童 凡，黃家琪，黃仕新，王 靈，陳小鳳，吳旭東，吳 鵬，唐 旭,*

（1.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306；2.自然資源部第三海洋研究所，福建廈門 361005）

硒（Se）是人體必需的微量元素之一，對人體健康、新陳代謝、免疫調(diào)節(jié)等多種生理活動至關(guān)重要[1]，具有抗衰老、增強(qiáng)免疫力、抗癌、解毒、排毒、增強(qiáng)生殖功能、預(yù)防心血管疾病[2]等功效；人體缺硒可引起某些重要器官的功能失調(diào)，引發(fā)大骨節(jié)病、克山病、心腦血管病、神經(jīng)退行性疾病等諸多疾病[3]。硒的平均推薦攝入量一般為男性60 mg/d，女性53 mg/d，而在許多地方，特別是在發(fā)展中國家，這一基本攝入量仍未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)[4]。

在自然界中，硒主要以無機(jī)態(tài)存在，毒性大，生物活性低，不易被人體吸收和利用。通過物理和化學(xué)手段將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)形式可以解決這一問題。然而，大多數(shù)物理和化學(xué)生產(chǎn)方法復(fù)雜且成本高，不利于大規(guī)模投入使用[5-6]。微生物合成硒是一種合成效果好、成本低的方法，同時微生物富集硒是新興硒工業(yè)中最有前途的技術(shù)之一，這種生物富集法以無機(jī)硒為原料，生產(chǎn)高營養(yǎng)、低毒性的有機(jī)硒，以滿足公眾特別是缺硒地區(qū)人群的營養(yǎng)需求。益生菌是富硒微生物研究領(lǐng)域的主要對象，包括富硒酵母[7]、富硒乳酸菌[8-9]和富硒雙歧桿菌[10]。富硒酵母的有機(jī)硒轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)、硒蛋白含量高，是研究最廣泛的富硒有益微生物。目前，富硒酵母的生產(chǎn)大部分是以釀酒酵母為微生物載體，在培養(yǎng)基中添加亞硒酸鈉[11]，國外報道的富硒酵母中硒含量高達(dá)1400 μg/g，國內(nèi)報道的富硒酵母含硒量在300～1200 μg/g[12]。國內(nèi)關(guān)于提高富硒酵母含硒量研究多集中于通過誘變育種以獲得高富硒量的酵母菌株，目前獲取不同來源微生物菌株受到更多人關(guān)注。

海洋環(huán)境因具有高鹽、變溫、高壓等條件被認(rèn)為是具特殊功能的微生物的良好來源，海洋微生物具有豐富的次生代謝產(chǎn)物，其中蘊(yùn)藏有結(jié)構(gòu)獨特、生物活性顯著的物質(zhì)。海洋環(huán)境的特殊性和海洋物種復(fù)雜的生態(tài)功能賦予了海洋微生物不同于陸地微生物的代謝途徑和適應(yīng)機(jī)制[13]。迄今為止，僅有少數(shù)海洋源富硒菌株的相關(guān)報道，Ashengroph 等[14]首次從里海沿岸分離鑒定一株新的海洋菌株Bacillus amyloliquefaciensSRB04，揭示其在好氧條件下將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化成有機(jī)硒的作用；Hamza 等[15]研究報道，分離自印度海水的Yarrowia lipolytica對亞硒酸鈉具有耐受性，這種以有機(jī)硒形式與脂溶性酵母結(jié)合的硒在改善水產(chǎn)動物健康方面有潛在的應(yīng)用價值。本研究旨在通過富硒培養(yǎng)的選育方法，從海洋樣品中分離篩選含硒量高的海洋酵母菌，并對其進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，為海洋源富硒酵母開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

篩選樣品 采集自海南省?？谑醒葚S鎮(zhèn)塔市東寨港國家級自然保護(hù)區(qū)紅樹林，用75%的酒精擦拭采樣工具后，采集水和表層土壤，后放置無菌袋4 ℃冷藏保存帶回實驗室；葡萄糖 分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉 分析純，生工生物工程（上海）股份有限公司；氯霉素、硒標(biāo)準(zhǔn)溶液、甘油 分析純，阿拉丁生化科技股份有限公司；API 20 C AUX 酵母鑒定試劑盒 法國梅里埃公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純；陳海水 30 g 海鹽定容于1 L 超純水，放置黑暗處一周后可用。

