黃文浩，陳建平,2, ，陳博文，陳 岑，鐘賽意,2，劉曉菲,2，李 瑞,2，宋兵兵,2，汪 卓,2

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室，廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省亞熱帶果蔬加工科技創(chuàng)新中心，廣東湛江 524088；2.大連工業(yè)大學(xué)，海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧大連 116034）

酒精性肝損傷（Alcoholic liver injury，ALI）是臨床上最為常見(jiàn)的肝病之一，主要由長(zhǎng)期或大量攝入酒精引起。ALI 最初表現(xiàn)為酒精性脂肪肝、肝炎，進(jìn)而演變成肝纖維化、肝硬化和肝癌[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，每年全球約有300 萬(wàn)人因酒精中毒死亡，在我國(guó)，隨著酗酒人口的比例不斷上升，ALI 的防治變得尤為重要[2-3]。近年來(lái)，具有低毒副作用的食源性天然物質(zhì)因在抗酒精性肝損傷領(lǐng)域存在巨大潛力而備受關(guān)注[4]。

姜黃素（Curcumin，Cur）是從姜科植物根莖中提取的一種疏水性多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗癌和護(hù)肝等生物活性[5]。研究表明，Cur 可以改善由酒精、四氯化碳等化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的肝損傷，是一種防治肝損傷的理想天然化合物[6-7]。然而，Cur 的水溶性差，進(jìn)入人體后存在難吸收、高濃度下生物利用度極低等問(wèn)題，嚴(yán)重限制了其在酒精性肝損傷防治領(lǐng)域的應(yīng)用[8-9]。為提高Cur 的生物利用度，人們通過(guò)多種方法對(duì)Cur 進(jìn)行改性，其中，用藥物載體對(duì)Cur 進(jìn)行包裹是可行的方法之一[10]。目前，常用的藥物載體有脂質(zhì)體、微球、納米粒、環(huán)糊精和乳劑等，它們都具有載體用量少、藥物荷載量高、粒徑和滲透力可控、釋放藥物速率可控、毒性低、副作用少等優(yōu)點(diǎn)[11]。然而，脂質(zhì)體作為藥物載體存在靶向效果不理想、穩(wěn)定性欠佳等問(wèn)題。同時(shí)，微球靶向給藥系統(tǒng)也存在藥物的突釋等未解決的問(wèn)題。而納米技術(shù)作為近年來(lái)發(fā)展的一種新型技術(shù)，在生物學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。其中，硒納米粒子（粒子粒徑在1～100 nm之間）因具有體積小、比表面積大、物理化學(xué)性質(zhì)獨(dú)特、對(duì)人體細(xì)胞毒性低等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用作藥物載體[12]。

硒（Selenium，Se）是人體維持正常生理活動(dòng)必需的微量元素，而常見(jiàn)的有機(jī)Se 和無(wú)機(jī)Se 的有益劑量和有害劑量的范圍很窄，當(dāng)Se 攝入過(guò)量時(shí)，會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生毒害作用[13-14]。隨著納米技術(shù)的出現(xiàn)，研究發(fā)現(xiàn)，將Se 納米化制備得到的納米硒（Selenium nanoparticles，SeNPs）具有低毒性和高生物活性[15-16]。然而，SeNPs 存在表面能高、不穩(wěn)定、在水溶液中容易聚集等問(wèn)題導(dǎo)致其生物活性低[17]，限制了它的臨床應(yīng)用。設(shè)想如果采用Cur 作為穩(wěn)定劑制備姜黃素納米硒（SeNPs@Cur），這樣既能結(jié)合Cur 和SeNPs 的優(yōu)點(diǎn)，又能克服兩者本身存在的不足[18]。故本研究通過(guò)化學(xué)還原法合成SeNPs@Cur，運(yùn)用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)SeNPs@Cur 的制備條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征和抗酒精性肝損傷的作用研究，為Cur 在防治酒精性肝損傷臨床藥物的應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供新的技術(shù)手段和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

亞硒酸鈉（Na2SeO3，＞98%）美國(guó)Sigma 公司；姜黃素（Cur，＞95%）、抗壞血酸（VC，＞99%）中國(guó)上海源葉生物科技有限公司；胎牛血清、PBS、DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶溶液、雙抗溶液 美國(guó)Gibco 公司；LO2 細(xì)胞 美國(guó) ATCC 公司。

