陳麗瀾，王明芳，單宇晴，倪永清

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子 832003）

植物乳植桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，是典型的“游牧”生活物種，被普遍認(rèn)為是安全的物種[1]，能夠適應(yīng)廣泛的環(huán)境[2]，存在于發(fā)酵食品、植物體表、動(dòng)物胃腸道、土壤等環(huán)境中[3]。植物乳植桿菌的基因組較大，這就決定了其有很強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)性和代謝上的靈活性，在某種程度上，植物乳植桿菌在自然界中能夠廣泛分布與它能夠發(fā)酵多種糖有關(guān)[4]。此外，植物乳植桿菌普遍具有較強(qiáng)的抑菌能力，主要通過(guò)產(chǎn)生有機(jī)酸或細(xì)菌素來(lái)實(shí)現(xiàn)，其抑菌活性效果受到菌株來(lái)源和被抑制微生物類別的影響。在耐酸耐膽鹽上也表現(xiàn)出了較強(qiáng)的耐受性。這些特征使其成為益生菌產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的一個(gè)重要選擇。

在實(shí)際應(yīng)用中，植物乳植桿菌是一種高度多樣化和多用途的菌種?？捎糜诟鞣N食品和保健品，它們有特定的代謝和工藝特性，在發(fā)酵活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[5]，在食品工業(yè)上既可作為自發(fā)發(fā)展的發(fā)酵微生物群落的一部分，也可作為純發(fā)酵劑，用來(lái)改善產(chǎn)品風(fēng)味[6]，還可應(yīng)用于食品保鮮，延長(zhǎng)保質(zhì)期，減少甚至取代化學(xué)添加劑[7]。植物乳植桿菌作為乳酸產(chǎn)率最高的乳酸菌之一，產(chǎn)酸使環(huán)境pH 降低，一些導(dǎo)致食物腐敗和食物中毒的微生物在低pH 條件下生長(zhǎng)會(huì)受到抑制（pH＜4）[8]，因此可作為天然防腐劑添加到許多發(fā)酵食品中。此外，其產(chǎn)生的細(xì)菌素被認(rèn)為是一種天然、安全、有效的抗食源性病原體和腐敗細(xì)菌的物質(zhì)[9]。植物乳植桿菌還可通過(guò)保護(hù)腸道形態(tài)和通透性以及緊密連接蛋白的表達(dá)來(lái)改善腸道屏障的功能，從而預(yù)防腹瀉[10]，與其它益生菌聯(lián)合使用可顯著減輕腸易激綜合癥癥狀[11]，可以顯著改善急性膀胱炎[12]、預(yù)防結(jié)腸癌[13]、改善認(rèn)知障礙[14]、促進(jìn)皮膚傷口和燒傷感染的愈合[15]。

迄今為止，植物乳植桿菌作為人類胃腸道中潛在的促進(jìn)健康微生物，是應(yīng)用最多的菌種之一[16]，從理論上講，在適應(yīng)人類宿主的腸道方面，從人類消化道分離出來(lái)的原生菌株比其它來(lái)源的菌株具有先天優(yōu)勢(shì)。此外，根據(jù)WHO 的規(guī)定，只有從人類消化道中分離出來(lái)的微生物才被推薦作為益生菌使用?，F(xiàn)在用于開(kāi)發(fā)的植物乳植桿菌大多是從發(fā)酵食品或植物基材料中分離出來(lái)的。鑒于植物乳植桿菌在食品領(lǐng)域和作為生物治療制劑的醫(yī)藥領(lǐng)域擁有巨大應(yīng)用潛力，開(kāi)發(fā)新的有潛力、適合于區(qū)域性人群的益生菌很有必要。因此，本研究收集了我國(guó)新疆伊寧維吾爾族和哈薩克族兒童的糞便樣品，從中分離出了植物乳植桿菌，分析了菌株的遺傳多樣性與體外益生特性。為進(jìn)一步研究植物乳植桿菌菌株與區(qū)域宿主人群的健康關(guān)系、開(kāi)發(fā)本土化的益生菌奠定了前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