GR60DF 全自動立式高壓滅菌鍋 廈門致微儀器有限公司；BP-10 pH 計 德國Sartorius 有限公司；SW-CJ-IFD 超凈工作臺 蘇州凈化有限公司；MQT-60R 振蕩培養(yǎng)箱 上海旻泉儀器有限公司；XT5107 生化培養(yǎng)箱 寧波萊福科技有限公司；3K15 Sigma 臺式高速冷凍離心機(jī) 格瑪離心機(jī)有限公司；M5 多功能酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices 有限公司；DT208 消化爐 福斯分析儀器有限公司；DHG-9140A 電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DW-86L500 超低溫保存箱 上海析平科學(xué)儀器有限公司；Alpha 2-4 LD plus 真空冷凍干燥機(jī) 德國CHRIST 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 YPD 培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、蛋白胨20 g、酵母提取物10 g、氯霉素0.5 g、瓊脂18 g、陳海水1000 mL、pH6.0；篩選培養(yǎng)基：隨實驗所需濃度添加亞硒酸鈉至YPD 培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)基均在121 ℃下高溫滅菌20 min。

1.2.2 菌株的分離純化 于超凈工作臺內(nèi)，用滅菌藥匙取1.00 g 左右樣品加入10 mL 無菌水的離心管，渦旋振蕩混勻后得樣品原液，取1 mL 懸液用無菌水按1×10-1～1×10-5梯度稀釋，取樣品原液及梯度稀釋液各100 μL，用無菌涂布棒均勻涂布于YPD 培養(yǎng)皿中，26 ℃恒溫培養(yǎng)48～72 h，挑選疑似酵母形態(tài)的不同單菌落進(jìn)行連續(xù)劃線純化，并記錄菌落形態(tài)特征，純化后的菌株以斜面及甘油保藏形式于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及含量測定 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制主要參考前人的實驗方法[16]，略有改動。取6 個100 mL 的容量瓶，分別加入10 μg/mL 的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液0、2、4、6、8、10 mL 后加入純水定容至35 mL，再加入1 mL 5%乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）溶液，充分搖勻后分別調(diào)節(jié)pH 至2.5，加入4 mL 0.5%（5 g 的3,3'-二氨基聯(lián)苯胺溶于100 mL 1 mol/L 鹽酸）的3,3'-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液，搖勻后于暗處靜置30 min。將混合液體的pH 調(diào)節(jié)至7.0 并將其轉(zhuǎn)移至250 mL 分液漏斗中，加入10 mL甲苯并充分振蕩3 min，靜置分層，收集甲苯層過濾液，于420 nm 波長處測定吸光值（甲苯為參比零點）。以硒濃度為橫坐標(biāo)、OD420值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.005x+0.0009，擬合度R2=0.9993。在一定范圍內(nèi)，硒濃度和OD420值成正比，呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。

硒含量的測定主要參照前人實驗描述[16-17]，采用3,3'-二氨基聯(lián)苯胺分光光度法（略有改動），準(zhǔn)確稱取0.1 g 凍干菌粉置于消化瓶中，加入5 mL 混酸溶液（高氯酸與濃硝酸體積比為1:4），封口靜置過夜，冷消化后再進(jìn)行加熱消化，直至析出類似于白色晶體物質(zhì)時停止加熱，冷卻至室溫，加水定容至50 mL，同時設(shè)置空白對照。分別吸取定容后的溶液10 mL 于100 mL 容量瓶中，加水定容至35 mL，測定OD420值，即可得出相應(yīng)硒含量。

硒轉(zhuǎn)化率主要參考[18]計算公式如下：

1.2.4 富硒功能菌株篩選 采用耐硒法和紅硒法相結(jié)合的方式，篩選富硒功能菌株。耐硒法是基于微生物對無機(jī)硒的抗性與其對無機(jī)硒的生物轉(zhuǎn)化能力成正相關(guān)，紅硒法是基于微生物對硒的生物轉(zhuǎn)化能力與紅硒的形成呈負(fù)相關(guān)。

