應(yīng)思慧，魯 森，陳忠正，張媛媛，李 斌，林曉蓉

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）

茶葉為當(dāng)今世界三大無酒精飲料之一，以其抗氧化[1]、抗炎[2]、抗癌[3]、益思提神[4]、降壓減脂[5-6]等健康功效而廣受人們喜愛。茶多酚是茶葉中具有突出健康功效的主要理化組分，其含量約占茶葉干重的18%～36%，其中以兒茶素類占比最高，達(dá)茶多酚類總量的70%～80%[7]。兒茶素是一類以2-苯基苯并二氫吡喃環(huán)為基本結(jié)構(gòu)的黃烷醇類化合物，包括表兒茶素（epicatechin，EC）、兒茶素（catechin，C）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、沒食子兒茶素（gallocatechin，GC）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、兒茶素沒食子酸酯（catechin gallate，CG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）和沒食子兒茶素沒食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）等8 種主要單體（圖1），具有抗氧化、消炎、抗癌、神經(jīng)保護(hù)與抗腫瘤細(xì)胞血管生成等多種功能特性[8]。根據(jù)B 環(huán)羥基數(shù)目，可將8 種兒茶素單體分為焦酚型（B 環(huán)為含有三個羥基的沒食子基，包括EGC、GC、EGCG、GCG）和兒茶酚型（B 環(huán)為含有兩個相鄰羥基的兒茶酚基，包括EC、C、ECG、CG）；根據(jù)C 環(huán)C3連接基團(tuán)，可分為酯型（C 環(huán)C3的-OH 與沒食子酸酯化形成沒食子?；‥CG、CG、EGCG、GCG）和非酯型（EC、C、EGC、GC）；根據(jù)C 環(huán)C2、C3不同取代基的空間位置，又可分為順式構(gòu)象（C2上的B 環(huán)和C3上的羥基或沒食子酰基在環(huán)平面的同一側(cè)，包括EC、EGC、ECG、EGCG）和反式構(gòu)象（C2上的B 環(huán)和C3上的羥基或沒食子?；辉诃h(huán)平面的同一側(cè)，包括C、GC、CG、GCG）[7]。

圖1 8 種兒茶素單體的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of eight catechin monomers

兒茶素的功能活性與其化學(xué)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。研究表明，酯型兒茶素比非酯型兒茶素具有更強(qiáng)的抗氧化[9-10]、抗腫瘤增殖[11-13]、抗肥胖[14-15]、抗過敏[16]等活性；焦酚型兒茶素B 環(huán)的鄰苯三酚結(jié)構(gòu)有助于增強(qiáng)其抗氧化[17-18]、抗腫瘤[19]活性，但焦酚型兒茶素抑制口腔腫瘤細(xì)胞增殖[20]和自由基引起的大鼠肝臟微粒過氧化等活性[21]低于兒茶酚型結(jié)構(gòu)；反式兒茶素GCG 的抗動脈粥樣硬化[22]、抗糖尿病[23]、降膽固醇和降血脂[24]等作用均比其順式構(gòu)象EGCG 更強(qiáng)，但二者抗癌[25]、抗過敏活性[26]相當(dāng)。這些研究說明，兒茶素B 環(huán)、C 環(huán)的取代基類型和空間位置會影響其抗氧化、抗癌等生物活性的發(fā)揮，但這種構(gòu)效關(guān)系背后的分子機(jī)制尚未完全闡明。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)、生物信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)科學(xué)等多學(xué)科發(fā)展起來的新興學(xué)科，主要利用基因、蛋白質(zhì)、疾病、藥物等網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫的豐富信息，通過計算機(jī)、分析軟件、算法等，分析藥物對基因、靶點(diǎn)、通路和疾病的干預(yù)和影響，從而闡釋藥物的系統(tǒng)性藥理機(jī)制，指導(dǎo)多靶點(diǎn)新藥的設(shè)計和研發(fā)[27-28]，為揭示兒茶素等天然產(chǎn)物、藥物等多靶點(diǎn)、多途徑的分子作用機(jī)制提供了新的研究策略。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7 中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫；胰蛋白酶-EDTA 溶液（0.25%）、羅斯韋爾公園紀(jì)念研究所1640 培養(yǎng)基（RPMI 1640）、杜氏磷酸鹽緩沖液（DPBS，pH 為7.0～7.3）、南美胎牛血清（FBS）美國Gibco 公司；杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基高糖培養(yǎng)基（DMEM，含酚紅）、青霉素（100 U/mL）/鏈霉素（100 μg/mL）、L-谷氨酰胺 美國Hyclone 公司；EC（≥98%）、C（≥98%）、EGC（≥98%）、GC（≥98%）、ECG（≥98%）、CG（≥98%）、EGCG（≥98%）、GCG（≥98%）、臺盼藍(lán)、噻唑藍(lán)粉末（MTT）上海源葉生物科技有限公司；LPS、二甲基亞砜（DMSO）美國Sigma-Aldrich 公司；25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶 丹麥Nunc公司；Coster 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板 美國Corning 公司。