AUW120 電子天平 日本島津公司；HL-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州奧華儀器有限公司；Zetasizer Nano ZSE 馬爾文納米粒度電位儀 上海馬爾文帕納科公司；N-4000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 東京理化器械株式會(huì)社；FD8508 真空冷凍干燥機(jī) 韓國(guó)Ilshin 公司；TU-1901 雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司；Agilent 7500Cx 電感耦合等離子體質(zhì)譜 美國(guó)Agilent 公司；MIRA LMS 掃描電子顯微鏡 捷克TESCAN 公司；Oxford 能譜儀 英國(guó)牛津儀器集團(tuán)；NicoletiS-5 型傅里葉變換紅外光譜儀、Varioskan Flash 全自動(dòng)酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司；JIDI-21D 高速離心機(jī) 廣州吉迪儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SeNPs 的制備 稱取79.26 mg VC和7.78 mg Na2SeO3分別溶解于22.5 mL 蒸餾水中，在Na2SeO3溶液中加入0.25 mL 無(wú)水乙醇后與VC溶液混合，將混合液置于34 ℃度恒溫水浴鍋中加熱并攪拌反應(yīng)1.98 h，反應(yīng)后的混合液用0.5 kDa 的透析袋透析48 h，得到SeNPs 溶液。

1.2.2 SeNPs@Cur 的制備

1.2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 參考Chen 等[19]方法，對(duì)SeNPs@Cur 的制備工藝參數(shù)略作修改。VC和Na2SeO3分別溶解于22.5 mL 蒸餾水中，在Na2SeO3溶液中加入0.25 mL Cur 無(wú)水乙醇溶液后與VC溶液混合，將混合液置于恒溫水浴鍋中加熱并攪拌反應(yīng)，反應(yīng)后的混合液用0.5 kDa 的透析袋透析48 h，得到SeNPs@Cur 溶液。固定VC:Na2SeO3摩爾比為10:1，反應(yīng)時(shí)間為2 h，反應(yīng)溫度為35 ℃，采用馬爾文納米粒度電位儀考察不同Cur 濃度（2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL）對(duì)SeNPs@Cur 粒徑的影響；固定Cur 濃度為6.0 mg/mL，反應(yīng)時(shí)間為2 h，反應(yīng)溫度為35 ℃，采用馬爾文納米粒度電位儀考察不同VC:Na2SeO3摩爾比（4:1、6:1、8:1、10:1、12:1）對(duì)SeNPs@Cur 粒徑的影響；固定Cur 濃度為6.0 mg/mL，VC:Na2SeO3摩爾比為10:1，反應(yīng)溫度為35 ℃，采用馬爾文納米粒度電位儀考察不同反應(yīng)時(shí)間（1、2、3、4 和5 h）對(duì)SeNPs@Cur 粒徑的影響；固定Cur 濃度為6.0 mg/mL，VC:Na2SeO3摩爾比為10:1，反應(yīng)時(shí)間為2 h，采用馬爾文納米粒度電位儀考察不同反應(yīng)溫度（25、30、35、40、45 ℃）對(duì)SeNPs@Cur粒徑的影響。

1.2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以Cur 濃度（A）、VC:Na2SeO3摩爾比（B）、反應(yīng)時(shí)間（C）和反應(yīng)溫度（D）四個(gè)因素為變量，SeNPs@Cur 粒徑（Y）為因變量設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平見(jiàn)表1。使用Design-Expert 13 軟件分析多因素的交互作用，確定SeNPs@Cur 的最佳制備工藝參數(shù)。根據(jù)最佳工藝參數(shù)制備SeNPs@Cur 溶液，經(jīng)透析、旋蒸、真空冷凍干燥后得SeNPs@Cur。

1.2.3 SeNPs@Cur 載藥率的測(cè)定 稱取5.0 mg Cur溶于50.0 mL 無(wú)水乙醇，經(jīng)超聲充分溶解后，將Cur溶液稀釋至1、2、4、6、8、10 μg/mL，在425 nm 處測(cè)定其吸光度值，得到Cur 標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.1569x-0.0083，R2=0.9998。