平板劃線：將分離純化得到的菌株分別劃線至含20 μg/mL 硒的篩選平板上，26 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。觀察菌株的生長情況和顏色變化，挑選出其中生長情況良好，顏色未變紅或微紅的菌株。

試管復(fù)篩：將初篩獲得的菌株分別接種至硒濃度為0、10、20、30、40、50 μg/mL 的篩選培養(yǎng)基的液體試管中，26 ℃、180 r/min 條件下?lián)u床培養(yǎng)48 h，觀察菌體的沉淀量及其顏色變化，對比篩選出富硒效果較好的菌株。

搖瓶驗證：將復(fù)篩確定的菌株接種至YPD 培養(yǎng)基于26 ℃、180 r/min 條件下?lián)u床培養(yǎng)復(fù)蘇24 h，可得酵母菌懸液。按5%接種量接種至含硒濃度為20 μg/mL 篩選培養(yǎng)基的錐形瓶中，于26 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，取一定量的發(fā)酵液離心（6000 r/min，10 min），棄上清，用蒸餾水洗滌沉淀，再離心，反復(fù)洗滌沉淀3 次后，置于超低溫保存箱過夜預(yù)凍，次日將沉淀真空冷干燥，得到的菌粉稱重即為富硒酵母生物量[19]。按1.2.3 方法測定菌株體內(nèi)硒含量。

1.2.5 菌株的鑒定

1.2.5.1 形態(tài)學(xué)鑒定 取斜面保存的菌種劃線于YPD 平板上，于26 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)。取YPD 平板上的單菌落進(jìn)行涂片、固定、碘液染色、水洗和干燥，于油鏡下（1000×）進(jìn)行鏡檢觀察，通過顯微鏡和掃描電鏡對菌株進(jìn)行顯微形態(tài)觀察。

1.2.5.2 生理生化鑒定 API 20 C AUX 酵母菌鑒定試劑盒（比色法）試條由20 個含有干燥底物的微量小管組成，能進(jìn)行19 個同化試驗（assimilation test）。小管內(nèi)含半固體微量培養(yǎng)基供接種，只有能以該底物作為單獨碳源的酵母菌才能生長。實驗結(jié)果是通過與對照生長物的比較而獲得，鑒定結(jié)果參照鑒定軟件或分析圖譜索引[20]。挑取平板保存的2～3 個菌落混合于API 20 C AUX 培養(yǎng)基中，制備渾濁度相當(dāng)于2 McFarland 的菌懸液，將此菌懸液依次加入API 20 C AUX 試劑條的孔中，底盤加入10 mL 無菌水使其保持濕潤的氣體環(huán)境，隨后將試劑條浮于水上，26 ℃培養(yǎng)48 h 觀察各糖類發(fā)酵情況，結(jié)果用APIplus 軟件分析發(fā)酵糖種類確定菌株的種屬。

1.2.5.3 26S rDNA 分子生物學(xué)鑒定 菌株接種于YPD 液體培養(yǎng)基，于26 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)24 h后，65 ℃水浴滅活30 min，滅活產(chǎn)物送至上海生工有限公司進(jìn)行測序，并將測序結(jié)果與GenBank 各標(biāo)準(zhǔn)菌株序列進(jìn)行BLAST 比對，采用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 菌株的安全特性 為檢驗富硒菌株自身安全性，將純化后的單菌落點接至含5%的綿羊血瓊脂平板，26 ℃培養(yǎng)48 h 后觀察平板上生長菌落的溶血情況。

1.2.7 富硒菌株發(fā)酵工藝優(yōu)化的單因素實驗 以硒轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)開展單因素實驗。取斜面保存的目標(biāo)菌株接種至YPD 培養(yǎng)基，于26 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)復(fù)蘇24 h，即得酵母菌懸液。

接種量對菌株富硒的影響：將活化后的菌懸液按1%、2%、3%、4%、5%、6%接種量接入初始pH為6 的含硒（20 μg/mL）培養(yǎng)基中，于26 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h。

初始pH 對菌株富硒的影響：用1 mol/L 鹽酸和1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)初始pH 為4、5、6、7、8、9 的含硒（20 μg/mL）篩選培養(yǎng)基，將活化后的菌懸液按最佳接種量接入上述培養(yǎng)基中，于26 ℃，180 r/min 搖床培養(yǎng)48 h。

