韋玉衡 趙雅琪 陳 奇 周家芳 周淑棉 胡庭俊*

(1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,南寧 530004;2.貴港市動物疫病預(yù)防控制中心,貴港 537100)

偽狂犬病毒(PRV)可感染豬、羊、牛、鼠等動物,引起嚴(yán)重的臨床癥狀和急性死亡[1]。豬是其主要宿主和傳染源,各年齡段的豬只均易感染,可引起母豬繁殖障礙,仔豬出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸道癥狀和神經(jīng)癥狀,甚至死亡;豬只感染后終生帶毒,且持續(xù)排毒,豬場凈化不到位將導(dǎo)致該病反復(fù)感染,導(dǎo)致重大經(jīng)濟(jì)損失[2]。由于PRV感染侵害呼吸系統(tǒng),因此選擇肺臟為研究目標(biāo)之一。脾臟是機(jī)體最大的免疫器官,占全身淋巴組織總量的25%,含有大量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心,通過多種機(jī)制發(fā)揮抗病毒和抗腫瘤等作用,因此選擇脾臟為研究目標(biāo)之一。

除在中間宿主體內(nèi)傳播之外,Li等[3]發(fā)現(xiàn)養(yǎng)豬場環(huán)境中廣泛存在PRV污染,PRV可以通過病毒污染的污染物從豬傳播給其他動物。Liu等[4]從急性人腦炎病例中分離出一種PRV毒株,該分離株與我國PRV變異株具有密切的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和相似的病原學(xué)特征,表明PRV對公共衛(wèi)生和養(yǎng)豬業(yè)均具有潛在的威脅。

據(jù)報道,辣蓼化學(xué)成分主要包括有機(jī)酸、黃酮類和萜類等,具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗病毒、殺蟲等生物活性[5]。研究發(fā)現(xiàn),辣蓼黃酮可以通過調(diào)節(jié)病毒感染免疫細(xì)胞內(nèi)炎性因子含量來干預(yù)炎癥反應(yīng)[6]?？锬鹊萚7]研究發(fā)現(xiàn),辣蓼黃酮可以通過降低活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)含量,有效緩解脂多糖(LPS)造成的氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)。辣蓼黃酮正丁醇部分(FNB)可以使小鼠耳腫脹程度極顯著降低,表明其對小鼠具有一定的抗炎作用[8]。辣蓼總黃酮無急性毒性作用,也無亞慢性毒性作用[9]。病毒感染會導(dǎo)致小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞內(nèi)ROS、丙二醛(MDA)含量上升,超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性降低,核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)和血紅素加氧酶-1(HO-1)的mRNA和蛋白表達(dá)上升,造成氧化應(yīng)激損傷[10]?？寡趸傅谋磉_(dá)受到轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的調(diào)控[11],通過使用抗氧化劑維持機(jī)體氧化與抗氧化平衡,對病毒感染有一定的治療效果[12]。

組蛋白乙?；潜碛^遺傳學(xué)中一種重要的后修飾類型,因為它影響DNA纏繞組蛋白并包裝成染色質(zhì)的方式[13]。組蛋白乙?；怯山M蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)和組蛋白去乙酰化酶(HDAC)完成的,組蛋白乙?；癄顟B(tài)取決于HDAC和HAT活性之間的動態(tài)平衡[14]。組蛋白乙?；趦?nèi)的表觀遺傳修飾導(dǎo)致的異常表觀遺傳模式被認(rèn)為是炎癥性系統(tǒng)性疾病的發(fā)生及細(xì)胞和機(jī)體氧化應(yīng)激損傷的重要原因。研究表明,病毒通過介導(dǎo)宿主組蛋白乙?；絹碚{(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)[15]。Cao等[16]發(fā)現(xiàn),三七皂苷對豬圓環(huán)病毒2型誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和組蛋白乙?；哂姓{(diào)控作用。由于辣蓼黃酮具有良好的抗氧化和抗炎活性,我們推測其可能通過調(diào)節(jié)組蛋白乙?；讲⒄{(diào)控Nrf2氧化應(yīng)激通路相關(guān)因子的表達(dá),進(jìn)而緩解PRV感染小鼠誘導(dǎo)的脾臟和肺臟氧化應(yīng)激。