BS 124S/ BT 25S 電子天平 瑞士Mettle Toledo公司；Milli-Q Integral 3 純水機(jī) 德國Merck-Millipore 公司；VersaMax 酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices 公司；AIRTECH 超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；GHP-9080 隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HERAcell 150i CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo 公司；QYC-200 恒溫培養(yǎng)搖床 上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；Vortex-5 渦旋混合儀 江蘇麒麟醫(yī)用儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 經(jīng)解凍復(fù)蘇后，置于含5%的CO2培養(yǎng)箱（37 ℃）中培養(yǎng)，培養(yǎng)液成分為88%的DMEM 高糖培養(yǎng)基（含酚紅）、1%青霉素（100 U/mL）/鏈霉素（100 μg/mL）溶液（雙抗）、10%胎牛血清（FBS）與1% L-谷氨酰胺（4 mmol/L），每2～3 d 繼代一次；人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 經(jīng)解凍復(fù)蘇后，置于含5%的CO2培養(yǎng)箱（37 ℃）中培養(yǎng)，培養(yǎng)液組成為89% RPMI 1640 培養(yǎng)基、10% FBS 及1%雙抗，每3～4 d 繼代一次。

1.2.2 兒茶素體外抗炎活性評價 參考Zhang 等[29]方法并作適當(dāng)調(diào)整，具體操作如下：RAW264.7 細(xì)胞以5×105個/mL 的濃度接種到96 孔培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞液體積為200 μL，于5%的CO2培養(yǎng)箱（37 ℃）中培養(yǎng)24 h。吸去舊培養(yǎng)基，按順序添加100 μL 不同濃度的兒茶素溶液及100 mL LPS 溶液（終濃度為1 μg/mL），混勻，于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.2.1 NO 產(chǎn)生百分比測定 吸取100 μL 上清液至新的96 孔培養(yǎng)板，并加入100 μL 的Griess 試劑，避光靜置10 min 后，用酶標(biāo)儀測定其在542 nm 波長處的吸光值，按照公式（1）計算NO 產(chǎn)生百分比（%）。

式中：ALPS表示僅添加LPS、未添加樣品時的吸光值，ALPS顏色對照表示未添加細(xì)胞、僅添加LPS 時的吸光值；A樣品表示添加LPS 和樣品共培養(yǎng)后的吸光值，A樣品顏色對照表示無細(xì)胞情況下添加LPS 和樣品時的吸光值。計算空白組的NO 產(chǎn)生量時，A樣品表示未添加樣品時培養(yǎng)基的吸光值，并將LPS 組的NO 產(chǎn)生量記為100%。

1.2.2.2 細(xì)胞存活率測定 參考Mosmann[30]的方法并作適當(dāng)調(diào)整，具體操作如下：將舊96 孔培養(yǎng)板中剩余細(xì)胞液棄去，每孔加入0.05 mg/L 的MTT 溶液100 μL，37 ℃培養(yǎng)1 h，棄去MTT 溶液，每孔加入200 μL 的DMSO 溶液，于37 ℃、轉(zhuǎn)速100 r/min 的搖床中振蕩處理15 min。吸取150 μL 上清液，用酶標(biāo)儀測定其在波長550 nm 處的吸光值，按照公式（2）計算細(xì)胞存活率（%）。

那年部隊來征兵，招財報名，所幸的是老支書慶高伯卸職去公社林場了，不然的話會是第一個就被刷下來。他在部隊幾年，是站崗、放哨？還是練武、殺鬼子？誰也不知道。他娘桃娭毑也不知道。他雖然小時候讀過三個一年級，兩個二年級，后來還混到四年級，可他不會寫信，就是寫了信寄回來，桃娭毑也不會看，她扁擔(dān)倒地，一字不識。

式中：A樣品表示細(xì)胞與樣品共培養(yǎng)時的吸光值，A空白表示未添加樣品，細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)時的吸光值。

