徐美琪，李思漫，劉 欣，歐月靈，羅舒雯，李 琳，陳 旭,*，朱 杰,*

（1.東莞理工學(xué)院生命健康與技術(shù)學(xué)院，中國輕工業(yè)健康食品開發(fā)與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，東莞市特色食品精準(zhǔn)設(shè)計重點實驗室，食品營養(yǎng)健康工程與智能化加工研究中心，廣東東莞 523808；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，食品學(xué)院，廣東廣州 510642）

膳食纖維是人體第七類營養(yǎng)素，具有控制體重，穩(wěn)定膽固醇水平，改善消化系統(tǒng)功能和維持心血管健康等諸多功能[1-3]。近年來，通過強(qiáng)化食品加工過程中的膳食纖維含量，成為飲食干預(yù)常見慢性疾病的有效途徑[4]?？剐院嵌替溒咸烟蔷酆衔铮鳛榈头肿恿克苄陨攀忱w維，具有緩解血糖驟升[5]，降低血脂[6-7]，調(diào)節(jié)腸道菌群[8-9]，降低體重[10-11]，增強(qiáng)微量元素的吸收[12-13]等諸多生理功效而備受關(guān)注。抗性糊精還被廣泛應(yīng)用于飲料、糖果、巧克力、乳制品、焙烤食品、營養(yǎng)能量棒和肉制品等產(chǎn)品中[14]。

目前，最早和最常用的抗性糊精的制備方法是酸熱法，主要是通過在高溫下用鹽酸或其他酸浸泡淀粉，再經(jīng)過液化、酶水解、脫色、過濾、濃縮、噴霧干燥等系列操作，最終得到抗性糊精產(chǎn)品[15]。研究表明，較高的酸濃度和較長的加熱時間有利于增加抗性糊精中膳食纖維含量，而有機(jī)酸的濃度對抗性糊精的化學(xué)結(jié)構(gòu)也有很大影響[16]。然而，酸熱法制備的抗性糊精存在純度低、產(chǎn)品顏色深、耗時耗力、環(huán)境污染等問題。近年來，有學(xué)者關(guān)注復(fù)合酶法制備抗性糊精的綠色工藝。Zhan 等[17]采用分支酶和灰曲霉α-葡萄糖苷酶等酶作用于焦糊精，得到抗性含量為70.6%的抗性糊精。脫支和重結(jié)晶法復(fù)合酶解工藝主要是糊化后的淀粉在脫支酶的作用下使支鏈淀粉中的α-1,6 糖苷鍵斷裂，形成長短不一的直鏈分子鏈產(chǎn)物[18]；然后在50 ℃或低溫環(huán)境下高直鏈含量支鏈淀粉發(fā)生分子重排形成新的結(jié)晶體，得到抗性糊精。該方法對環(huán)境友好，產(chǎn)品色澤好，節(jié)省化學(xué)試劑，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。因此，本研究以蠟質(zhì)玉米淀粉和普通玉米淀粉為原料，采用綠色環(huán)保的脫支和重結(jié)晶復(fù)合酶水解工藝制備抗性糊精，探究其結(jié)構(gòu)特性和功能特性并構(gòu)建關(guān)聯(lián)，為抗性糊精的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

普通玉米淀粉、蠟質(zhì)玉米淀粉 東莞市東岳葡萄糖廠有限公司；普魯蘭酶（2 U/mg）、淀粉葡萄糖苷酶（0.3 U/mg）上海麥克林生化科技有限公司；豬胰酶（8 U/mg）、豬胰α-淀粉酶（8 U/mg）上海源葉生物科技有限公司；苯甲酸、醋酸、無水乙醇、氯化鈣分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；葡萄糖氧化酶/過氧化物酶葡萄糖檢測試劑盒（Glucose oxidase/peroxideenzymatic glucose assay kit，GOPOD）愛爾蘭Megazyme 公司。