18 份維吾爾族和哈薩克族健康兒童糞便樣品采集自新疆維吾爾自治區(qū)伊寧縣，提前聯(lián)系志愿者，簽訂知情同意書(shū)。糞便采集前三個(gè)月內(nèi)，兒童均未使用過(guò)抗生素，無(wú)益生菌攝入，無(wú)胃腸道疾病。采樣時(shí)，取樣人員配戴無(wú)菌手套，用取樣勺采集糞便約5～10 g，糞便采集后立即放入已滅菌的取樣管，貼標(biāo)簽后置于車載冰箱-10 ℃冷藏，快速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌種分離；致病菌分別為Escherichia coliEPCC O127:K3 CICC（10411）、Escherichia coliEHEC O157:H7 CICC（21530）、Escherichia coliETEC O8:K0 CICC（10421）、Salmonella entericasubsp.enterica serovar TyphimwiumCICC（10420）中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；Listeria monocytogenesCGMCC 1.9136、Salmonella entericasubsp.entericaCGMCC 1.10754 中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心；改良MRS（de Man，Rogosa，Sharpe）培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基、蛋白胨酵母浸膏葡萄糖（Peptone yeast extract glucose，PYG）培養(yǎng)基、胰胨大豆瓊脂（Trypcasein soy agar，TSA）培養(yǎng)基、蘋果果膠（Pectin，70%）北京博奧拓達(dá)科技有限公司；碳源：水蘇糖（Stachyose tetrahydrate，85%）、低聚果糖（FOS）、低聚木糖（XOS，95%）、低聚半乳糖（GOS）、低聚異麥芽糖（IMO，90%）、大豆低聚糖（Soybean oligosaccharide）、D-棉子糖五水物（Raffinose）、麥芽糊精（Maltodextrin）、D-海藻糖無(wú)水（D-（+）-Trehalose dihydrate）、抗性淀粉（Resistant starch，70%）

上海源葉生物科技有限公司；菊粉（Inulin，70%）上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司。

DG520 厭氧培養(yǎng)箱 英國(guó)DS 公司；TC-512 PCR儀 英國(guó)Techne 公司；PoerPac Universal 水平電泳儀、Gel DOC XR 凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad 公司；GR60DA 高壓蒸汽滅菌鍋 致微儀器有限公司；5810R 高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 植物乳植桿菌的分離鑒定 將l g 新鮮糞便用9 mL 無(wú)菌生理鹽水梯度稀釋，選擇合適梯度涂布于改良MRS 固體培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，每個(gè)樣品選取30 個(gè)菌落，連續(xù)劃線純化直至鏡檢結(jié)果為純桿。菌株DNA 的提取依據(jù)苯酚-氯仿-玻璃珠擊打的方法進(jìn)行[17]。

提取好的DNA 進(jìn)行g(shù)roEL基因擴(kuò)增[18]：gro-EL-F 5’-GCYGGTGCWAACCCNGTTGG-3’；groEL5’-RAANGTNCCVCGVATCTTGTT-3’，擴(kuò)增體系：Premix Taq：12.5 μL，DNA 模板：3 μL，引物（20 μmol/L）：各0.5 μL，ddH2O：8.5 μL。擴(kuò)增條件：預(yù)變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 30 s，退火52 ℃ 40 s，延伸72 ℃ 40 s，終延伸72 ℃ 5 min，30 個(gè)循環(huán)。經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后得到大約500 bp 左右的清晰單一條帶。擴(kuò)增產(chǎn)物送至江蘇金唯智生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交至GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列同源性比對(duì)（BLAST），比對(duì)相似值大于99%初步確定菌種種屬。

采用通用引物Eric：Eric1 5’-GGGGTACCTTG CGACTAACAAATATGCT-3’；Eric2 5’-TGCTCTAG ACTTATTCCCTACCATCATG-3’對(duì)植物乳植桿菌DNA 進(jìn)行rep-PCR 擴(kuò)增分析，擴(kuò)增體系：Premix Taq（2x）：12.5 μL，DNA 模板：3 μL，引物（20 μmol/L）：各0.5 μL，ddH2O：8.5 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃5 min，變性95 ℃ 20 s，退火51.2 ℃ 30s，延伸72 ℃5 min 30 s，終延伸72 ℃ 10 min，35 個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀拍照并記錄結(jié)果。根據(jù)指紋圖譜結(jié)果，去除重復(fù)條帶，挑選出代表菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 體外益生特性實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 耐酸能力測(cè)定 用鹽酸將改良MRS 培養(yǎng)基pH 調(diào)至2.5[19]，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻備用?；罨蟮木喊?%接種，37 ℃厭氧培養(yǎng)，分別于0、2、4 h 取樣，用無(wú)菌生理鹽水稀釋至合適梯度，涂布于固體改良MRS 培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h 后計(jì)數(shù)。