因此,本研究采用PRV感染小鼠造成其氧化應(yīng)激,通過熒光定量PCR(q-PCR)、免疫組化和蛋白免疫印跡(Western Blot)等方法,觀察辣蓼黃酮對Nrf2氧化應(yīng)激信號通路相關(guān)因子的mRNA和蛋白表達(dá)的影響,并觀察組蛋白乙?；欠袷艿秸{(diào)控,進(jìn)而闡明辣蓼黃酮緩解PRV感染小鼠誘導(dǎo)的脾臟和肺臟氧化應(yīng)激的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 病毒和藥物

豬PRV株(PRV-GXLB-2013)由廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)教研室贈予,經(jīng)測定其組織半數(shù)感染量(TCID50)=10-6.75/0.1 mL。辣蓼購自廣西壯族自治區(qū)南寧市山草堂,由廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院獸醫(yī)藥理實驗室提取總黃酮。維生素C(VC)購自索萊寶公司。

1.2 主要試劑

Trizol試劑盒購自TaKaRa公司;Nrf2抗體、HO-1抗體、依賴還原型輔酶Ⅰ(Ⅱ)醌氧化還原酶1(NQO1)抗體、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)抗體、辣根過氧化物酶連接的兔抗免疫球蛋白G(IgG)均購自Abcam公司;廣譜免疫組化檢測試劑盒購自博奧森生物技術(shù)有限公司;脫脂奶粉購自武漢賽維爾生物科技有限公司;β-肌動蛋白(β-actin)抗體、乙?；M蛋白H3(AcH3)抗體和乙酰化組蛋白H4(AcH4)抗體均購自CST公司。

1.3 試驗動物

無特定病原體(SPF)級昆明種小鼠,體重(20±2) g,雌雄各占1/2,購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(SYXK桂2014-0003)。于鼠籠恒溫飼養(yǎng),自由采食,適應(yīng)7 d以適應(yīng)新環(huán)境。

1.4 試驗設(shè)計

將60只小鼠隨機(jī)分為6組,每組10只,雌性各占1/2。6組分別為空白對照組、PRV組、VC組以及辣蓼黃酮高、中、低劑量組?？瞻讓φ战M小鼠肌肉注射杜氏改良Eagle培養(yǎng)液(DMEM)0.1 mL/只,其他5組小鼠肌肉注射聯(lián)合滴鼻接種10×TCID50PRV病毒液0.1 mL/只;2 h后,空白對照組和PRV組小鼠灌服100 mg/kg BW的DMEM,辣蓼黃酮高、中、低劑量組分別灌服200、100和50 mg/kg BW的辣蓼黃酮混懸液,VC組灌服100 mg/kg BW的VC,各組灌服量均為0.2 mL,VC及高、中、低劑量的辣蓼黃酮溶于DMEM對小鼠進(jìn)行灌胃。連續(xù)灌胃7 d,每天1次。各試驗組小鼠于感染后的第7天剖殺,取脾臟、肺臟組織測定mRNA和蛋白表達(dá)。

1.5 Nrf2氧化應(yīng)激信號通路相關(guān)mRNA及HDAC和HAT mRNA表達(dá)的測定

采樣后用Trizol法取組織總RNA,將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后,通過q-PCR方法檢測小鼠脾臟、肺臟組織中iNOS、HO-1、NQO1、Nrf2、HAT和HDAC的mRNA表達(dá)水平。各基因引物序列見表1。q-PCR結(jié)果以β-actin為內(nèi)參基準(zhǔn)分析,通過2-ΔΔCt計算各基因的表達(dá)水平。

表1 各基因引物序列

1.6 免疫組化檢測小鼠肺臟組織iNOS及Nrf2氧化應(yīng)激信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)

采樣后,將固定的組織進(jìn)行二次取材,經(jīng)梯度脫水、透明和包埋后,切下4 μm厚度的石蠟片。再對石蠟切片進(jìn)行避光阻斷、微波修復(fù)等處理,同時按1∶1 000稀釋iNOS、Nrf2、HO-1和NQO1等抗體,于4 ℃過夜孵育。而后,按1∶1稀釋二抗并孵育,經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)避光顯色和蘇木精襯染后,使用甘油明膠封片。最后在光學(xué)顯微鏡下觀察并采圖分析,通過Image J軟件計算平均光密度值。