發(fā)酵溫度對菌株富硒的影響：按確定的最優(yōu)接種量和初始pH，將活化后的菌懸液接入含硒（20 μg/mL）培養(yǎng)基中，分別于18、22、26、30、34、38 ℃條件下，180 r/min 搖床培養(yǎng)48 h。

發(fā)酵轉(zhuǎn)速對菌株富硒的影響：按確定的最優(yōu)接種量、初始pH 和發(fā)酵溫度，將活化后的菌懸液接入含硒（20 μg/mL）培養(yǎng)基中，分別于60、100、140、180、220、260 r/min 轉(zhuǎn)速條件下，搖床培養(yǎng)48 h。

發(fā)酵時間對菌株富硒的影響：按確定的最優(yōu)接種量、初始pH、發(fā)酵溫度，將活化后的菌懸液接入含硒（20 μg/mL）培養(yǎng)基中，于最優(yōu)發(fā)酵轉(zhuǎn)速下分別培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h。

硒添加量對菌株富硒的影響：按確定的最優(yōu)接種量、初始pH、發(fā)酵溫度、發(fā)酵轉(zhuǎn)速和發(fā)酵時間，配制含硒量為5、10、20、30、40、50 μg/mL 的篩選培養(yǎng)基，將活化后的菌懸液接入上述培養(yǎng)基。

以上培養(yǎng)基在搖床培養(yǎng)結(jié)束后，檢測菌株生物量、酵母硒含量和轉(zhuǎn)化率，考察單因素對酵母富硒的影響，每組實驗平行重復(fù)三次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文中所有實驗均設(shè)置三次重復(fù)，采用Excel 2013、GraphPad Prism 8.3.0、Origin 9.0 及MEGA 7.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與制圖，所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 富硒菌株的篩選結(jié)果

按1.2.4 方法從樣品中篩選出11 株生長情況較好且顏色未變紅或微紅的菌株，分別命名為HN-01、HN-02、HN-03、HN-04、HN-05、HN-06、HN-07、HN-08、HN-09、HN-10 和XY-01。

初篩獲得11 株菌的液體試管結(jié)果如表1 和表2 所示。由表1 可知在富硒發(fā)酵液中，菌株HN-01、HN-02、HN-03、HN-04、HN-06、HN-07、HN-09 和HN-10 菌體沉淀量較多，說明菌株生物量也較高，這些菌株能夠在一定硒濃度的環(huán)境中生長；而菌株HN-05 和XY-01 的生物量遠(yuǎn)低于其他菌株，說明菌株對硒的耐受性質(zhì)或轉(zhuǎn)化能力較弱。由表2 可知不同菌株在富硒發(fā)酵液中的顏色比較，菌株HN-01、HN-02、HN-05、HN-06、HN-07、HN-08、HN-09 和HN-10 的菌體顏色為白色或微紅色，特別是HN-10 在硒濃度為20 μg/mL 時菌體仍為白色，說明其對硒的轉(zhuǎn)化效果較好。因此，綜合菌株的生長情況及顏色比較，挑選出HN-01、HN-02、HN-06、HN-07 和HN-10 這5 株菌進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，驗證其富硒能力。

表1 不同菌株在富硒培養(yǎng)液中的菌體沉淀量Table 1 Amount of strains precipitated by different strains in selenium-rich medium

表2 不同菌株在富硒培養(yǎng)液中的顏色比較Table 2 Color comparison of different strains in selenium-rich medium

復(fù)篩結(jié)果如圖1 所示。菌株HN-10 的生物量為4.11 g/L，遠(yuǎn)低于菌株HN-01、HN-02、HN-06和HN-07，但其菌體富硒量最高，達(dá)1.38 mg/g，硒轉(zhuǎn)化率為28.20%，說明菌株HN-10 的富硒效果較佳。與此相反，菌株HN-02 的生物量最高可達(dá)6.03g/L，而富硒量較低，只有0.79 mg/g，硒轉(zhuǎn)化率只有23.77%，說明菌株HN-02 雖對硒具有一定耐受能力，但其富集效果不佳。因此，綜合考慮菌株的富硒量和轉(zhuǎn)化率[4]，選擇菌株HN-10 作為目標(biāo)菌株進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖1 不同菌株的富硒能力Fig.1 Selenium enrichment capacity of different strains