式中：At為2、4 h 測(cè)得的活菌數(shù)；A0為0 h 測(cè)得的活菌數(shù)。

1.2.2.2 耐膽鹽能力測(cè)定 在MRS 培養(yǎng)基中加入牛膽鹽，配制膽鹽濃度3 g/L 的MRS 培養(yǎng)基[20]。將活化后的菌株按2%的接種量接種，37 ℃厭氧培養(yǎng)，于0、2、4 h 取樣，用滅菌的生理鹽水稀釋至合適梯度，涂布于固體MRS 培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。

式中：At為2、4 h 測(cè)得的活菌數(shù)；A0為 0 h 測(cè)得的活菌數(shù)。

1.2.2.3 自聚集能力測(cè)定 活化后的菌株培養(yǎng)液8000 r/min，4 ℃離心10 min，用pH7.2 的磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）清洗2 次，重新懸浮于PBS 中，調(diào)整菌懸液OD600為0.5，記為A0，取2 mL 菌懸液渦旋振蕩20 s，室溫下靜置2 h 后在600 nm 處測(cè)定吸光度值（取200 μL 上清液測(cè)定），記為At[21]。重復(fù)進(jìn)行3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，取平均值。

1.2.2.4 表面疏水性測(cè)定 活化后的菌株培養(yǎng)液8000 r/min，4 ℃離心10 min，用pH7.2 的PBS 緩沖液清洗2 次，重新懸浮于PBS 中，調(diào)整菌懸液OD600為0.5，記為A0，取2 mL 菌懸液加入2 mL 二甲苯，渦旋振蕩2 min，室溫靜置1 h。在600 nm 處測(cè)定水相吸光度值（取200 μL 測(cè)定），記為At[21]。重復(fù)進(jìn)行3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，取平均值。

1.2.2.5 抑菌能力測(cè)定 實(shí)驗(yàn)采用牛津杯法[22]，以6 種致病菌為指示菌，測(cè)定植物乳植桿菌代謝產(chǎn)物的抑菌性。活化后的菌株培養(yǎng)液8000 r/min 離心10 min，收集上清液，用0.22 μm 濾膜過(guò)濾除菌，制備無(wú)細(xì)胞上清液。將指示菌按照106CFU/mL 濃度涂布于相應(yīng)的固體培養(yǎng)基，制備指示菌平板。用鑷子將無(wú)菌牛津杯豎于涂布有致病菌液的平皿中，牛津杯中加入200 μL 無(wú)細(xì)胞上清液，設(shè)置三個(gè)平行。將平皿置于4 ℃擴(kuò)散4 h 后，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)肉汁（菌株10420、10421、21530、10411）；PYG 培養(yǎng)基（菌株1.9136）；TSA 培養(yǎng)基（菌株1.10754）。

1.2.2.6 抗生素耐藥實(shí)驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法（K-B法）[23]，藥敏片信息見(jiàn)表1，將活化后的菌液經(jīng)合適梯度稀釋后（菌液濃度約為107CFU/mL），均勻地涂布于改良MRS 平板上，用無(wú)菌鑷子將藥敏紙片放置其上，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑大小。重復(fù)進(jìn)行3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，取平均值。按表2 標(biāo)準(zhǔn)劃分菌株對(duì)藥物的敏感性。

表1 藥敏片信息Table 1 Information of drugs sensitive tablets

表2 菌株對(duì)抗生素敏感性標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Standard of antibiotic sensitivity of strains

1.2.2.7 碳源利用能力測(cè)定 配制不含葡萄糖的改良MRS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（mMRS），以20 g/L 的不同碳源替換葡萄糖。將活化后的菌株8000 r/min，4 ℃離心5 min，棄上清液，用無(wú)菌生理鹽水將菌體洗滌2 次后，重懸于1 mL 生理鹽水中。以1%的接種量將菌懸液接種到含有不同碳源的改良MRS 液體培養(yǎng)基中，以葡萄糖為陽(yáng)性對(duì)照，不添加碳源為陰性對(duì)照，測(cè)定0 h 的OD600吸光度值為OD1，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，測(cè)定OD600吸光度值為OD2，最終OD600=OD1-OD2。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