稱取5.0 mg SeNPs@Cur 樣品溶于50.0 mL 無(wú)水乙醇，經(jīng)超聲充分溶解后，在425 nm 處測(cè)定其吸光度值，根據(jù)Cur 標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品中的Cur 含量，按公式（1）計(jì)算載藥率。

1.2.4 SeNPs@Cur 的結(jié)構(gòu)表征

1.2.4.1 電感耦合等離子體質(zhì)譜（Inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）取SeNPs@Cur粉末100.0 mg 置于消解液中（6.0 mL 硝酸+0.5 mL雙氧水）進(jìn)行微波消解，隨后使用ICP-MS 測(cè)定樣品中的Se 含量。儀器工作參數(shù)為：入射功率1550 W，載氣流量1.0 L/min，輔助氣流量1.0 L/min，氦氣流量4.0 L/min，進(jìn)樣深度10.0 mm，進(jìn)樣速率1.0 L/min。

1.2.4.2 掃描電子顯微鏡（Scanning electron microscope，SEM）取微量SeNPs@Cur 粉末樣品均勻粘貼于導(dǎo)電膠上，使用濺射鍍膜儀對(duì)其進(jìn)行噴金處理，工作電流為10 mA，噴涂時(shí)間為45 s，隨后用掃描電子顯微鏡在不同放大倍數(shù)下對(duì)SeNPs@Cur 樣品形貌進(jìn)行拍攝，拍攝加速電壓為3 kV。

1.2.4.3 傅里葉變換紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)T-IR）取約2.0 mg SeNPs@Cur 粉末樣品與200 mg 干燥的溴化鉀（KBr）粉末混合后研磨均勻，將混合粉末進(jìn)行壓片處理，壓制成半透明薄片，掃描其紅外吸收光譜，掃描波數(shù)范圍為4000～400 cm-1。

1.2.4.4 能譜儀（Energy dispersive spectrometer，EDS）

在上述實(shí)驗(yàn)方法1.2.4.2 的樣品條件下，使用能譜儀對(duì)樣品進(jìn)行能譜mapping 元素分析，拍攝時(shí)加速電壓為15 kV。

1.2.5 SeNPs@Cur 對(duì)乙醇損傷LO2 細(xì)胞的保護(hù)作用

1.2.5.1 細(xì)胞培養(yǎng) LO2 細(xì)胞復(fù)蘇后，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗溶液的DEME 高糖培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度＞70%時(shí)進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5.2 乙醇誘導(dǎo)LO2 細(xì)胞損傷模型的建立 將細(xì)胞懸液稀釋至8×104個(gè)細(xì)胞/mL，在96 孔板中，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組加入細(xì)胞懸液，空白組加入含10%胎牛血清和1%雙抗溶液的DEME 高糖培養(yǎng)基，每孔100 μL。培養(yǎng)24 h 后去除培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入乙醇濃度為200～1400 mmol/L 的DEME 高糖培養(yǎng)基，空白組和對(duì)照組加入DEME 高糖培養(yǎng)基，每孔200 μL。分別培養(yǎng)3 h 和6 h 后，各孔加入20 μL 5 mg/mL MTT 溶液孵育4 h，去除上清液，各孔加入150 μL DMSO 溶液反應(yīng)10 min。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在570 nm 處的吸光值，根據(jù)公式（2）計(jì)算細(xì)胞活力。