1.2.3 兒茶素體外抗癌活性評價 將HCT116 細(xì)胞以2.5×104個/mL 的濃度接種到96 孔培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞液體積為200 μL，于含5%的CO2培養(yǎng)箱（37 ℃）中培養(yǎng)24 h。吸出100 μL 上清液至新的96 孔培養(yǎng)板，每孔加入50 μL 兒茶素溶液與50 μL含F(xiàn)BS 的培養(yǎng)基，空白組每孔加入100 μL 含F(xiàn)BS培養(yǎng)基，充分混勻，于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.3.1 細(xì)胞存活率測定 參考Mosmann[30]的方法并作適當(dāng)調(diào)整，具體操作如下：取出96 孔培養(yǎng)板并棄去細(xì)胞液，每孔加入0.25 mg/L 的MTT 溶液100 μL，37 ℃培養(yǎng)2 h，棄去MTT 溶液，每孔加入200 μL 的DMSO 溶液，于37 ℃、轉(zhuǎn)速100 r/min 搖床中振蕩處理15 min。吸取150 μL 上清液，用酶標(biāo)儀測定其在波長550 nm 處的吸光值，按照公式（2）計算細(xì)胞存活率。

1.2.4 兒茶素抗炎、抗癌作用機(jī)制預(yù)測

1.2.4.1 抗炎、抗癌靶點(diǎn)篩選 參考王騰飛等[31]的方法并作調(diào)整，具體操作如下：使用PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索8 種兒茶素的SMILES 號，將其導(dǎo)入SIWSS 數(shù)據(jù)庫（http://swisstargetprediction.ch/）中，預(yù)測其作用靶點(diǎn)，去除重復(fù)靶點(diǎn)后，作為兒茶素的潛在作用靶點(diǎn)。以“inflammation”、“cancer”為關(guān)鍵詞，分別在人類基因GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）、孟德爾遺傳代謝OMIM 數(shù)據(jù)庫（https://omim.org/）、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫（https://www.disgenet.org/）和TTD數(shù)據(jù)庫（http://bid.nus.edu.sg/group/cjttd/）中進(jìn)行檢索，收集炎癥、癌癥相關(guān)靶點(diǎn)，合并去除重復(fù)后，使用Venny 2.1.0 網(wǎng)站（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）繪制兒茶素潛在作用靶點(diǎn)與炎癥、癌癥相關(guān)靶點(diǎn)的韋恩圖，根據(jù)二者交集確定8 種兒茶素的潛在抗炎、抗癌作用靶點(diǎn)。利用STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）對潛在靶點(diǎn)做蛋白相互作用（Protein-protein interaction，PPI）分析，物種設(shè)定為“Homo sapiens”，將得到的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件，根據(jù)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)篩選關(guān)鍵抗炎、抗癌靶點(diǎn)。

1.2.4.2 GO 功能富集和 KEGG 通路富集 利用計算機(jī)R 語言中“ClusterProfiler”、“enrichplot”和“org.s.eg.db”等程序包對兒茶素的潛在抗炎、抗癌靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集和KEGG 通路富集分析，根據(jù)P值大小（P值＜0.05）分別篩選生物過程（BP）、細(xì)胞組成（CC）與分子功能（MF）的富集結(jié)果，并通過富集條目數(shù)的可視化顯示排名前10 的功能和通路。

1.2.4.3 組分-靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將8 種兒茶素及其潛在抗炎、抗癌作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.8.0 軟件，繪制其組分-靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，節(jié)點(diǎn)（node）代表兒茶素、通路、疾病和作用靶點(diǎn)，邊（edge）代表組分、通路、疾病和作用靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。

1.2.4.4 分子對接 以8 種兒茶素為配體，以其抗炎、抗癌關(guān)鍵靶點(diǎn)為受體，利用AutoDock 分子模擬軟件進(jìn)行分子對接模擬，根據(jù)對接結(jié)合能分析兒茶素與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合能力，利用PyMOL 軟件對結(jié)合能最低的組合進(jìn)行可視化處理，并利用Discovery Studio 2019 Client 軟件作二維示意圖。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗含三次平行、兩次重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用鄧肯多重檢驗進(jìn)行顯著性分析，不同小寫字母表示組間差異顯著（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 8 種兒茶素的體外抗炎活性比較

巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS 刺激會產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)NO，通過檢測細(xì)胞上清液中NO 的產(chǎn)生百分比，能夠反映細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)的強(qiáng)弱程度[32]。為初步分析兒茶素的體外抗炎活性及其構(gòu)效關(guān)系，本研究采用MTT 法和Griess 試劑法比較分析了8 種兒茶素對LPS 處理的RAW 264.7 細(xì)胞存活率及炎性介質(zhì)NO 產(chǎn)生百分比的影響，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 8 種兒茶素處理RAW 264.7 細(xì)胞的存活率和NO 產(chǎn)生百分比Fig.2 Cell viability and production percentage of NO of RAW 264.7 cells treated with eight catechins

由圖2 可知，與LPS 單獨(dú)處理組相比，空白組的NO 產(chǎn)生百分比不足3.83%；與空白組相比，LPS單獨(dú)處理對RAW264.7 的細(xì)胞存活率無顯著影響，說明LPS 處理24 h 能夠顯著刺激RAW264.7 細(xì)胞產(chǎn)生炎性介質(zhì)NO，且不存在明顯的細(xì)胞毒性，表明體外炎癥細(xì)胞模型建立成功。與LPS 單獨(dú)處理組相比，CG、ECG、GC、EGC、C、EC 在15～480 μg/mL濃度范圍，GCG、EGCG 在5.625～180 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率均大于50%，而其NO 產(chǎn)生百分比隨兒茶素濃度升高而不斷降低，說明8 種兒茶素單體均能有效抑制LPS 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO；但不同兒茶素對NO 產(chǎn)生的抑制作用存在明顯差異，根據(jù)其抑制NO 產(chǎn)生的IC50，各兒茶素單體對NO 的抑制作用強(qiáng)弱依次為：GCG＞EGCG＞GC＞CG＞EGC＞ECG＞C、EC。這一結(jié)果表明，當(dāng)其他取代基類型和空間位置相同時，酯型兒茶素的體外抗炎活性強(qiáng)于其非酯型結(jié)構(gòu)（GCG＞GC，EGCG＞EGC，CG＞C，ECG＞EC），焦酚型兒茶素的體外抗炎活性強(qiáng)于兒茶酚型（GCG＞CG，EGCG＞ECG，GC＞C，EGC＞EC）；對于酯型兒茶素或焦酚型兒茶素，反式構(gòu)象強(qiáng)于其順式構(gòu)象（GCG＞EGCG，GC＞EGC，CG＞ECG）。由此可知，D 環(huán)沒食子酰基、B 環(huán)的鄰苯三酚結(jié)構(gòu)能夠增強(qiáng)兒茶素的體外抗炎活性，且當(dāng)D 環(huán)和B 環(huán)不在同一側(cè)時更利于兒茶素體外抗炎活性的發(fā)揮。

2.2 8 種兒茶素的體外抗癌活性比較

為探討兒茶素結(jié)構(gòu)與抗癌活性的關(guān)系，本研究采用MTT 法比較分析了8 種兒茶素單體對人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 增殖的影響，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 8 種兒茶素單體和人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 共培養(yǎng)的細(xì)胞存活率Fig.3 Cell viability of human colorectal carcinoma cells HCT116 co-cultured with eight catechin monomers

由圖3 可知，人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 與8 種兒茶素單體共培養(yǎng)48 h 后，GC、EGC、GCG、EGCG、CG、ECG 在20～80 μg/mL 的濃度，EC、C 在50～400 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率隨兒茶素濃度升高而顯著降低，說明8 種兒茶素單體均能有效抑制HCT116 細(xì)胞的增殖；根據(jù)其抑制細(xì)胞增殖的IC50值，8 種兒茶素單體對HCT116 細(xì)胞增殖的抑制作用大小依次為：GC＞EGC＞GCG＞EGCG＞CG＞ECG＞EC＞C。構(gòu)效關(guān)系分析顯示，所有焦酚型兒茶素（GC、EGC、GCG、EGCG）的體外抗腫瘤增殖活性均強(qiáng)于兒茶酚型（CG、ECG、C、EC）；在4 種焦酚型兒茶素中，非酯型結(jié)構(gòu)的抗腫瘤活性強(qiáng)于酯型結(jié)構(gòu)，但在4 種兒茶酚型兒茶素中，酯型結(jié)構(gòu)的體外抗腫瘤活性比非酯型更強(qiáng)，對于酯型兒茶素或焦酚型兒茶素，反式構(gòu)象的抗腫瘤活性強(qiáng)于其順式構(gòu)象（GC＞EGC，GCG＞EGCG，CG＞ECG）。這些結(jié)果表明，鄰苯三酚結(jié)構(gòu)是兒茶素發(fā)揮抗腫瘤活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，其中，B 環(huán)具有鄰苯三酚結(jié)構(gòu)能夠增強(qiáng)不同結(jié)構(gòu)兒茶素的抗腫瘤增殖活性，但D 環(huán)沒食子?；鶅H在B 環(huán)為鄰苯雙酚結(jié)構(gòu)時才能增強(qiáng)兒茶素的抗增殖活性；當(dāng)D 環(huán)和B 環(huán)不在同一側(cè)時更利于兒茶素發(fā)揮其體外抗腫瘤活性。