DSC-8000 型差示掃描量熱儀 美國Perkin-Elmer 公司；D8-ADVANCE 型X 射線衍射儀 德國BRUKER-AXS 有限公司；TG20-WSI（I 類B 型）離心機(jī) 湘麓離心機(jī)儀器有限公司；TDL-60B 離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；DZF-6096 真空干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Nicolet iN10 顯微紅外光譜儀 美國Thermo Scientific；CM-5 分光測色計日本KONICA MINOLTA；SCIENTZ-18N 冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司；MR Hei-Tec 磁力加熱攪拌器 德國 Heigolph 公司；752N 紫外分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；MA35 水分測定儀 賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；BRUKER AVANCE 400 核磁共振波譜 德國布魯克公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗性糊精的制備 參考Lee 等[19]方法略作修改，分別稱取50 g 蠟質(zhì)玉米淀粉（Waxy corn starch，WCS）和50 g 普通玉米淀粉（Normal corn starch，NCS），分別加入醋酸鈉緩沖溶液（0.01 mol/L、pH4.5）至濃度為0.2 g/mL，在沸水下加熱攪拌糊化30 min。待淀粉溶液冷卻至50 ℃后，加入普魯蘭酶（5%，w/w，基于淀粉干基質(zhì)量），在50 ℃水浴鍋中連續(xù)磁力攪拌7 d，使其完全脫支和重結(jié)晶，得到粗抗性糊精樣品。隨后，將粗抗性糊精樣品沸水浴蒸煮10 min，然后冷卻到60 ℃，使用氫氧化鈉溶液（0.1 mol/L）調(diào)節(jié)溶液pH6.9，加入豬胰α-淀粉酶（5%，w/w，基于粗抗性糊精含量），在37 ℃下磁力攪拌12 h。經(jīng)酶水解后的抗性糊精離心三次（10000×g，15 min），沉淀物進(jìn)行冷凍干燥，粉碎，過100 目篩密封保存?zhèn)溆?。原淀粉對照樣品分別標(biāo)記為WCS 和NCS，抗性糊精樣品分別標(biāo)記為WRD 和NRD。

1.2.2 形貌特征觀察 采用掃描電子顯微鏡對抗性糊精和原淀粉樣品進(jìn)行顯微形貌觀察。將抗性糊精和原淀粉樣品均勻分散在貼有導(dǎo)電膠的樣品臺上，利用離濺射鍍膜儀噴金，分別放大1000 倍和2000 倍觀察樣品的形貌特征。

1.2.3 熱力學(xué)特性測定 利用差式掃描量熱儀（DSC）測定抗性糊精和原淀粉樣品的熱力學(xué)特性。稱取3 mg 的干基樣品，以3:7 的比例加入蒸餾水溶解樣品并密封在鋁DSC 鍋中，然后在常溫條件下放置過夜。在10 ℃/min 的加熱速率下，從25 ℃到120 ℃掃描樣品，每個樣品做三次平行，并使用空鋁DSC 盤作為參考。

1.2.4 結(jié)晶特性測定 將抗性糊精和原淀粉樣品在鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘干至恒重，采用X-射線衍射儀對其結(jié)晶結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定。衍射條件為：電壓30 kV，電流30 mA，銅靶，掃描區(qū)域2θ為5°～35°，輻射線為Cu Ka，掃描速度2°/min，步長間隔為0.02°[20]。采用MDI Jade 6 軟件對結(jié)晶區(qū)域和總面積區(qū)間分別進(jìn)行積分計算，相對結(jié)晶度（Relative crystallinity，RC）按照公式（1）所示計算：

式中：Ac—結(jié)晶區(qū)部分面積；Aa—非晶區(qū)部分面積；Ac+Aa—總面積區(qū)間。

1.2.5 顯微紅外光譜分析 利用顯微紅外光譜儀對樣品的官能團(tuán)進(jìn)行測定。取少量的抗性糊精和原淀粉樣品置于顯微玻片中鋪平后，放到紅外顯微鏡下，在3500～750 cm-1范圍進(jìn)行紅外光譜掃描，調(diào)至最佳光圈，尋找合適的樣品特征，選取光譜圖。

1.2.6 溶解度測定 稱量0.5 g 抗性糊精和原淀粉樣品置于離心管中，加入25 mL 去離子水配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的樣品懸浮液，在室溫（25 ℃）條件下磁力攪拌30 min 防止樣品沉淀，在3000×g 下離心15 min，取上清液置于培養(yǎng)皿中，在105 ℃真空干燥箱中烘至恒重并稱重。按照公式（2）計算溶解度：

式中：A 為上清液蒸干后質(zhì)量（g）；W 為樣品質(zhì)量（g）。

1.2.7 白度 利用分光測色計測定抗性糊精和原淀粉樣品的白度特征值。每個樣品至少重復(fù)測定3 次。按照公式（3）計算樣品白度：

式中：L為亮度；a為有色物質(zhì)的紅綠偏向；b為有色物質(zhì)的黃藍(lán)偏向。

1.2.8 核磁共振氫譜分析 分別將50 mg 的抗性糊精樣品及其原淀粉50 mg 溶于0.55 mL D2O 中，以此方法進(jìn)行三次冷凍干燥處理使其與重水充分交換，復(fù)溶于D2O 中，記錄在25 ℃、400 MHz 工作時的1H-NMR 譜。該核磁共振波譜儀配備了一個5 mm低溫探頭和一個碳增強(qiáng)三共振反向探測器與一個脈沖場梯度探頭，128 次掃描，掃描寬度為16（10-6），采樣4 s，延遲時間為1 s，獲得1H-NMR 譜圖，采用MestReNove 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖。