式中：A0表示空白組OD 值；A1表示對(duì)照組OD 值；A2表示實(shí)驗(yàn)組OD 值。

1.2.5.3 SeNPs@Cur 對(duì)乙醇誘導(dǎo)LO2 細(xì)胞損傷的影響 將細(xì)胞懸液稀釋至8×104個(gè)細(xì)胞/mL，在96孔板中，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組加入細(xì)胞懸液，空白組加入含10%胎牛血清和1%雙抗溶液的DEME 高糖培養(yǎng)基，每孔100 μL。培養(yǎng)24 h 后去除培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入SeNPs@Cur 濃度為125～500 μg/mL 的DEME高糖培養(yǎng)基，空白組和對(duì)照組加入DEME 高糖培養(yǎng)基，每孔100 μL。培養(yǎng)12 h 后去除上清液，實(shí)驗(yàn)組加入乙醇濃度為800 mmol/L 的DEME 高糖培養(yǎng)基，空白組和對(duì)照組加入DEME 高糖培養(yǎng)基，每孔200 μL。培養(yǎng)6 h 后，各孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液孵育4 h，然后去除上清液，各孔加入150 μL DMSO 溶液反應(yīng)10 min。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在570 nm 處的吸光值，根據(jù)公式（2）計(jì)算細(xì)胞活力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS 26.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Design-Expert 13.0 進(jìn)行響應(yīng)面模型建立及分析，Origin 2021 進(jìn)行圖片繪制。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（D）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cur 濃度、VC:Na2SeO3 摩爾比、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度對(duì)SeNPs@Cur 粒徑的影響

據(jù)報(bào)道，Cur 的加入可以使SeNPs 具有更高的穩(wěn)定性[20]。為確定Cur 的最佳濃度，考察不同Cur濃度對(duì)粒徑的影響，結(jié)果如圖1A 所示。SeNPs@Cur 粒徑大小隨Cur 濃度的增加呈先下降后上升的趨勢(shì)，在Cur 濃度為6.0 mg/mL 時(shí)粒徑達(dá)到最小值為（101.18±1.71）nm。結(jié)果表明，適量的Cur 可抑制SeNPs 的聚集，使SeNPs@Cur 粒徑減小。這可能是Cur 中的酚羥基可以吸附并包裹SeNPs，阻止了SeNPs 的聚集，從而使得粒徑減小。而過(guò)量的Cur則易導(dǎo)致Cur 分子之間聚集使得游離的酚羥基減少，導(dǎo)致吸附和包裹SeNPs 的能力減弱，從而使得SeNPs@Cur 粒徑增大。因此，選擇6.0 mg/mL 作為Cur 的最佳濃度。

過(guò)量的VC可以使Na2SeO3完全反應(yīng)，有助于SeNPs 的合成[19]。為確定最佳VC:Na2SeO3摩爾比，考察不同VC:Na2SeO3摩爾比對(duì)粒徑的影響，結(jié)果如圖1B 所示。當(dāng)VC:Na2SeO3摩爾比為4:1 時(shí)，所制得SeNPs@Cur 的粒徑為（121.93±3.86）nm，提高兩者摩爾比到10:1 時(shí)，SeNPs@Cur 的粒徑最小，為（106.38±0.83）nm，這主要是因?yàn)檫^(guò)量的VC可以改善晶核的生長(zhǎng)從而穩(wěn)定SeNPs@Cur[21]，然而，繼續(xù)增大VC:Na2SeO3摩爾比會(huì)導(dǎo)致粒徑變大，這可能是VC濃度進(jìn)一步增大會(huì)使得反應(yīng)體系不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致納米顆粒增大。因此，選擇10:1 作為VC:Na2SeO3的最佳摩爾比。

反應(yīng)時(shí)間是影響Na2SeO3還原成SeNPs 的一個(gè)重要參數(shù)[22]。過(guò)短的反應(yīng)時(shí)間會(huì)導(dǎo)致VC和Na2SeO3之間反應(yīng)不完全，反之，長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致SeNPs 的聚集進(jìn)而使粒徑增大。為確定最佳反應(yīng)時(shí)間，考察不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)粒徑的影響，結(jié)果如圖1C 所示。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為2 h 時(shí)，所制得SeNPs@Cur 粒徑為（103.65±1.74）nm，達(dá)到最小值。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)2 h，所制得SeNPs@Cur 粒徑顯著增大（P＜0.05）。因此，選擇2 h 作為最佳反應(yīng)時(shí)間。