2.3 8 種兒茶素的抗炎、抗癌作用機(jī)制預(yù)測

為進(jìn)一步探究8 種兒茶素抗炎、抗癌的構(gòu)效機(jī)制，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測并篩選其抗炎、抗癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)，結(jié)果如圖4 所示。由圖4a 可知，通過GeneCards、TTD、OMIM 和DisGeNET 等數(shù)據(jù)庫篩選出炎癥靶點(diǎn)3092 個、癌癥靶點(diǎn)6715 個，通過SWISS 數(shù)據(jù)庫預(yù)測獲得8 種兒茶素的潛在作用靶點(diǎn)86 個，通過韋恩圖分析三者交集靶點(diǎn)，篩選出兒茶素的抗炎、抗癌靶點(diǎn)各59 個，其中相同靶點(diǎn)48 個。對兒茶素抗炎、抗癌靶點(diǎn)的PPI 分析結(jié)果顯示，8 種兒茶素發(fā)揮抗炎活性涉及IL6、原癌基因表達(dá)蛋白JUN、MMP-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metallopeptidase 9，MMP-9）、過氧化物酶體增殖物活化受體-γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARG）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶-2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、TNF、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine kinase1，AKT1）、淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3，CASP3）、趨化因子配體-2（C-C motif chemokine ligand 2，CCL2）、上皮鈣黏蛋白（E cadherin，CDH1）、雌激素受體-1（estrogen receptor 1，ESR1）、缺氧誘導(dǎo)因子1-α（hypoxia-inducible factor 1-alpha，HIF1A）和熱休克蛋白（heat shock protein 90-alpha，HSP90AA1）共16 個靶點(diǎn)（圖4b）；抗癌活性涉及IL6、JUN、MMP-9、PPARG、PTGS2、TNF、VEGFA、AKT1、CASP3、CCL2、CDH1、ESR1、HIF1A、HSP90AA1 等14 個關(guān)鍵靶點(diǎn)（圖4c），且14 個癌癥靶點(diǎn)均包含于16 種關(guān)鍵炎癥靶點(diǎn)中。炎癥的持續(xù)發(fā)展有可能導(dǎo)致癌癥的發(fā)生，這與許多慢性炎癥的誘因會增加癌癥感染的風(fēng)險有關(guān)，大多數(shù)誘因的關(guān)鍵在于包括IL1、IL6、TNF、IL23 等炎癥細(xì)胞因子和NF-κB 等轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)的炎性介質(zhì)聚集于腫瘤組織中，從而誘發(fā)組織中惡性細(xì)胞的增殖、促進(jìn)血管生成及腫瘤轉(zhuǎn)移[33-37]。由此說明，8 種兒茶素單體可通過作用于相關(guān)炎癥、癌癥靶點(diǎn)發(fā)揮抗炎、抗癌活性。

圖4 8 種兒茶素單體的抗炎、抗癌靶點(diǎn)Fig.4 Anti-inflammatory and anti-cancer targets of eight catechin monomers

根據(jù)上述8 種兒茶素單體的48 個抗炎、抗癌靶點(diǎn)，采用GO 功能富集和KEGG 通路富集分析，并對排名前10 的條目和通路進(jìn)行可視化處理，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 8 種兒茶素單體抗炎、抗癌靶點(diǎn)的GO 功能富集（a）和KEGG 通路富集（b）Fig.5 GO functional enrichment (a) and KEGG pathway enrichment (b) of the anti-inflammatory and anti-cancer targets of eight catechin monomers