1.2.9 體外消化性測定 參考Chen 等[21]方法，分別稱取600 mg 的抗性糊精及其原淀粉樣品于離心管中，加入20 mL 乙酸鈉緩沖液（pH5.2，0.1 mol/L），充分渦旋，沸水浴30 min，在水浴過程中要不斷地振蕩混勻使樣品完全糊化。經(jīng)冷卻置于37 ℃水浴鍋中磁力攪拌30 min。在離心管中加入5 mL 由豬胰酶（3×103U）和淀粉葡萄糖苷酶（40 U）組成的混合酶解液，振蕩混勻，間隔20 min 和120 min 分別取出0.25 mL 酶解液，置于10 mL 66%的乙醇中滅酶，渦旋混勻。酶解液在3500×g 條件下離心10 min，采用GOPOD 法測定葡萄糖含量。

通過公式（4）計算相應(yīng)的樣品中葡萄糖含量：

式中：At=測試溶液的吸光值；Vt=測試溶液的總體積（mL）；C=標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖的濃度（mg/mL）；As=標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖的吸光值；Wt=樣品的重量（mg）；D=稀釋倍數(shù)40。

快速消化淀粉（Rapidly digestible starch，RDS）、慢消化淀粉（Slowly digestible starch，SDS）以及抗性淀粉（Resistant starch，RS）含量按照公式（5）～（7）計算：

式中：G20=淀粉水解20 min 酶解液的葡萄糖含量（mg）；FG=初始葡萄糖含量（mg）；G120=淀粉水解120 min 酶解液的葡萄糖含量（mg）；TS=樣品總淀粉含量（mg）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各組實驗均至少重復(fù)測定3 次，使用Excel 2019 進(jìn)行RDS、SDS、RS、溶解度和白度等數(shù)據(jù)計算和分析，利用SPSS 25 軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)偏差計算和單因素方差分析，使用Origin 2021 進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種抗性糊精的微觀結(jié)構(gòu)分析

抗性糊精和原淀粉樣品的掃描電子顯微鏡圖如圖1 所示。NCS 和WCS 顆粒表面光滑，呈均勻圓球或多面體的典型A 型淀粉結(jié)構(gòu)特征[22]?？剐院珮悠酚捎谠谥苽溥^程中顆粒結(jié)構(gòu)遭到破壞，表面形態(tài)較為粗糙，主要歸因于淀粉顆粒糊化后，淀粉中的大部分氫鍵斷裂，雙螺旋打開，支鏈和直鏈溶出，然后在脫支酶的作用下，使支鏈淀粉中的α-1,6 糖苷鍵斷裂，形成長短不一的直鏈分子鏈產(chǎn)物，通過分子重排結(jié)晶而形成不規(guī)則形狀的小碎片聚集體。與NRD相比，WRD 表面更為粗糙，碎片化程度更高，可能是WCS 支鏈淀粉含量高（95%以上），在脫支和重結(jié)晶過程中脫支更完全，造成其含有的支鏈淀粉含量顯著下降[23]。

圖1 抗性糊精及其原淀粉的掃描電子顯微鏡圖Fig.1 Scanning electron microscope diagram of resistant dextrins and their native starch

2.2 兩種抗性糊精的熱力學(xué)特性分析

抗性糊精及其原淀粉樣品的熱力學(xué)特征值如表1 所示。與天然淀粉相比，抗性糊精的糊化溫度（起始溫度To，峰值溫度Tp和終止溫度Tc）顯著升高（P＜0.05），表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性，主要歸因于酶解脫支釋放出的線形短直鏈淀粉分子經(jīng)過重結(jié)晶形成了熱穩(wěn)定性更強(qiáng)的結(jié)構(gòu)[22]。WCS 和NCS 的焓值（ΔH）分別為：17.13±0.63 和21.41±0.89 J/g，而WRD和NRD 的ΔH 分別為9.79±1.15 和2.28±0.18 J/g。與原淀粉相比，抗性糊精的ΔH 顯著降低（P＜0.05），說明原淀粉在脫支和重結(jié)晶過程中，其支鏈淀粉中的雙螺旋結(jié)構(gòu)經(jīng)酶解脫支作用，結(jié)晶結(jié)構(gòu)遭到了破壞。WRD 的焓值下降幅度低于NRD，這說明WRD 容易脫支形成較多的線性直鏈分子，有利于在結(jié)晶過程中淀粉分子的重排形成更加致密的聚集體，這可能是WRD 形貌更粗糙、碎片化程度更高的原因（圖1）。

