樣的香氣物質(zhì)存在顯著（P＜0.05）差異（圖3B），在聚類熱圖上也明顯分為4 組（圖3 C），由圖3D 可知，Q2為0.995，R2X 為0.809，R2Y 為0.998，P＜0.05，說明模型可靠，可根據(jù)VIP 值分析篩選不同樣品之間的揮發(fā)性差異代謝物。

圖3 4 個茶樣的OPLS-DA 分析及揮發(fā)性代謝物聚類熱圖Fig.3 OPLS-DA analysis and volatile metabolite clustering heat map of four tea samples

2.3.2 芽孢紅茶與鳳慶紅茶特征差異化合物分析在YBH 與FQH 的對照中，基于OPLS-DA 判別模型，結(jié)合變量重要性投影VIP＞1、FC≥2 或≤0.5 且P＜0.05 的條件篩選到86 種（49 個上調(diào)，37 個下調(diào)）差異揮發(fā)性代謝物，整理為表3。

表3 FQH vs YBH 主要特征差異代謝物統(tǒng)計Table 3 Metabolite statistics of FQH vs YBH main characteristic differences

與FQH 相比，8 種主要特征差異物質(zhì)僅存在于YBH。分別為5 種萜類物質(zhì)（R）-β-希馬赫勒烯、順式-α-甜沒藥烯、α-衣蘭油烯、古巴烯、α-柏木烯，強烈果香的酯類物質(zhì)（E）-2-甲基-2-丁烯酸苯甲酯，以及醇類物質(zhì)順-2-異丙烯基-1-甲基環(huán)丁基乙醇，和醛類物質(zhì)4-（1-甲基乙烯基）-1-環(huán)己烯-1-甲醛，主要貢獻了清新偏木質(zhì)香草和甜香的香氣特征，推測是形成YBH 花草偏木質(zhì)甜果香氣的貢獻揮發(fā)性化合物。此外，YBH 的揮發(fā)性代謝物胡椒酮1-氧化物、（Z）-癸-2-烯醛、乙酸芳樟酯、3-甲氧基-苯甲醛、姜烯、α-松油醇等物質(zhì)的相對含量顯著高于FQH，綜合呈現(xiàn)出強烈的花果香和香草香。

2.3.3 芽孢白茶與鳳慶白茶特征差異化合物分析在YBB 與FQB 的對照中，基于OPLS-DA 判別模型，結(jié)合變量重要性投影VIP＞1、FC≥2 或≤0.5 且P＜0.05 的條件篩選到89 種（上調(diào)31 種，下調(diào)58 種）主要特征差異揮發(fā)性代謝物，整理為表4。

表4 FQB vs YBB 主要特征差異代謝物統(tǒng)計Table 4 Metabolite statistics of FQB vs YBB main characteristic differences

根據(jù)表4 可知，與FQB 相比，3 種主要特征差異揮發(fā)性化合物，即醇類物質(zhì)3-甲氧基芐醇、呈花香的萜類物質(zhì)α-紫羅蘭酮和呈清香的醛類物質(zhì)（E）-2-己烯醛僅存在于YBB 中。與FQB 相比，YBB 呈清花香的胡椒酮1-氧化物、（Z）-癸-2-烯醛、己酸、乙酸芳樟酯、水楊酸甲酯（薄荷）、檸檬醛等物質(zhì)相對含量較高，綜合香氣呈現(xiàn)與YBB 的感官審評結(jié)果相符。