GO 功能注釋分析顯示生物過程相關(guān)條目1586個、細(xì)胞組成相關(guān)條目46 個、分子功能相關(guān)條目95 個，KEGG 富集顯示相關(guān)通路20 條。由圖5 可知，8 種兒茶素單體的抗炎、抗癌靶點(diǎn)參與氧化應(yīng)激響應(yīng)、平滑肌細(xì)胞凋亡的正向調(diào)節(jié)、白細(xì)胞遷移、腺體發(fā)育、缺氧響應(yīng)、多肽響應(yīng)、金屬離子響應(yīng)等生物過程，位于膜筏、γ-氨基丁酸A 型受體、肽酶抑制劑復(fù)合物、膜微區(qū)、細(xì)胞前沿、髓鞘、離子通道復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)囊泡等細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成部位，富集的分子功能涉及調(diào)節(jié)絲氨酸型內(nèi)肽酶、絲氨酸水解酶、內(nèi)肽酶等酶活性，調(diào)控遞質(zhì)門控離子通道活性與細(xì)胞外配體門控離子通道活性，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子、細(xì)胞因子受體及轉(zhuǎn)錄共激活因子的結(jié)合，參與介導(dǎo)氮代謝、HIF-1 信號通路、甲狀腺激素信號通路、AGE-RAGE 信號通路、癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)、腫瘤miRNA、腫瘤蛋白聚糖、膀胱癌及胃癌的相關(guān)腫瘤信號通路等通路。此分析顯示，兒茶素的抗炎、抗癌功效具有多靶點(diǎn)、多通路的特性。

進(jìn)而利用8 種兒茶素及其抗炎、抗癌靶點(diǎn)和KEGG 通路富集的前20 條通路，構(gòu)建兒茶素抗炎、抗癌的“組分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)模型，結(jié)果如圖6 所示，其中，藍(lán)色、紅色、紫色節(jié)點(diǎn)分別表示組分、靶點(diǎn)、通路。通過分析度值、平均最短路徑及介值等拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，比較各兒茶素的抗炎、抗癌活性，結(jié)果如表1 所示。由表1 度值比較可知，各兒茶素單體的抗炎活性強(qiáng)弱依次為：CG＞GCG＞ECG＞EGCG＞EC＞C＞EGC、GC；抗癌活性強(qiáng)弱依次為：CG＞GCG＞ECG、EGCG＞EC＞C＞EGC＞GC。8 種兒茶素的抗炎、抗癌活性顯示了相近的變化趨勢，即4 種酯型兒茶素（CG、GCG、ECG、EGCG）的抗炎、抗癌活性強(qiáng)于非酯型兒茶素（EC、C、EGC、GC）；酯型兒茶素中，反式構(gòu)象（CG、GCG）的抗炎、抗癌活性強(qiáng)于順式構(gòu)象（ECG、EGCG），但非酯型兒茶素以順式構(gòu)象的活性更強(qiáng)；當(dāng)其他取代基類型和空間位置相同時，兒茶酚型兒茶素的抗炎活性強(qiáng)于焦酚型（CG＞GCG，ECG＞EGCG，EC＞EGC，C＞GC）；除ECG 外，其他兒茶酚型兒茶素的抗癌活性強(qiáng)于其焦酚型結(jié)構(gòu)（CG＞GCG，EC＞EGC，C＞GC）。這些預(yù)測結(jié)果提示，D 環(huán)沒食子?；莾翰杷嘏c多靶點(diǎn)相互作用的關(guān)鍵基團(tuán)，該結(jié)構(gòu)有利于兒茶素作用于多個抗炎、抗癌靶點(diǎn)；當(dāng)C 環(huán)的C3連接D 環(huán)時，D 環(huán)和B 環(huán)上不在同一側(cè)有利于兒茶素與其抗炎、抗癌靶點(diǎn)結(jié)合，如果C3連接羥基，則羥基與B 環(huán)在同一側(cè)更利于兒茶素與靶點(diǎn)相互作用；B 環(huán)鄰苯三酚結(jié)構(gòu)不利于大部分兒茶素與其抗炎、抗癌靶點(diǎn)相互作用。

表1 8 種兒茶素單體抗炎、抗癌活性的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)Table 1 Topological parameters of the anti-inflammatory and anti-cancer activities of eight catechin monomers

圖6 兒茶素抗炎（a）和抗癌（b）的組分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Component-target-pathway networks of catechins for anti-inflammatory (a) and anti-cancer (b)

2.4 8 種兒茶素與關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白的相互作用

為進(jìn)一步探究8 種兒茶素的抗炎、抗癌作用機(jī)制，在上述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出的關(guān)鍵抗炎、抗癌靶點(diǎn)基礎(chǔ)上，本研究選取其中度值最高的IL6、TNF 和AKT1 三個靶點(diǎn)蛋白，采用分子對接技術(shù)模擬兒茶素與3 個靶點(diǎn)蛋白的相互作用，計算二者的結(jié)合能，并選取其中結(jié)合能最低的組合進(jìn)行可視化處理，結(jié)果如表2 和圖7 所示。