1.7 Western Blot檢測小鼠脾臟、肺臟組織AcH3和AcH4蛋白表達(dá)

采樣后,提取小鼠脾臟、肺臟組織蛋白,測定蛋白濃度,通過Western Blot測定AcH3和AcH4的蛋白表達(dá)水平。首先配制十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠,待凝膠于電泳槽內(nèi)凝固后,加入蛋白樣品進(jìn)行電泳。以標(biāo)記物(Marker)為參考,選取所需要的目的蛋白和內(nèi)參蛋白所在位置,將其余部分膠裁去,再根據(jù)膠面積裁剪出對應(yīng)大小的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。將PVDF膜放入甲醇中活化,再使用與PVDF膜相當(dāng)大小的厚濾紙按三明治結(jié)構(gòu)包夾凝膠和PVDF膜,置于半干轉(zhuǎn)膜儀上,恒流轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,使用5%的脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h。最后,將PVDF膜放入1∶1 000稀釋的AcH3和AcH4抗體中,低溫過夜孵育,次日孵育1∶400稀釋后的二抗,便可于蛋白成像儀觀察蛋白條帶,通過Image J計算灰度值。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析,選擇LSD檢驗進(jìn)行差異性分析。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 辣蓼黃酮對PRV感染小鼠脾臟和肺臟組織中iNOS和Nrf2 mRNA表達(dá)的影響

如表2所示,與空白對照組相比,PRV組脾臟組織中iNOS的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),肺臟組織中iNOS的mRNA表達(dá)水平極顯著升高(P<0.01)。與PRV組相比,VC組及辣蓼黃酮高、中、低劑量組肺臟組織中iNOS的mRNA表達(dá)水平極顯著降低(P<0.01)。

表2 辣蓼黃酮對PRV感染小鼠脾臟和肺臟組織中iNOS和Nrf2 mRNA表達(dá)的影響

與空白對照組相比,PRV組肺臟組織中Nrf2的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與PRV組相比,VC組及辣蓼黃酮高、中、低劑量組脾臟中Nrf2的mRNA表達(dá)水平極顯著升高(P<0.01),VC組及辣蓼黃酮高劑量組肺臟組織中Nrf2的mRNA表達(dá)水平顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)。

2.2 辣蓼黃酮對PRV感染小鼠脾臟和肺臟組織中HO-1和NQO-1 mRNA表達(dá)的影響

如表3所示,與空白對照組相比,PRV組脾臟組織中HO-1的mRNA表達(dá)水平極顯著降低(P<0.01),肺臟組織中HO-1的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與PRV組相比,VC組及辣蓼黃酮高、中、低劑量組脾臟組織中HO-1的mRNA表達(dá)水平極顯著升高(P<0.01),VC組及辣蓼黃酮高、中劑量組肺臟組織中HO-1的mRNA表達(dá)水平顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

表3 辣蓼黃酮對PRV感染小鼠脾臟和肺臟組織中HO-1和NQO1 mRNA表達(dá)的影響

與空白對照組相比,PRV組肺臟組織中NQO1的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與PRV組相比,VC組及辣蓼黃酮高、中劑量組脾臟組織中NQO1的mRNA表達(dá)水平極顯著升高(P<0.01),VC組及辣蓼黃酮高劑量組肺臟組織中NQO1的mRNA表達(dá)水平顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)。

2.3 辣蓼黃酮對PRV感染小鼠脾臟和肺臟組織中HAT和HDAC mRNA表達(dá)的影響

如表4所示,與空白對照組相比,PRV組脾臟和肺臟組織中HAT的mRNA表達(dá)水平極顯著升高(P<0.01)。與PRV組相比,VC組及辣蓼黃酮高、中、低劑量組脾臟和肺臟組織中HAT的mRNA表達(dá)水平極顯著降低(P<0.01)。

表4 辣蓼黃酮對PRV感染小鼠脾臟和肺臟組織中HAT和HDAC mRNA表達(dá)的影響

與空白對照組相比,PRV組脾臟組織中HDAC的mRNA表達(dá)水平極顯著降低(P<0.01)。與PRV組相比,VC組及辣蓼黃酮高、中、低劑量組脾臟組織中HDAC的mRNA表達(dá)水平極顯著升高(P<0.01),VC組及辣蓼黃酮中、低劑量組肺臟組織中HDAC的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。

2.4 辣蓼黃酮對PRV感染小鼠肺臟組織中iNOS和Nrf2蛋白表達(dá)的影響

如圖1所示,肺臟組織中iNOS蛋白在PRV組有較多的陽性表達(dá),顯示為棕黃色或棕褐色,主要分布在支氣管上皮細(xì)胞的胞漿中。如表5所示,與空白對照組相比,PRV組肺臟組織中iNOS的蛋白表達(dá)水平極顯著升高(P<0.01)。與PRV組相比,VC組及辣蓼黃酮高、低劑量組肺臟組織中iNOS的蛋白表達(dá)水平極顯著降低(P<0.01)。