2.3 兩種抗性糊精的結(jié)晶特性分析

抗性糊精及其原淀粉的X-衍射圖譜及結(jié)晶度如圖2 所示。NCS 和WCS 的結(jié)晶圖譜在15°、17°、18°和23°有強(qiáng)衍射峰，且在17°和18°附近呈現(xiàn)雙衍射峰，為典型的A 型晶體結(jié)構(gòu)[24]。與原淀粉相比，不同種類玉米淀粉制備的抗性糊精的結(jié)晶型和結(jié)晶度呈現(xiàn)出不同的變化趨勢。與WCS 相比，WRD 的晶型未發(fā)生明顯變化，結(jié)晶度呈現(xiàn)增加趨勢，表明經(jīng)普魯蘭酶酶解脫支后支鏈淀粉的線性鏈容易形成雙螺旋[25]。與NCS 相比，NRD 的結(jié)晶圖譜在15°和18°的衍射峰強(qiáng)度下降，由23°的強(qiáng)衍射峰轉(zhuǎn)變?yōu)?2°和24°的雙衍射峰，呈現(xiàn)出典型的B 型晶體結(jié)構(gòu)，這是因為脫支的淀粉鏈在50 ℃下很容易結(jié)晶成B 型排列，而快速鏈締合結(jié)晶通常也會誘導(dǎo)形成完美度相對較低的B 型晶體[19]。另一方面，WRD 的結(jié)晶高于NRD，這可能是WRD 在糊化和脫支過程中生成了更多的短直鏈分子鏈產(chǎn)物，脫支更完全，并在溫和加熱的條件下緩慢締合形成了結(jié)晶度更高的A 型晶體[26]。

圖2 抗性糊精及其原淀粉的X-衍射圖譜Fig.2 X-ray diffraction patterns of resistant dextrins and their native starch

2.4 兩種抗性糊精的顯微紅外光譜分析

抗性糊精及其原淀粉的紅外光譜圖如圖3 所示。由圖3 可知，原淀粉表現(xiàn)出在2920～2940 cm-1的C-H 伸縮振動峰，1640～1150 cm-1的C=O 伸縮振動峰，1000～990 cm-1處的吡喃糖環(huán)的特征吸收峰[27]。與原淀粉相比，抗性糊精的吸收峰位置未發(fā)生明顯的變化，說明抗性糊精在形成的過程中未產(chǎn)生新的官能團(tuán)，脫支和重結(jié)晶不會改變淀粉的結(jié)構(gòu)，與張穎[28]和張婷等[29]的研究結(jié)果保持一致。但抗性糊精與原淀粉在吸收峰強(qiáng)度上存在差異，這可能歸因于制備過程中發(fā)生的糖苷鍵斷裂和聚合反應(yīng)[30]。

圖3 抗性糊精及其原淀粉的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of resistant dextrins and their native starch

2.5 兩種抗性糊精的溶解度和白度分析

溶解度是評判抗性糊精在飲料等行業(yè)中應(yīng)用的關(guān)鍵指標(biāo)?？剐院捌湓矸鄣娜芙舛群桶锥热鐖D4 所示。與原淀粉相比，抗性糊精的溶解度顯著增加（P＜0.05），這是因為在脫支酶的作用下，淀粉顆粒的無定形區(qū)、空間結(jié)構(gòu)和結(jié)晶區(qū)被破壞，降解生成更多可溶性的小分子物質(zhì)[31]，隨后再聚合生成可溶性更高的抗性糊精。如圖4 所示，NRD 的白度顯著增加（P＜0.05），而WRD 的白度略有下降，這說明經(jīng)復(fù)合酶解工藝制備的抗性糊精具有優(yōu)良的產(chǎn)品色澤。

圖4 抗性糊精及其原淀粉的溶解度（A）和白度（B）Fig.4 Solubility (A) and whiteness (B) of resistant dextrins and their native starch