表2 8 種兒茶素單體與3 種靶蛋白的結(jié)合能（kcal/mol）Table 2 Binding energy of eight catechin monomers to three target proteins (kcal/mol)

圖7 ECG-TNF（a）、CG-IL6（b）、EGCG-AKT1（c）的分子結(jié)合可視化圖Fig.7 Visualization of molecular binding of ECG-TNF (a),CG-IL6 (b),and EGCG-AKT1 (c)

由表2 可知，8 種兒茶素和IL6、TNF 和AKT1三個靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合能均小于-5.5 kcal/mol，表明各兒茶素與3 個靶點(diǎn)蛋白均有較強(qiáng)的結(jié)合能力；各組分中，以ECG-TNF、CG-IL6 和ECG-AKT1 的結(jié)合能最低；8 種兒茶素與IL6 的結(jié)合能力大小依次為：CG＞GCG、EGCG＞C＞ECG＞GC＞EC、EGC；與TNF的結(jié)合能力強(qiáng)弱依次為：ECG＞EGCG＞CG＞GC＞GCG、C＞EC＞EGC；與AKT1 的結(jié)合能力大小依次為：ECG＞CG、EGCG＞GCG、C＞EGC、EC＞GC。這一結(jié)果說明，4 種酯型兒茶素與3 個關(guān)鍵靶蛋白的結(jié)合能力整體強(qiáng)于非酯型兒茶素；C2、C3立體構(gòu)象對兒茶素與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合的影響因靶蛋白不同而異，順式構(gòu)象利于兒茶素與TNF、AKT1 結(jié)合，但反式兒茶素與IL6 的相互作用強(qiáng)于其順式構(gòu)象；B 環(huán)羥基數(shù)目對兒茶素-靶蛋白相互作用的影響較復(fù)雜，但大部分兒茶酚型兒茶素與三個關(guān)鍵靶蛋白的結(jié)合能力強(qiáng)于其焦酚型結(jié)構(gòu)。進(jìn)而，利用PyMol 軟件對ECGTNF、CG-IL6、EGCG-AKT1 這3 組對接結(jié)合能較低的靶點(diǎn)與組分間的分子對接結(jié)果進(jìn)行可視化處理，由圖7 可知，ECG 通過氫鍵與TNF 的亮氨酸26、色氨酸28 和天冬酰胺46 結(jié)合，鍵長均為2.4；通過氫鍵與TNF 的丙氨酸134、異亮氨酸136 結(jié)合，鍵長分別為2.6、2.2。CG 與IL6 的精氨酸30、谷氨酰胺175 以氫鍵結(jié)合，鍵長分別為2.7、2.3；與IL6 的精氨酸179 形成3 個氫鍵，鍵長分別為2.5、2.6 和2.8；與IL6 的精氨酸182 形成2 個氫鍵，鍵長分別為2.0、2.4。EGCG 通過氫鍵與AKT1 的谷氨酸17、酪氨酸18、異亮氨酸19、精氨酸23、精氨酸25、天冬酰胺54 及精氨酸86 結(jié)合，鍵長均小于2.6。說明三種酯型兒茶素單體通過多個氫鍵與關(guān)鍵抗炎、抗癌靶點(diǎn)蛋白的不同氨基酸殘基結(jié)合，且鍵長均小于2.8，結(jié)合作用較強(qiáng)。