A:空白對照組;B:PRV組;C:VC組;D:辣蓼黃酮低劑量組;E:辣蓼黃酮中劑量組;F:辣蓼黃酮高劑量組;比例尺:50 μm。下圖同。

表5 辣蓼黃酮對PRV感染小鼠肺臟組織中iNOS和Nrf2蛋白表達(dá)的影響

如圖2所示,肺臟組織中Nrf2蛋白在各試驗組均有陽性表達(dá),顯示為棕褐色,主要分布在肺泡細(xì)胞和血管上皮細(xì)胞的胞漿中,同時Nrf2蛋白在支氣管上皮細(xì)胞的胞核中亦有表達(dá)。如表5所示,與空白對照組相比,PRV組肺臟組織中Nrf2的蛋白表達(dá)水平極顯著升高(P<0.01)。與PRV組相比,VC組肺臟組織中Nrf2的蛋白表達(dá)水平極顯著升高(P<0.01),而辣蓼黃酮高、中、低劑量組肺臟組織中Nrf2的蛋白表達(dá)水平差異不顯著(P>0.05)。

圖2 PRV感染小鼠肺臟組織中Nrf2蛋白免疫組化切片圖

2.5 辣蓼黃酮對PRV感染小鼠肺臟組織中HO-1和NQO1蛋白表達(dá)的影響

如圖3所示,肺臟組織中HO-1蛋白在各試驗組均有陽性表達(dá),主要分布在胞漿或支氣管上皮細(xì)胞的胞漿或胞核中,肺泡細(xì)胞中也有少許分布,呈棕黃色或棕褐色。如表6所示,與空白對照組相比,PRV組肺臟組織中HO-1的蛋白表達(dá)水平有所降低,但差異不顯著(P>0.05)。與PRV組相比,VC組及辣蓼黃酮高、低劑量組肺臟組織中HO-1的蛋白表達(dá)水平極顯著升高(P<0.01)。

圖3 PRV感染小鼠肺臟組織中HO-1蛋白免疫組化切片圖

表6 辣蓼黃酮對PRV感染小鼠肺臟組織中HO-1和NQO1蛋白表達(dá)的影響

如圖4所示,肺臟組織中NQO1蛋白在空白對照組表達(dá)較少,在其他各試驗組均有表達(dá),顯示為棕褐色或者黃色,主要分布在肺泡壁細(xì)胞的胞漿中,同時NQO1蛋白在支氣管上皮細(xì)胞的胞核中亦有分布。如表6所示,與空白對照組相比,PRV組肺臟組織中NQO1的蛋白表達(dá)水平有所升高,但差異不顯著(P>0.05)。與PRV組相比,辣蓼黃酮高劑量組肺臟組織中NQO1的蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),辣蓼黃酮低劑量組肺臟組織中NQO1的蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。

圖4 PRV感染小鼠肺臟組織中NQO1蛋白免疫組化切片圖

2.6 辣蓼黃酮對PRV感染小鼠脾臟和肺臟組織中AcH3和AcH4蛋白表達(dá)的影響

如圖5和圖6所示,與空白對照組相比,PRV組脾臟和肺臟組織中AcH3的蛋白表達(dá)水平極顯著升高(P<0.01)。與PRV組相比,VC組及辣蓼黃酮高、中、低劑量組脾臟和肺臟組織中AcH3的蛋白表達(dá)水平顯著或極顯著降低(P<0.05)。

圖5 辣蓼黃酮對PRV感染小鼠脾臟組織中AcH3和AcH4蛋白表達(dá)的影響

圖6 辣蓼黃酮對PRV感染小鼠肺臟組織中AcH3和AcH4蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組相比,PRV組肺臟組織中AcH4的蛋白表達(dá)水平極顯著降低(P<0.01)。與PRV組相比,VC組及辣蓼黃酮高、中、低劑量組脾臟組織中AcH4的蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),辣蓼黃酮高、中、低劑量組肺臟組織中AcH4的蛋白表達(dá)水平極顯著升高(P<0.01)。