2.3.4 盈江大理茶種和鳳慶大葉種主要特征差異代謝物的OAV 分析 在一定范圍內(nèi)，總體氣味的呈現(xiàn)與組分的OAV 值呈正比[26]。計算4 個茶樣的主要特征差異揮發(fā)性化合物的OAV，共發(fā)現(xiàn)10 種對香氣呈現(xiàn)存在貢獻（OAV＞1）的主要特征差異物質(zhì)（表5），分為萜類、醛類、酯類和醇類物質(zhì)。盈江縣大理茶種芽孢茶中，（Z）-癸-2-烯醛和香葉醇的OAV 值較鳳慶大葉種茶高，主要呈甜花香，其中（Z）-癸-2-烯醛的OAV 高于100，認為是大理茶種芽孢茶的關(guān)鍵香氣成分；鳳慶大葉種中的苯甲醛、苯乙醛和β-紫羅蘭酮OAV 值較芽孢茶高，主要呈蜜香和花果香[27]，其中，β-紫羅蘭酮的OAV 大于10，說明其對鳳慶大葉種的香氣呈現(xiàn)有重要作用[16]。在紅茶對比組中，YBH 的（Z）-癸-2-烯醛、大馬士酮以及香葉醇OAV 值較FQH 高，這些物質(zhì)主要貢獻了強烈的花香和果香，其中大馬士酮僅在YBH 存在貢獻（OAV＞1），推測是YBH 產(chǎn)生濃郁花香的關(guān)鍵物質(zhì)；在白茶對比組中，YBB 的（Z）-癸-2-烯醛、己酸、水楊酸甲酯、乙酸芳樟酯、香葉醇和2-苯乙醇的OAV 值較FQB 高，綜合呈清香和花香，其中己酸和乙酸芳樟酯的OAV 值大于10，可認為此二者對茶葉整體的氣味貢獻極大，可能是YBB 呈自然清花香的主要物質(zhì)。

表5 4 個茶樣OAV＞1 的揮發(fā)性物質(zhì)Table 5 Volatile substances with OAV＞1 in four tea samples

3 討論與結(jié)論

茶葉中芳香物質(zhì)的組成與濃度影響成茶香型。本研究在4 個茶樣中共鑒定出616 種揮發(fā)性化合物，YBH、FQH、YBB 和FQB 的揮發(fā)性代謝物相對含量分別以萜類、醛類、醇類和雜環(huán)化合物的占比最高。通過對兩個云南品種進行香氣差異分析，發(fā)現(xiàn)紅茶對比組中以萜類、酯類和醛類物質(zhì)居多，（E）-2-甲基-2-丁烯酸苯甲酯、α-衣蘭油烯、α-柏木烯、古巴烯和4-（1-甲基乙烯基）-1-環(huán)己烯-1-甲醛等呈香草和木質(zhì)香的物質(zhì)，對YBH 花果香和木質(zhì)香草氣可能存在重要貢獻。在兩個云南品種的白茶對比組中，特征差異化合物主要為醛類、萜類、醇類物質(zhì)，與張曉珊等[31]對云南白茶的香氣成分研究結(jié)果相近，呈花果香的α-紫羅蘭酮，呈清香（E）-2-己烯醛，或為形成YBB 獨特香氣的關(guān)鍵物質(zhì)。此外，揮發(fā)性化合物胡椒酮1-氧化物，在芽孢茶中的相對含量均高于對照鳳慶大葉種，推測其作用于芽孢茶特殊香氣的形成。

在4 個茶樣的主要特征差異化合物中篩選出10 個OAV＞1 的關(guān)鍵香氣物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)（Z）-癸-2-烯醛和香葉醇對芽孢茶的香氣貢獻較大，β-紫羅蘭酮對鳳慶大葉種的香氣貢獻較大，與湯海昆等[5]對云南不同品種紅茶香氣成分的研究相近。大馬士酮于1970年首次在保加利亞玫瑰油中發(fā)現(xiàn)，是類胡蘿卜素降解產(chǎn)物中常見的芳香化合物[32]，推測具有強烈花果香氣[33]的大馬士酮為YBH 花果香的貢獻物質(zhì)；己酸（清花香）和乙酸芳樟酯（甜的木質(zhì)清新果香）可能為YBB 呈“自然清花香”的重要貢獻香氣物質(zhì)。此外，呈花蜜香的2-苯乙醇僅在YBB 的香氣中存在一定的貢獻，對YBH 的香氣不產(chǎn)生主要貢獻。

本研究發(fā)現(xiàn)大理茶種芽孢茶較鳳慶大葉種芽茶的香氣成分更為豐富，且芽孢茶制成紅茶香氣更佳，后續(xù)可增加不同產(chǎn)地、不同季節(jié)以及不同加工工藝的芽孢茶鮮葉及成品茶的橫向?qū)Ρ妊芯?，結(jié)合GCO 技術(shù)、電子鼻、香氣的重組和缺失實驗等研究方法，探究不同地區(qū)大理茶種芽孢茶的香氣組成，進一步確定形成芽孢茶香氣的重要物質(zhì)，從而為大理茶種的香氣組成研究和大理茶種野生古樹茶的適制性和資源開發(fā)提供參考。