結(jié)合上述體外細(xì)胞模型、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果可知：a.與非酯型兒茶素相比，酯型兒茶素與關(guān)鍵靶蛋白的結(jié)合能力更強(qiáng)、作用靶點(diǎn)更多，體外抗炎、抗腫瘤活性更強(qiáng)，F(xiàn)echtner 等[38]研究同樣發(fā)現(xiàn)，酯型兒茶素EGCG 對人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞、鼻粘膜成纖維細(xì)胞和A549 支氣管上皮細(xì)胞[39]的體外抗炎活性強(qiáng)于非酯型兒茶素EGC、EC、C；Kinjo等[10]亦指出，D 環(huán)沒食子?；軌蛟鰪?qiáng)兒茶素對人胃癌細(xì)胞MK-1 的抑制活性。酯型兒茶素與關(guān)鍵抗炎、抗癌靶蛋白具有更強(qiáng)的結(jié)合能力，與其具有更多的羥基，更易與靶蛋白形成氫鍵有關(guān)，陳榆[40]指出酯型兒茶素（EGCG 和ECG）較非酯型兒茶素（EC 和EGC）與黃嘌呤氧化酶的催化活性中心有更多π-π 疏水相互作用力和氫鍵作用，說明酯型兒茶素與其結(jié)合的作用更強(qiáng)，從而阻礙底物黃嘌呤進(jìn)入活性位點(diǎn)，起到競爭性抑制，進(jìn)而阻礙黃嘌呤氧化成尿酸。b.兒茶酚型兒茶素的抗炎、抗癌靶點(diǎn)較焦酚型更多，與關(guān)鍵靶蛋白的結(jié)合能力更強(qiáng)。但焦酚型兒茶素的體外抗炎、抗癌活性更強(qiáng)，提示了除作用靶點(diǎn)數(shù)目及與IL6、TNF、AKT1 的結(jié)合能力外，存在其他因素調(diào)控B 環(huán)對兒茶素抗炎、抗癌活性的影響。雷志偉等在比較兒茶素及其類似物抗流感病毒活性的構(gòu)效關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，多酚B 環(huán)羥基的數(shù)目并非與其抗病毒活性呈正相關(guān)，B 環(huán)的多羥基結(jié)構(gòu)會引起空間位阻，不利于兒茶素活性的發(fā)揮[41]。此外，Babich 等[20]發(fā)現(xiàn)B 環(huán)的鄰苯三酚結(jié)構(gòu)可能會削弱酯型兒茶素對口腔腫瘤細(xì)胞HSC-2 的增殖抑制作用，這種現(xiàn)象可能與不同結(jié)構(gòu)兒茶素的親疏水性差異有關(guān)[19]，沒食子?；軌蛱岣邇翰杷氐氖杷?，增強(qiáng)其與細(xì)胞膜的磷脂雙分子層結(jié)合[14,42-43]，但B 環(huán)的鄰苯三酚結(jié)構(gòu)卻降低了兒茶素與磷脂雙分子層的親和力[44]。c.反式兒茶素與IL6 的結(jié)合能力較順式構(gòu)象更強(qiáng)，抗炎活性更突出。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，GCG 對LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞產(chǎn)生NO 的抑制作用強(qiáng)于EGCG，但后者對NO 合成酶（nitric oxide synthase，iNOS）的蛋白及mRNA 表達(dá)、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、IL6 的分泌等的抑制作用均強(qiáng)于GCG[45]，提示了GCG 可能通過調(diào)控iNOS、TNF-α、IL6 以外的其他靶點(diǎn)抑制NO 的產(chǎn)生。Li等[46]研究發(fā)現(xiàn)，EGCG 抑制LPS 誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞3T3-L1 產(chǎn)生單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）產(chǎn)生的作用強(qiáng)于GCG，但二者對炎癥因子白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL6）、活化的B 細(xì)胞核因子κ-輕鏈增強(qiáng)子（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NFκB）的抑制作用相當(dāng)。這些結(jié)果表明，順/反式兒茶素的抗炎活性可能因模型不同而存在差異，且可能通過多種途徑調(diào)控抗炎活性的發(fā)揮。

3 結(jié)論

本研究利用體外小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 炎癥模型和人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 癌癥模型，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，分析發(fā)現(xiàn)EGCG 等8 種兒茶素均具有較強(qiáng)的體外抗炎、抗癌活性，但其功能活性因分子結(jié)構(gòu)不同而異。其中，兒茶素分子結(jié)構(gòu)中B 環(huán)的鄰苯三酚結(jié)構(gòu)、D 環(huán)沒食子?；cC 環(huán)C2、C3的反式構(gòu)象更有利于兒茶素體外抗炎、抗癌活性的發(fā)揮，但B 環(huán)的鄰苯三酚結(jié)構(gòu)與D 環(huán)沒食子酰基之間可能具有拮抗效應(yīng)。8 種兒茶素較強(qiáng)的體外抗炎、抗癌活性得益于其與多靶點(diǎn)的相互作用，D 環(huán)沒食子?；虰 環(huán)兒茶酚型結(jié)構(gòu)能夠增強(qiáng)兒茶素與IL6、TNF 及AKT1 等多個炎癥、癌癥靶點(diǎn)的調(diào)控與相互作用，從而促進(jìn)兒茶素體外抗炎、抗癌活性的發(fā)揮。本研究探究的兒茶素抗炎、抗癌構(gòu)效關(guān)系及其作用機(jī)制的預(yù)測結(jié)果，為未來利用細(xì)胞、動物模型等深入研究兒茶素功能活性的構(gòu)效機(jī)制提供了前期的理論研究基礎(chǔ)。