3 討 論

研究表明,iNOS是合成NO的關(guān)鍵酶,在iNOS的催化下,NO可以在較長的時間內(nèi)以恒定速率合成[17]。而NO是一種高反應(yīng)性細(xì)胞毒性自由基。因此,iNOS被認(rèn)為是評估氧化應(yīng)激反應(yīng)過程的有效生物標(biāo)志物之一。陳奇等[18]研究發(fā)現(xiàn),豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染后將誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激,且iNOS分泌水平在測定的各個時間點均高于空白對照組。本研究結(jié)果顯示,PRV感染小鼠后,小鼠脾臟和肺臟組織中iNOS的mRNA表達(dá)水平升高,這與前人的研究結(jié)果一致,說明PRV感染造成了小鼠的氧化應(yīng)激。高、中、低3個劑量的辣蓼黃酮可下調(diào)小鼠肺臟組織中iNOS的mRNA和蛋白表達(dá)水平,說明辣蓼黃酮能夠緩解PRV感染誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。

生物體內(nèi),自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng),氧化終產(chǎn)物為MDA,會引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合,且具有細(xì)胞毒性。MDA含量是反映機(jī)體抗氧化潛在能力的重要參數(shù),可以反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化速率和強(qiáng)度,也能間接反映組織過氧化損傷程度。髓過氧化物酶(MPO)又稱過氧化物酶,是血紅素輔基的血紅素蛋白酶,是血紅素過氧化物酶超家族成員之一?？偪寡趸芰?T-AOC)是指各種抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等構(gòu)成的總抗氧化水平,如抗氧化物酶、維生素C、維生素E和胡蘿卜素等,為保護(hù)細(xì)胞和機(jī)體免于活性氧自由基造成的氧化應(yīng)激損傷,因此可用T-AOC來評價生物活性物質(zhì)的抗氧化能力。SOD是生物體內(nèi)存在的一種抗氧化金屬酶,它能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫,在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用,與很多疾病的發(fā)生、發(fā)展密不可分。本實驗室前期研究表明,辣蓼黃酮可極顯著降低LPS誘導(dǎo)的小鼠小腸中MDA和MPO的分泌水平,同時,其還可極顯著升高小鼠血清中谷胱甘肽的分泌水平,高劑量的辣蓼黃酮能夠顯著或極顯著提高小鼠肝臟中T-AOC和SOD活性[19]。此外,Ren等[20]研究表明,辣蓼黃酮乙酸乙酯部位可顯著或極顯著降低PRV感染RAW264.7細(xì)胞內(nèi)ROS、NO含量和iNOS活性,本研究結(jié)果與其一致。由此表明,辣蓼黃酮能夠緩解外來病原感染小鼠造成的氧化應(yīng)激,并提高小鼠自身機(jī)體的抗氧化能力。

此外,Wang等[21]研究表明,氧化應(yīng)激是由紫外線輻射等破壞性刺激引起的皮膚損傷的主要原因,而間質(zhì)干細(xì)胞衍生外泌體(MSC-Exo)作為一種納米治療劑可通過降低小鼠體內(nèi)ROS含量、提高M(jìn)DA含量而緩解氧化應(yīng)激和皮膚損傷;敲低Nrf2的表達(dá)減弱了MSC-Exo在體內(nèi)和體外的抗氧化能力,表明該治療藥物提升的抗氧化能力是通過Nrf2信號通路介導(dǎo)的。Yang等[22]研究表明,藥物Maresin1可降低小鼠肝臟中ROS和MDA等氧化應(yīng)激指標(biāo)的含量而緩解LPS誘導(dǎo)造成的氧化應(yīng)激和急性肝臟損傷;而敲低Nrf2基因后,小鼠肝臟中HO-1和谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)的表達(dá)水平隨之降低,Maresin1的保護(hù)作用也明顯下降,表明Nrf2/HO-1/GPX4的激活可抑制ROS的產(chǎn)生,Nrf2信號通路及其下游抗氧化酶HO-1、GPX4和NQO1等的表達(dá)水平高低可在一定程度上反映機(jī)體抗氧化能力的強(qiáng)弱。