2.6 兩種抗性糊精的核磁共振波譜分析

核磁共振波譜能分析抗性糊精樣品的分子結(jié)構(gòu)及糖苷鍵的類型，本研究采用1H-NMR 分析抗性糊精及其原淀粉的糖苷鍵結(jié)構(gòu)及其變化?？剐院捌湓矸鄣囊痪S氫譜如圖5 所示。由圖5（A）可知，與NCS 相比，NRD 在δ4.5～5.5×10-6區(qū)域內(nèi)有5.39、5.21、4.63 和4.64 ppm 處出現(xiàn)了新的異頭氫信號。由圖5（B）可知，與WCS 相比，WRD 在δ4.5～5.5×10-6區(qū)域內(nèi)有5.44、5.43、5.26、5.25、4.69、4.67 和4.69 ppm 處出現(xiàn)了新的異頭氫信號。其中，4.79 ppm為D2O 質(zhì)子峰，α型吡喃糖H-1 質(zhì)子的化學(xué)位移大于4.95 ppm，β型吡喃糖H-1 質(zhì)子的化學(xué)位移小于4.95 ppm[32]。與原淀粉相比，抗性糊精有β型吡喃糖和新的α型吡喃糖生成，表明原淀粉在糊化、脫支和重結(jié)晶過程中形成了新的糖苷鍵，進(jìn)一步證實了抗性糊精在制備過程中發(fā)生了糖苷鍵的斷裂和轉(zhuǎn)糖苷化反應(yīng)，而導(dǎo)致其糖環(huán)發(fā)生了振動[33]，這與上述紅外光譜的分析結(jié)果相一致。

圖5 抗性糊精及其原淀粉的一維氫譜圖Fig.5 One-dimensional hydrogen spectra of resistant dextrins and their native starch

2.7 兩種抗性糊精的體外消化性分析

抗性糊精及其原淀粉的體外消化特性如圖6 所示。兩種抗性糊精及其原淀粉的RDS 含量排序依次是：WCS＞NCS＞W(wǎng)RD＞NRD，SDS 含量排序依次是：NRD＞W(wǎng)RD＞NCS＞W(wǎng)CS，RS 含量排序依次是：NRD＞NCS＞W(wǎng)RD＞W(wǎng)CS。與原淀粉相比，兩種抗性糊精的消化率明顯下降，表現(xiàn)為RDS 含量顯著下降，SDS 和RS 含量顯著升高（P＜0.05）。兩種抗性糊精相比之下，NRD 的SDS 和RS 含量最高均高于WRD，具有更好的抗消化性。導(dǎo)致其抗消化性增加的原因有以下三點：a.本研究制備的抗性糊精具有較高的熱穩(wěn)定性，這有助于提高其對淀粉消化酶的抵抗力[34]，是導(dǎo)致抗性糊精難消化的原因之一。經(jīng)脫支得到的短直鏈線性分子通過去除淀粉中限制鏈結(jié)合的支鏈鍵而獲得流動性，隨著去分支的繼續(xù)，淀粉分散度變薄，這促進(jìn)了分子間的結(jié)合和雙螺旋結(jié)構(gòu)的形成[15]，從而使抗性糊精的熱穩(wěn)定性提高、抗消化性提高。b.酶水解純化提高了RD 的結(jié)晶度，從而增加了抗性糊精對消化酶的抗性[35]。c.淀粉經(jīng)糊化、脫支和重結(jié)晶過程發(fā)生了糖苷鍵的斷裂和轉(zhuǎn)糖苷化反應(yīng)，經(jīng)分子重排生成了一些抗消化的糖苷鍵例如β型吡喃糖和新的α型吡喃糖等，從而提高了抗性糊精對酶的抗消化性。

圖6 抗性糊精及其原淀粉的體外消化特性Fig.6 In vitro digestive properties of resistant dextrins and their native starch

3 結(jié)論

本研究以普通玉米淀粉和蠟質(zhì)玉米淀粉為原料，采用綠色環(huán)保的脫支、重結(jié)晶結(jié)合酶水解工藝制備抗性糊精。通過脫支、重結(jié)晶和酶水解得到的兩種抗性糊精表面粗糙，呈不規(guī)則形狀的小碎片聚集體，熱穩(wěn)定性高，溶解度增加，具有優(yōu)良的色澤。NRD呈典型的B 型結(jié)晶結(jié)構(gòu)，而WRD 呈典型的A 型結(jié)晶結(jié)構(gòu)。在酶解脫支處理中，原有的糖苷鍵斷裂，重新結(jié)晶聚合產(chǎn)生新的不易被淀粉酶消化的糖苷鍵，使抗性糊精的抗消化性增加，其中，NRD 的慢消化和抗消化性最好。本研究將為進(jìn)一步拓寬抗性糊精的綠色環(huán)保制備方法及其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供新的思路和理論指導(dǎo)。