菌株指紋圖譜使用GelCompar II v6.0 軟件進(jìn)行聚類分析；采用MEGA v7.0 軟件基于groEL基因測(cè)序序列對(duì)菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建；耐酸、耐膽鹽、自聚集、疏水性結(jié)果取平均值后用Origin 2023作條形圖；碳源利用能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值后用TBtools 作熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳植桿菌的遺傳差異分析

經(jīng)groEL基因測(cè)序鑒定為植物乳植桿菌的菌株，經(jīng)rep-PCR 去重后得到20 株代表菌株，代表菌株信息見(jiàn)表3。圖1 指紋圖譜聚類結(jié)果顯示將20 株植物乳植桿菌劃分為3 個(gè)大類，A 中分離自哈薩克族學(xué)齡兒童的菌株全部聚集在一起，分離自維吾爾族的菌株聚集在另一分支，B 中全是分離自維吾爾族學(xué)齡兒童的菌株，C 中則混雜著不同來(lái)源的菌株，但是同一個(gè)小的分支上都是來(lái)源相同的菌株。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖2 可看出，YLW2L-89-22、YLW2L-66-30、YLW2L-57-4、YLW2L-61-7 和YLW2L-26-10 聚集在同一進(jìn)化分支，這一分支的菌株全都來(lái)自維吾爾族學(xué)齡兒童；YLW2L-108-29、YLW1L-49-6、YLW1L-49-3 和標(biāo)準(zhǔn)菌株L.plantarumATCC 14917 聚集在同一進(jìn)化分支上，這3 株菌株都來(lái)自維吾爾族。剩下的8 株來(lái)自哈薩克族和4 株維吾爾族的菌株聚集在同一進(jìn)化分支上。與植物乳植桿菌親緣關(guān)系較近的Lactiplantibacillus pentosus和Lactiplantibacillus paraplantarum的模式菌株單獨(dú)在另一分支。在同一分支上的菌株親緣關(guān)系更近，從發(fā)育樹(shù)上可看出相同民族來(lái)源的菌株更傾向于聚集在一起。

圖1 指紋圖譜聚類分析Fig.1 Fingerprint map clustering analysis

圖2 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree

表3 實(shí)驗(yàn)菌株信息Table 3 Information of experimental strains

2.2 耐酸耐膽鹽分析

圖3 中菌株在pH2.5 的改良MRS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h 后，存活率在4.42%～212.33%，4 h 后存活率在4.85%～181.69%，說(shuō)明某些菌株在pH2.5 時(shí)仍可繼續(xù)生長(zhǎng)。YLW2L-96-6、YLW2L-108-29、YLW2L-61-7、YLW1L-44-7 這4 株菌株2 h 后的存活率超過(guò)100%，4 h 后YLW2L-108-29、YLW2L-61-7、YLW1L-44-7 這3 株菌株存活率超過(guò)100%。圖4菌株在含有0.3%膽鹽的改良MRS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h 后，存活率在0.10%～19.81%，4 h 后存活率在0.05%～19.52%，存活率較低，平板計(jì)數(shù)結(jié)果顯示菌落數(shù)在104～105CFU/mL。2 和4 h 時(shí)存活率最高的菌株都是YLW1L-49-3，分別為19.81%、19.52%。

圖3 20 株植物乳植桿菌在pH2.5 的MRS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 和4 h 時(shí)的存活率Fig.3 Survival rate of 20 L.plantarum strains cultured in MRS medium with pH2.5 for 2 and 4 h

圖4 20 株植物乳植桿菌在含有0.3%膽鹽濃度的MRS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 和4 h 時(shí)的存活率Fig.4 Survival rate of 20 L.plantarum strains cultured in MRS medium containing 0.3% bile salt concentration for 2 and 4 h

2.3 自聚集能力和疏水性分析

通過(guò)測(cè)定細(xì)菌自聚集和表面疏水性來(lái)間接反映其黏附能力，細(xì)菌表面疏水性越大，則黏附能力越強(qiáng)[24]，但是黏附能力與自聚集能力的關(guān)系在菌株間存在差異性[25-26]。高黏附性有助于菌株定殖腸道，可以通過(guò)自聚集能力和表面疏水性作為高黏附能力植物乳植桿菌的參考指標(biāo)。圖5 中植物乳植桿菌的疏水性在10.21%～86.01%，較高的是YLW2L-61-7、YLW2L-57-4、YLW2L-66-30 這3 株菌，疏水性都超過(guò)了80%。自聚集能力在5.61%～28.16%，最高的是YLW2L-57-4。