Nrf2在氧化應(yīng)激過程中發(fā)揮保護(hù)作用,在ROS存在下,Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Keap1)-Nrf2復(fù)合物解離,Nrf2從細(xì)胞質(zhì)易位,并于細(xì)胞核中結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件(ARE)參與抗氧化反應(yīng)的基因的轉(zhuǎn)錄,其產(chǎn)物主要是具有滅活ROS能力的酶[23]。其中一種ARE酶是HO-1,可保護(hù)細(xì)胞遭受氧化應(yīng)激損傷,已被證明具有抗炎、抗氧化和抗凋亡作用[24]。另一種酶是NQO1,是一種抗氧化酶,可催化幾種不同類別的醌樣化合物的雙電子還原,以避免單電子還原啟動氧化還原循環(huán)產(chǎn)生活性氧并造成氧化應(yīng)激[25]。劉澤霖等[10]在Nrf2通路對日本腦炎病毒(JEV)感染小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),JEV激活了Nrf2的mRNA和蛋白的表達(dá)。慢性萎縮性胃炎模型大鼠胃黏膜組織Nrf2、NQO1、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)蛋白及mRNA表達(dá)水平升高[26]。薰衣草總黃酮能夠明顯減輕小鼠皮膚光損傷引起的氧化應(yīng)激,減輕皮膚外觀損傷程度、表皮厚度及皮膚組織的病理學(xué)變化,且能顯著增強(qiáng)Nrf2、HO-1、NQO1的蛋白表達(dá)水平[27]。在本研究中,PRV感染會導(dǎo)致小鼠肺臟組織中Nrf2和NQO1的mRNA和蛋白表達(dá)水平上調(diào),且導(dǎo)致HO-1的mRNA表達(dá)水平上調(diào),這與前人的研究結(jié)果相一致。此外,高、中、低劑量的辣蓼黃酮能上調(diào)PRV感染小鼠脾臟組織中Nrf2、HO-1和NQO1的mRNA表達(dá)水平,且高、低劑量的辣蓼黃酮能上調(diào)PRV感染小鼠脾臟組織中HO-1和NQO1的蛋白表達(dá)水平,這同樣與前人的研究結(jié)果相類似。由此表明,辣蓼黃酮可通過調(diào)控Nrf2信號通路,增強(qiáng)抗氧化酶相關(guān)基因和蛋白的表達(dá),發(fā)揮抗氧化作用,緩解PRV感染小鼠誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。其中,200 mg/kg BW的高劑量辣蓼黃酮效果最好。

組蛋白H3和組蛋白H4中賴氨酸殘基的乙?；潜谎芯孔疃嗟慕M蛋白修飾類型,它受到HAT和HDAC活性的嚴(yán)格控制[28]。HAT和HDAC活性之間的平衡保證了穩(wěn)定的組蛋白乙?；?而這種平衡的改變會導(dǎo)致疾病的發(fā)生[29]。據(jù)報道,1型即艾滋病病毒(HIV-1)可以降低HDAC活性,增加HAT活性,并上調(diào)組蛋白H3和組蛋白H4的乙?；饔肹30]。另有研究表明,抑制HIV-1復(fù)制與HDAC活性的增加和組蛋白乙酰化的抑制有關(guān),而高HAT活性與HIV-1活性轉(zhuǎn)錄相對應(yīng)[31-32]。據(jù)報道,豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)感染在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)了氧化應(yīng)激和組蛋白乙酰化,三七皂甙可以通過降低HAT活性并增加PCV2感染小鼠脾臟組織中HDAC活性來降低組蛋白H3的乙?；?緩解氧化應(yīng)激造成的損傷[16]。Chen等[33]研究表明,馬尾藻多糖通過降低HAT的分泌水平,升高HDAC的分泌水平,下調(diào)組蛋白H3和組蛋白H4的乙?；?顯著抑制炎癥反應(yīng),從而保護(hù)細(xì)胞免受PCV2誘導(dǎo)的損傷。在本研究中,PRV感染上調(diào)了小鼠脾臟和肺臟組織中HAT的mRNA表達(dá)水平,下調(diào)了小鼠脾臟組織中HDAC的mRNA表達(dá)水平,并上調(diào)了組蛋白H3的乙?；?。這與前人的研究結(jié)果相類似。而高、中、低3個劑量的辣蓼黃酮能下調(diào)小鼠脾臟和肺臟組織中HAT的mRNA表達(dá)水平,上調(diào)小鼠脾臟和肺臟組織中HDAC的mRNA表達(dá)水平,下調(diào)組蛋白H3的乙?；?。上述結(jié)果表明,辣蓼可通過上調(diào)HDAC的mRNA表達(dá)水平,進(jìn)而下調(diào)調(diào)控組蛋白乙?；?發(fā)揮抗氧化作用,緩解PRV感染小鼠誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。綜合分析來看,200 mg/kg BW的高劑量辣蓼黃酮效果最好。

4 結(jié) 論

辣蓼黃酮對Nrf2信號通路和組蛋白乙?；揎椌哂姓{(diào)控作用,且其通過該調(diào)控作用而緩解PRV感染小鼠脾臟和肺臟誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。