升高反應(yīng)溫度會(huì)加劇分子的熱運(yùn)動(dòng)，使SeNPs粒子更容易分散[23]。為確定最佳反應(yīng)溫度，考察不同反應(yīng)溫度對(duì)粒徑的影響，結(jié)果如圖1D 所示。在25～35 ℃內(nèi)，隨著反應(yīng)溫度增加，SeNPs@Cur 粒徑呈減小趨勢(shì)，當(dāng)反應(yīng)溫度為35 ℃時(shí)，所制得SeNPs@Cur 粒徑顯著性減小為（103.92±3.70）nm（P＜0.05）。然而，當(dāng)溫度進(jìn)一步提高時(shí)，SeNPs@Cur 粒徑顯著增大（P＜0.05）。這可能是由于高溫容易導(dǎo)致納米顆粒劇烈運(yùn)動(dòng)，從而增加碰撞的機(jī)會(huì)和強(qiáng)度導(dǎo)致納米粒子不斷的聚集，最終使得粒徑增大[24]。因此，選擇35 ℃作為最佳反應(yīng)溫度。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化SeNPs@Cur 的制備工藝

以Cur 濃度（A）、VC:Na2SeO3摩爾比（B）、反應(yīng)時(shí)間（C）和反應(yīng)溫度（D）為變量，SeNPs@Cur 粒徑（Y）為因變量，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，方差分析結(jié)果見(jiàn)表2。使用Design-Expert 13 軟件分析4 個(gè)因素對(duì)SeNPs@Cur 粒徑的影響，得SeNPs@Cur 粒徑（Y）的二次回歸方程：Y=101.35+1.07A-4.29B-0.2C+1.84D-3.92AB-4.64AC+0.63AD+0.06BC-1.99BD-4.42CD+11.31A2+9.65B2+14.28C2+4.14D2。

表2 二次回歸模型的方差分析Table 2 ANOVA for quadratic model

由表2 中的二次回歸模型方差分析結(jié)果可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.7855＞0.05），決定系數(shù)R2=0.9759，說(shuō)明模型擬合效果好，可信度高，該模型可用于對(duì)SeNPs@Cur 粒徑的預(yù)測(cè)?；貧w模型中一次項(xiàng)B 和D，交互項(xiàng)AB、AC 和CD，二次項(xiàng)A2、B2、C2和D2極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)A 顯著（P＜0.05）。

由表2 可知，Cur 濃度與VC:Na2SeO3摩爾比、Cur 濃度與反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)時(shí)間與反應(yīng)溫度之間存在顯著的交互效應(yīng)（P＜0.05），其余的交互項(xiàng)不顯著。圖2 是根據(jù)回歸方程生成的響應(yīng)面立體圖，其反映了Cur 濃度、VC:Na2SeO3摩爾比、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度四者之間的相互作用。由圖可知，各因素間的曲線較陡峭，等高線呈橢圓形，說(shuō)明因素間的交互作用對(duì)SeNPs@Cur 粒徑影響較大[25]，SeNPs@Cur 粒徑在各因素設(shè)置水平范圍內(nèi)隨著因素的增大呈先減小后增大的趨勢(shì)。

圖2 Cur 濃度與VC:Na2SeO3 摩爾比（A）、Cur 濃度與反應(yīng)時(shí)間（B）、反應(yīng)時(shí)間與反應(yīng)溫度（C）的交互作用對(duì)SeNPs@Cur 粒徑影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plots of the interactions of Cur dosage and molar ratio of VC to Na2SeO3 (A),Cur dosage and reaction time (B),reaction time and reaction temperature (C) on SeNPs@Cur particle size

使用Design-Expert 13 軟件對(duì)模型最小值進(jìn)行求解，得到SeNPs@Cur 最優(yōu)制備條件為：Cur 濃度5.92 mg/mL、VC:Na2SeO3摩爾比10.39:1、反應(yīng)時(shí)間1.98 h、反應(yīng)溫度34.00 ℃，模型預(yù)測(cè)該條件下所制得的SeNPs@Cur 粒徑為100.72 nm。為驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)結(jié)果，實(shí)際設(shè)置Cur 濃度5.92 mg/mL、VC:Na2SeO3=10.39:1、反應(yīng)時(shí)間1.98 h、反應(yīng)溫度34.00 ℃進(jìn)行SeNPs@Cur 粒徑的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在此條件下制得的SeNPs@Cur 粒徑為（100.79±3.46）nm，接近理論預(yù)測(cè)值，說(shuō)明模型可靠，因此使用該條件制備SeNPs@Cur 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)SeNPs@Cur 進(jìn)行載藥率和Se 含量的測(cè)定，結(jié)果顯示，SeNPs@Cur 的載藥率為12.80%±0.80%；ICP-MS 測(cè)得樣品中Se 含量為23.32%±0.07%，與Jiao 等[26]得到的結(jié)果接近。