2.2 菌株的鑒定分析

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 酵母細(xì)胞形態(tài)以橢圓形、球形最為常見，沒有真菌絲，無性繁殖方式為出芽生殖[21]。如圖2 所示，菌株HN-10 在YPD 平板上培養(yǎng)后，菌落呈乳白色、圓形、有突起、不透明、表面光滑、邊緣齊整，直徑為3～5 mm。如圖3A 所示，菌株染色后的菌體形態(tài)，呈橢圓狀，出芽繁殖。如圖3B顯示掃描電鏡結(jié)果，菌體為直徑為2～7 μm，形狀近似球體。因此初步推測菌株HN-10 為酵母菌。

圖2 菌株HN-10 的菌落形態(tài)圖（1000×）Fig.2 Colony morphology of strain HN-10 (1000×)

圖3 菌株HN-10 的菌體形態(tài)（A）和掃描電鏡圖（B）Fig.3 Morphology (A) and SEM (B) of strain HN-10

2.2.2 生理生化鑒定結(jié)果 按1.2.5.2 鑒定方法對菌株HN-10 進(jìn)行糖類發(fā)酵鑒定。結(jié)果如表3 所示。將19 種糖類發(fā)酵結(jié)果在API Plus 庫中進(jìn)行歸納分析，鑒定HN-10 為發(fā)酵性拉茜斯酵母（Lachancea fermentati），將其命名為發(fā)酵性拉茜斯酵母HN-10；生理生化鑒定試驗結(jié)果表明，菌株HN-10 能夠利用葡萄糖、麥芽糖、木糖醇等多種糖類，但唯獨不能利用阿拉伯糖。

2.2.3 26S rDNA 分子生物學(xué)鑒定 26S rDNA 測序結(jié)果經(jīng)BLAST 比對顯示菌株HN-10 與登錄號NG055076.1Lachancea fermentati的26S rDNA 基因組序列相似性為99%，因此確定其為發(fā)酵性拉茜斯酵母（Lachancea fermentati），并將此菌株序列上傳至NCBI 系統(tǒng)，獲得登錄號為OQ592571，構(gòu)建如圖4所示的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹。目前已有研究報道該屬在釀造[22-23]和烘培[24]等方面的應(yīng)用潛力。同時將菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為：CGMCC No.25593。

圖4 菌株HN-10 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain of HN-10

2.3 菌株的安全特性分析

對菌株進(jìn)行溶血檢測的結(jié)果如圖5 所示，接種菌株后的綿羊血平板在常規(guī)培養(yǎng)下周圍沒有出現(xiàn)溶血圈，說明L.fermentatiHN-10 沒有溶血作用，具安全性。

圖5 菌株HN-10 的溶血實驗結(jié)果Fig.5 Hemolysis test results of strain of HN-10

2.4 富硒菌株發(fā)酵工藝優(yōu)化的單因素實驗結(jié)果

2.4.1 接種量對菌株富硒的影響 接種量是影響菌株富硒能力的因素之一。當(dāng)接種量過多時，發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗，菌株在培養(yǎng)后期相互競爭，導(dǎo)致菌株的生物量和硒富集量減少；相反，接種量過少則會導(dǎo)致菌株生長緩慢，代謝活動減弱，從而影響富硒效率[25]。如圖6 所示，在有限的發(fā)酵營養(yǎng)環(huán)境中，菌株HN-10 的生物量、富硒量與硒轉(zhuǎn)化率隨接種量增加呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢。當(dāng)接種量為5%時，菌株HN-10 的生物量與富硒量均達(dá)到最高值，分別為4.01 g/L 和1.29 mg/g，對應(yīng)硒轉(zhuǎn)化率也達(dá)到最大值25.69%。而隨著接種量的繼續(xù)增大，由于菌株HN-10 生長過于迅速，導(dǎo)致培養(yǎng)基中營養(yǎng)減少和溶氧不足，無法保證自身充分的生長和代謝需求，導(dǎo)致其生物量、富硒量與硒轉(zhuǎn)化率也隨之下降。接種量過多或過少均會影響菌株生物量高低與硒富集能力的強(qiáng)弱，最終影響硒轉(zhuǎn)化率，因此選定發(fā)酵培養(yǎng)的接種量為5%。