圖5 20 株植物乳植桿菌的疏水性和自聚集能力Fig.5 Hydrophobicity and self-aggregation of 20 strains of L.plantarum

2.4 抑菌能力分析

15 株菌株對(duì)6 種致病菌都有抑菌效果，表4 中所有菌株對(duì)Listeria monocytogenesCGMCC 1.9136都有抑菌效果，但是抑菌圈直徑總體較?。豢傮w來(lái)看，對(duì)Salmonella entericasubsp.enterica serovar Typhimwium、Listeria monocytogenes和Escherichia coliEPCC O127:K63 的抑菌效果較差，對(duì)Escherichia coliEHEC O157:H7 和Escherichia coliETEC O78:K80的抑菌效果較好。除了YLW2L-108-29、YLW2L-26-10、YLW1L-49-3、YLW1L-44-7、YLH2L-93-17這5 株菌株，其余植物乳植桿菌對(duì)6 種致病菌都有抑菌圈。

表4 20 株植物乳植桿菌對(duì)6 種致病菌的抑菌圈效果Table 4 Inhibition zone effect of 20 strains of L.plantarum on 6 pathogenic bacteria

2.5 抗生素耐藥分析

表5 中20 株植物乳植桿菌對(duì)慶大霉素耐藥，對(duì)米洛環(huán)素、氯霉素和氨芐西林敏感，YLW2L-96-6、YLH2L-92-30、YLH1L-8-18 這3 株菌對(duì)3 種抗生素耐藥，YLW2L-26-10、YLW2L-66-30、YLW2L-57-4、YLW1L-49-6 這4 株菌株對(duì)5 種抗生素耐藥，除上述7 株菌外，其余菌株對(duì)4 種抗生素耐藥。

表5 20 株植物乳植桿菌對(duì)12 種抗生素的敏感性Table 5 Sensitivity of 20 strains of L.plantarum to 12 kinds of antibiotics

2.6 碳源利用能力分析

根據(jù)圖6 結(jié)果可知，植物乳植桿菌YLW1L-44-7、YLW2L-26-10、YLH1L-10-30、YLH1L-8-18、YLH1L-1-4、YLW2L-61-7、YLH1L-10-28 這7 株菌株在低聚木糖中生長(zhǎng)24 h 后的OD600高于0.100，其余菌株OD600在0.100 以下；在抗性淀粉中生長(zhǎng)較差，菌株YLW1L-44-7 的OD600最高，為0.570；在菊糖中培養(yǎng)24 h 后的OD600值在0.369～1.474，菌株YLW2L-106-12 和YLH2L-94-27（OD600分別為1.474和1.245）生長(zhǎng)最好，其余菌株OD600低于0.610；在水蘇糖中培養(yǎng)24 h 后的OD600值在0.559～1.199，YLH1L-10-30 和YLH1L-10-28 生長(zhǎng)得最好，OD600值分別為1.025 和1.199；在低聚果糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖、麥芽糊精、棉子糖、D-海藻糖、果膠和大豆低聚糖中生長(zhǎng)良好，其中在果膠中OD600值在0.900 以上，其余碳源中OD600值均在1.000 以上。

圖6 20 株植物乳植桿菌在不同碳源中的生長(zhǎng)情況熱圖Fig.6 Heat map of the growth of 20 L.plantarum strains in different carbon sources

3 討論與結(jié)論

對(duì)于人類來(lái)說(shuō)，益生菌已與人體健康緊密相連，許多商業(yè)食品都聲稱添加了對(duì)人體健康有益的益生菌，并且以此作為宣傳賣點(diǎn)。益生菌（Probiotics）、益生元（Prebiotics）、合生元（Synbiotics）[27]和后生元（Postbioticis）[28]的概念已被廣泛定義，為益生功能食品的開(kāi)發(fā)帶來(lái)標(biāo)準(zhǔn)。現(xiàn)在植物乳植桿菌與其它益生菌一起廣泛用于工業(yè)發(fā)酵食品生產(chǎn)。