2.3 SeNPs@Cur 的表征

2.3.1 SEM 考察SeNPs@Cur 的形貌 采用SEM觀察SeNPs、Cur 和SeNPs@Cur 的表面形貌，結(jié)果如圖3 所示。SeNPs 呈現(xiàn)為不規(guī)則顆粒聚集物，表明SeNPs 易聚集，分散性較差[19]（圖3A）。Cur 則呈長(zhǎng)條狀，分布雜亂（圖3B）。而SeNPs@Cur 呈分散球形（圖3C），這與Yu 等[27]制備的SeNPs@Cur 形態(tài)類似，表明SeNPs 經(jīng)Cur 修飾后能夠有效抑制其聚集，從而提高SeNPs 的分散性。

圖3 SeNPs（A）、Cur（B）和SeNPs@Cur（C）的SEM 圖（2000×）Fig.3 SEM images of SeNPs (A),Cur (B) and SeNPs@Cur (C) (2000×)

2.3.2 SeNPs@Cur 的紅外光譜分析結(jié)果 為了確定SeNPs 與Cur 之間的結(jié)合方式，運(yùn)用傅里葉變換紅外光譜對(duì)SeNPs@Cur 進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4 所示。SeNPs 的紅外光譜圖幾乎沒(méi)有吸收峰，這與陳雪花等[28]得到的結(jié)果一致。在3505、1599、1508、1458、1281 cm-1分別對(duì)應(yīng)苯環(huán)上的羥基伸縮振動(dòng)，苯環(huán)上碳碳雙鍵伸縮振動(dòng)，羰基伸縮振動(dòng)，碳?xì)滏I在結(jié)構(gòu)平面內(nèi)的彎曲振動(dòng)，芳香環(huán)的羰基伸縮振動(dòng)，均為Cur 的特征吸收峰[27,29]。而SeNPs@Cur 與Cur的峰形極其相似，無(wú)新的吸收峰產(chǎn)生，且羥基吸收峰的強(qiáng)度變?nèi)?，波?shù)從3505 cm-1紅移到3412 cm-1，這可能是由于Cur 中的酚羥基與SeNPs 表面的Se 原子之間的發(fā)生了類似氫鍵的相互作用（O-H···Se）所致。綜上所述，Cur 主要通過(guò)酚羥基吸附結(jié)合在SeNPs 表面。

圖4 Cur、SeNPs 和SeNPs@Cur 的紅外光譜圖Fig.4 FTIR spectra of Cur,SeNPs and SeNPs@Cur

2.3.3 SeNPs@Cur 的表面元素分析 采用EDS 對(duì)SeNPs@Cur 進(jìn)行表面元素分析，結(jié)果如圖5 和表3 所示。由圖5 可知，SeNPs 和SeNPs@Cur 中均檢測(cè)出C、O 和Se 三種元素，但對(duì)應(yīng)的峰強(qiáng)度不同。由表3 可知，SeNPs 的Se、C、O 含量分別為88.02%、10.81%、1.14%，元素含量占比中大部分是Se[30]。而在SeNPs@Cur 中，C、O 含量分別從SeNPs的10.81%和1.14%提高到48.51%和5.41%，增加的C 和O 主要是來(lái)源于Cur，可推斷SeNPs 成功負(fù)載了Cur。

圖5 SeNPs（A）和SeNPs@Cur（B）的SEM-EDS 元素分析Fig.5 SEM-EDS element analysis of SeNPs (A) and SeNPs@Cur (B)

表3 SeNPs 和SeNPs@Cur 的表面元素組成Table 3 Surface element composition of SeNPs and SeNPs@Cur