圖6 接種量對菌株富硒能力的影響Fig.6 Effect of inoculation amount on selenium-enriching ability of strain

2.4.2 初始pH 對菌株富硒的影響 培養(yǎng)基初始pH 會影響細(xì)胞膜功能、細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)、各種營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和產(chǎn)物的生物合成[26]，不同pH 下的原生質(zhì)膜所帶電荷不同，從而引起原生質(zhì)膜對某些離子的滲透性發(fā)生改變，導(dǎo)致酵母菌對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、細(xì)胞膜通透性、酶的活性以及代謝途徑發(fā)生變化。如圖7 所示，隨著初始pH 增加，菌株HN-10 的生物量、富硒量與硒轉(zhuǎn)化率均表現(xiàn)出先增長后下降的趨勢，pH 為6 時，其生物量最高達(dá)4.03 g/L，富硒量也達(dá)最高值1.30 mg/g，硒轉(zhuǎn)化率最高為26.29%；而當(dāng)pH 大于7 時，其生物量、硒含量及硒轉(zhuǎn)化率開始下降，說明生長環(huán)境偏堿性，發(fā)酵過程中菌株細(xì)胞生長受到抑制，影響富硒能力。實驗結(jié)果說明菌株HN-10 在酸性及中性條件下生長良好且富硒能力較強(qiáng)。初始pH 過高或過低均會影響菌株HN-10 生長，從而抑制菌株富集硒的能力，因此選定最優(yōu)初始pH 為6.0。

圖7 培養(yǎng)基初始pH 對菌株富硒能力的影響Fig.7 Effect of initial pH of the medium on selenium-enriching ability of strain

2.4.3 發(fā)酵溫度對菌株富硒的影響 溫度是影響菌株生長和代謝產(chǎn)物合成的主要因素之一，它通過改變相關(guān)酶的活性而起作用[27]。溫度過低，會使細(xì)胞質(zhì)膜處于凝固態(tài)，無法形成質(zhì)子濃度，進(jìn)而不能對營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行運輸，導(dǎo)致酵母菌無法正常生長。隨著溫度的上升，胞內(nèi)酶活性增加，促進(jìn)其化學(xué)反應(yīng)速率，從而表現(xiàn)為酵母菌的生長速率增大，當(dāng)達(dá)到最大值時，即酵母菌的生物累積量最大[28]。如圖8 所示，菌株HN-10 的生物量、富硒量與硒轉(zhuǎn)化率隨發(fā)酵溫度的增加表現(xiàn)出先增加后下降的趨勢，在溫度為22 ℃時生物量達(dá)到最高值4.52 g/L，對應(yīng)的富硒量也達(dá)最高值1.57 mg/g，對應(yīng)硒轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高35.43%。而當(dāng)培養(yǎng)溫度高于22 ℃時，菌株生物量下降，富硒量與硒轉(zhuǎn)化率率也隨之減少。溫度過高可能會使酵母菌的生長速率下降，導(dǎo)致其生物量減少，最終導(dǎo)致硒含量的下降，因此確定最優(yōu)發(fā)酵溫度為22 ℃。

圖8 發(fā)酵溫度對菌株富硒能力的影響Fig.8 Effect of fermentation temperature on seleniumenriching ability of strain

2.4.4 發(fā)酵轉(zhuǎn)速對菌株富硒的影響 發(fā)酵液中溶解氧含量，會直接影響菌株的生長狀況，而搖床轉(zhuǎn)速是影響發(fā)酵液中溶氧量的重要因素。低轉(zhuǎn)速條件下，溶氧少，菌體生長緩慢；而在較高搖瓶轉(zhuǎn)速下，菌體會發(fā)生自溶現(xiàn)象，導(dǎo)致細(xì)胞總數(shù)下降，進(jìn)而影響其富硒含量[29]。如圖9 所示，發(fā)酵轉(zhuǎn)速在60～180 r/min 之間，菌株HN-10 的生物量、富硒量與硒轉(zhuǎn)化率先隨轉(zhuǎn)速的提高而增加，在轉(zhuǎn)速為180 r/min 時生物量達(dá)最高值4.20 g/L，對應(yīng)富硒量也達(dá)最高值1.49 mg/g，硒轉(zhuǎn)化率最高為31.36%。而當(dāng)轉(zhuǎn)速持續(xù)增加，菌體可能發(fā)生了自溶現(xiàn)象，生物量下降，對應(yīng)富硒量也逐漸減少，硒轉(zhuǎn)化率也逐漸降低。因此選定最優(yōu)發(fā)酵轉(zhuǎn)速為180 r/min。