本文中相同民族來(lái)源的植物乳植桿菌在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上更傾向于聚集在同一分支，電泳圖聚類結(jié)果中同一小分支上是相同來(lái)源的菌株，這說(shuō)明同一生境中的植物乳植桿菌其遺傳特征更為相似。即使是同種細(xì)菌，它們的表型特征也存在很大差異，研究不同來(lái)源的同種細(xì)菌有利于篩選出擁有符合不同條件的菌株，在開(kāi)發(fā)益生菌產(chǎn)品上有更多的選擇。

pH 和高濃度膽鹽是影響菌株生長(zhǎng)的重要因素。因此，菌株必須有較強(qiáng)的耐酸耐膽鹽能力才能在腸道中發(fā)揮其益生功能。本文中菌株的耐酸能力較強(qiáng)，耐膽鹽能力則較差，菌株在4 h 時(shí)存活率基本在10%以下，但在2 和4 h 時(shí)存活率相差不大，推測(cè)菌株可能會(huì)在該膽鹽濃度下維持現(xiàn)有的存活率較長(zhǎng)一段時(shí)間，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可做進(jìn)一步驗(yàn)證。Arena 等[7]的研究中植物乳植桿菌對(duì)Listeria monocytogenes和Escherichia coliO157:H7 表現(xiàn)出抑制作用，抑菌作用主要是產(chǎn)生的有機(jī)酸類物質(zhì)造成；植物乳植桿菌YM-5-2 產(chǎn)生的有機(jī)酸類物質(zhì)對(duì)食源性致病菌埃希氏菌，腸沙門氏菌腸亞種鼠傷寒血清型、單核增生李斯特菌有抑制作用[29]，與本文研究結(jié)果相似。植物乳植桿菌對(duì)氨基糖苷類、糖肽類和氟喹諾酮類抗生素耐藥，對(duì)四環(huán)素類、利福霉類抗生素敏感[30]，與本文結(jié)果相似。此外，植物乳植桿菌對(duì)絕大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類抗生素敏感[31]，在本研究中對(duì)氨芐西林敏感，對(duì)苯唑西林則表現(xiàn)為耐藥和中度敏感。乳桿菌對(duì)大多數(shù)核酸抑制劑，左氧氟沙星，氨基糖苷類抗生素，鏈霉素[32]、卡那霉素、慶大霉素等具有耐藥性[33]。不同的是本文中植物乳植桿菌對(duì)鏈霉素表現(xiàn)出了不同程度的敏感性。這可能與地區(qū)，微生物所處環(huán)境有關(guān)。本文中的植物乳植桿菌對(duì)大多數(shù)碳源利用能力較強(qiáng)，在低聚糖上生長(zhǎng)良好，也能在多糖菊粉和抗性淀粉上生長(zhǎng)，但是幾乎不能利用低聚木糖，有研究認(rèn)為編碼能降解低聚木糖的基因僅存在于乳酸菌特定的成員中[34]，并不包括植物乳植桿菌。

綜上，本研究是從新疆伊寧18 份兒童糞便樣品中分離出的分離株中，挑選出經(jīng)groEL基因擴(kuò)增測(cè)序鑒定為植物乳植桿菌的菌株，采用rep-PCR 指紋圖譜擴(kuò)增選出代表菌株進(jìn)行體外益生特性實(shí)驗(yàn)，通過(guò)對(duì)比耐酸、耐膽鹽、自聚集、疏水性、抑菌、抗生素敏感性以及碳源利用的性能，菌株YLW2L-61-7 可作為潛在益生菌菌株開(kāi)展下一步的體內(nèi)益生特性研究，為開(kāi)發(fā)適合當(dāng)?shù)厝巳旱囊嫔a(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，耐膽鹽實(shí)驗(yàn)可將菌株培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，檢測(cè)其是否能在0.3%膽鹽濃度的MRS 中維持現(xiàn)有存活率，本文中的自聚集與疏水性的測(cè)定是為了篩選出具有良好黏附能力的菌株，該方法簡(jiǎn)單快速，可用于初篩符合要求的菌株，同時(shí)也存在缺陷，后續(xù)黏附實(shí)驗(yàn)可做細(xì)胞黏附，還可增加抑菌物質(zhì)的確定實(shí)驗(yàn)。