2.4 SeNPs@Cur 對(duì)乙醇損傷LO2 細(xì)胞的保護(hù)作用

由圖6A 可知，LO2 細(xì)胞經(jīng)不同濃度的乙醇處理不同時(shí)間后，細(xì)胞活力隨著乙醇濃度的增加呈下降趨勢(shì)，且乙醇作用6 h 的細(xì)胞活力低于3 h。在乙醇濃度為800 mmol/L，對(duì)LO2 細(xì)胞作用6 h 時(shí)，細(xì)胞活力下降至51.39%±6.02%，達(dá)到中度損傷。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇800 mmol/L 乙醇對(duì)LO2 細(xì)胞作用6 h 作為乙醇誘導(dǎo)LO2 細(xì)胞損傷模型。

圖6 不同濃度乙醇對(duì)LO2 細(xì)胞活力（A）、SeNPs@Cur 對(duì)乙醇損傷LO2 細(xì)胞活力（B）和細(xì)胞形態(tài)（C）的影響Fig.6 Effects of different concentrations of ethanol on the cell viabilities of LO2 cells (A) and SeNPs@Cur on the cell viabilities (B)and cell morphology (C) of LO2 cells damaged by ethanol

由圖6B 可知，模型組LO2 細(xì)胞經(jīng)800 mmol/L乙醇作用6 h 后，細(xì)胞活力從空白組的100%±3.05%顯著下降至58.06%±0.43%（P＜0.05），表明乙醇處理導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)了損傷。當(dāng)細(xì)胞經(jīng)125、250、500 μg/mL 的SeNPs@Cur 進(jìn)行干預(yù)后，細(xì)胞活力得到了顯著性提升，分別從模型組的58.06%±0.43%提高至71.43%±1.39%、77.33%±3.54%、85.41%±4.61%，表明SeNPs@Cur 能夠顯著改善乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷，且呈現(xiàn)出濃度依賴性。而且，在不同濃度下，SeNPs@Cur 處理后的細(xì)胞活力均高于Cur 處理組和SeNPs 處理組，表明SeNPs@Cur 對(duì)乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用強(qiáng)于單獨(dú)處理的Cur 和SeNPs，這可能是由于Cur 經(jīng)SeNPs 負(fù)載后大大提高了Cur 的生物利用度，同時(shí)SeNPs 經(jīng)Cur 修飾后避免了SeNPs 的聚集，從而提高了SeNPs@Cur 的護(hù)肝活性。為了驗(yàn)證上述結(jié)果，進(jìn)一步觀察了不同樣品處理對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響，結(jié)果如圖6C 所示。由圖6C 可知，相比于空白對(duì)照組，用乙醇處理細(xì)胞后，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，且細(xì)胞形態(tài)呈圓形。而用500 μg/mL SeNPs@Cur 處理后，能夠顯著提高細(xì)胞數(shù)量，且細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則的多邊形，與空白對(duì)照組的細(xì)胞形態(tài)相似，這說(shuō)明SeNPs@Cur 能夠改善乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷，這一結(jié)果與細(xì)胞活力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖6B）相一致。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)SeNPs@Cur 的制備條件進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征和抗酒精性肝損傷的作用研究。結(jié)果表明，SeNPs 的最佳制備工藝參數(shù)為Cur 濃度5.92 mg/mL、Vc:Na2SeO3摩爾比10.39:1、反應(yīng)時(shí)間1.98 h 和反應(yīng)溫度34.00 ℃，在此條件下制備的SeNPs@Cur 粒徑為（100.79±3.46）nm，接近模型的理論預(yù)測(cè)值。進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定發(fā)現(xiàn)，Cur 通過(guò)酚羥基吸附結(jié)合在SeNPs 表面形成均一球形的納米粒子，從而使得SeNPs 分散性得到提高?？咕凭愿螕p傷研究發(fā)現(xiàn)，相比單獨(dú)的Cur 和SeNPs，SeNPs@Cur 對(duì)乙醇損傷LO2 細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的保護(hù)作用，說(shuō)明Cur 經(jīng)SeNPs 負(fù)載后能夠增強(qiáng)Cur 對(duì)乙醇誘導(dǎo)LO2 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。綜上所述，采用SeNPs 負(fù)載Cur是一種提高Cur 生物利用度的有效途徑，為SeNPs@Cur 在酒精性肝病的防治領(lǐng)域提供了數(shù)據(jù)參考和理論支持。