圖9 發(fā)酵轉(zhuǎn)速對菌株富硒能力的影響Fig.9 Effect of fermentation speed on selenium-enriching ability of strain

2.4.5 發(fā)酵時間對菌株富硒的影響 發(fā)酵時間是工業(yè)生產(chǎn)的重要的因素。減少發(fā)酵時間可以縮短工業(yè)中富硒酵母的生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本[30]，提高生產(chǎn)效率。如圖10 所示，菌株HN-10 的生物量、富硒量與硒轉(zhuǎn)化率隨發(fā)酵時間的增加表現(xiàn)出先增加后減少的趨勢。發(fā)酵初期，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)豐富，菌株HN-10 生長繁殖快，生物量在48 h 達(dá)最高值4.31 g/L，富硒量也達(dá)最高1.52 mg/g；對應(yīng)硒轉(zhuǎn)化率最高為32.79%。隨著發(fā)酵時間增加，培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質(zhì)消耗過多，限制菌株的生長與代謝，從而影響菌株對硒的富集能力，使菌株生生物量、富硒量與硒轉(zhuǎn)化率降低。因此選定最優(yōu)的發(fā)酵時間為48 h。

圖10 發(fā)酵時間對菌株富硒能力的影響Fig.10 Effect of fermentation time on selenium-enriching ability of strain

2.4.6 硒添加量對菌株富硒的影響 富硒培養(yǎng)基中無機(jī)硒主要為Na2SeO3，其次為SeO2和NaHSeO3，硒的種類及濃度會直接影響菌株的生長和繁殖，最終影響菌株對硒的富集速率和富集量[31]。如圖11 所示，隨著硒濃度的增加，菌株HN-10 的富硒量隨之增加后趨于穩(wěn)定，而生物量則先增加后下降，硒轉(zhuǎn)化率則呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。當(dāng)硒添加量為20 μg/mL 時，生物量達(dá)到最大值4.47 g/L，對應(yīng)富硒量也達(dá)到最大值1.41 mg/g，硒轉(zhuǎn)化率為31.41%，說明適量添加亞硒酸鈉利于菌株對硒的富集，過量的亞硒酸鈉會抑制菌株生長，同時也會影響菌株對硒的富集能力。因此，選擇硒添加濃度為20 μg/mL。

圖11 硒添加量對菌株富硒能力的影響Fig.11 Effect of selenium addition on selenium-enriching ability of strain

3 結(jié)論

本研究結(jié)合耐硒法和紅硒法從海南省東寨港紅樹林中分離純化篩選出具有高富硒能力的海洋微生物，通過形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)方法鑒定該菌株為發(fā)酵性拉茜斯酵母Lacancea fermentiHN-10。并通過血平板驗證L.fermentiHN-10 無溶血作用，具有安全性。本文通過單因素實驗對L.fermentiHN-10 的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出菌株在5%接種量、初始pH 為6.0、發(fā)酵溫度22 ℃、發(fā)酵轉(zhuǎn)速180 r/min、發(fā)酵時間48 h、硒添加量為20 μg/mL 的最優(yōu)條件下，可以有效地平衡富硒和細(xì)胞生長，對應(yīng)的富硒量、生物量、硒轉(zhuǎn)化率分別為1.57 mg/g、4.52 g/L、35.43%。綜上所述，本研究分離純化篩選鑒定的海洋源酵母菌L.fermentiHN-10 具有良好的硒轉(zhuǎn)化能力，可以作為一種安全且高效的營養(yǎng)強(qiáng)化劑，在發(fā)酵、營養(yǎng)、食品和動物飼料工業(yè)等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景，但對L.fermentiHN-10 菌株中硒的形態(tài)、特性和硒的合成機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。