張含林 林輝 郭航遠(yuǎn)

312000 紹興市人民醫(yī)院(浙江大學(xué)紹興醫(yī)院)心內(nèi)科

國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)預(yù)測(cè),到2040年,糖尿病的患病率將達(dá)10.4%(6.42億)。糖尿病的主要并發(fā)癥之一是糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)[1]。DCM的特征是代謝紊亂,通常伴有局部炎癥、氧化應(yīng)激、心肌纖維化和心肌細(xì)胞凋亡[2]。在心肌纖維化過程中,細(xì)胞外基質(zhì)主要來源于心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts,CFs)[3]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)被認(rèn)為是誘導(dǎo)CFs向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的最強(qiáng)的促纖維化細(xì)胞因子[4]。DCM中,高糖等因素可活化TGF-β1,從而促進(jìn)CFs活化,表現(xiàn)為表達(dá)收縮蛋白,如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表達(dá)增加,并合成大量的細(xì)胞外基質(zhì),包括波形蛋白(Vimentin)和Ⅰ型膠原蛋白(CollagenⅠ)[5-6]。目前研究認(rèn)為,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)在DCM發(fā)病和進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用[7]。同型半胱氨酸內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激泛素樣結(jié)構(gòu)域1(homocysteine-inducible, endoplasmic reticulum stress-inducible, ubiquitin-like domain member 1,Herpud1)是一種廣泛表達(dá)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的蛋白。Herpud1已被報(bào)道與糖尿病和阿爾茨海默病等多種疾病有關(guān)[7]。我們前期研究發(fā)現(xiàn),Herpud1介導(dǎo)的ERS在動(dòng)脈粥樣硬化和血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)可塑性中起重要作用[8],敲除Herpud1可保護(hù)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[9]。牛磺熊去氧膽酸(tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)是公認(rèn)的ERS抑制劑[10]。有研究發(fā)現(xiàn),TUDCA可減輕壓力負(fù)荷引起的心功能障礙[11],并通過抑制ERS減少糖尿病小鼠心肌缺血再灌注后巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn),從而減少心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)[12]。我們推測(cè),TUDCA通過Herpud1介導(dǎo)的ERS通路可抑制CFs活化。但TUDCA對(duì)DCM的緩解作用及其可能機(jī)制仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究旨在通過TUDCA干預(yù)TGF-β1誘導(dǎo)的CFs,比較藥物干預(yù)前后CFs的活化情況,為臨床應(yīng)用TUDCA治療DCM提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),并闡明Herpud1基因在TGF-β1誘導(dǎo)的CFs活化中的關(guān)鍵作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

6周齡的SPF級(jí)SD大鼠,均自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所購(gòu)得。根據(jù)《國(guó)家衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)愛使用指南》,所有動(dòng)物方案均經(jīng)紹興市人民醫(yī)院動(dòng)物關(guān)愛利用委員會(huì)批準(zhǔn)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在紹興市人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成,動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(浙)2017-0007,SPF級(jí)環(huán)境,濕度為40%～60%,室溫為22～28℃,晝夜交替循環(huán)時(shí)間為12 h。食物和水自由供應(yīng)。TUDCA、鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)和嘌呤霉素均為美國(guó)MCE公司產(chǎn)品。高糖DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、鏈霉素-青霉素混合液、Lipofectamine 3000、Opti-MEM培養(yǎng)基及胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)均為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品。TGF-β1和Ⅱ型膠原酶為美國(guó)Cell signaling公司產(chǎn)品。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)、轉(zhuǎn)錄激活因子6(activating transcription factor 6,ATF6)、α-SMA、Vimentin、Herpud1、CollaganⅠ、Anti-beta Actin和Troponin T抗體均為美國(guó)Abcam公司產(chǎn)品。5-Brdu為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。異硫氰酸熒光素標(biāo)記的山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG和Western blot相關(guān)試劑均為江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。siHerpud1、Control組的病毒和轉(zhuǎn)染的P液為上海吉?jiǎng)P生物公司產(chǎn)品。對(duì)照質(zhì)粒以及Herpud1過表達(dá)質(zhì)粒為上海和元生物公司產(chǎn)品。HE染色、馬松染色以及免疫組織化學(xué)試劑盒均為北京索萊寶公司產(chǎn)品。Transwell小室為美國(guó)Corning公司產(chǎn)品。

1.2 模型構(gòu)建和實(shí)驗(yàn)分組

為確定TGF-β1對(duì)ERS通路相關(guān)因子及纖維化相關(guān)因子的影響,用TGF-β1誘導(dǎo)高糖培養(yǎng)下的CFs,采用隨機(jī)數(shù)字表法將CFs分為Control組、6 h、12 h和24 h組。為確定Herpud1在心臟中的表達(dá),分別提取原代心肌細(xì)胞和CFs進(jìn)行下一步的研究。為檢測(cè)TUDCA對(duì)CFs活性的影響,將高糖培養(yǎng)下的CFs用不同濃度(0、1、10、100、1 000和10 000 μM,1 d)TUDCA干預(yù)。為明確TUDCA對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的CFs活化及ERS通路相關(guān)蛋白的影響,采用隨機(jī)數(shù)字表法將高糖培養(yǎng)下的CFs分為HG(25 mmol/L葡萄糖)組、TGF-β1(10 ng/ml)組,TGF-β1+TUDCA 100(100 μM)組、TGF-β1+TUDCA 1 000(1 000μM)組。為驗(yàn)證Herpud1對(duì)CFs的敲除效率,采用隨機(jī)數(shù)字表法將CFs分為NC、siNC、siRNA1、siRNA2和siRNA3組。為了明確敲除Herpud1對(duì)CFs的激活、增殖和遷移的影響,選擇敲除效率最高的Herpud1 siRNA1進(jìn)行下一步研究,采用隨機(jī)數(shù)字表法將CFs分為HG+siNC、TGF-β1+siNC、HG+siHerpud1、TGF-β1+siHerpud1組。為了驗(yàn)證Herpud1在TUDCA抑制CFs纖維化中的作用,將高糖培養(yǎng)下的CFs分為TGF-β1、TUDCA(TGF-β1+TUDCA)、TUDCA+oeVec(TGF-β1+TUDCA+oeVec)、TUDCA+oeHerpud1(TGF-β1+TUDCA+oeHerpud1)組。

1.3 CFs和心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)

自行繁育的3～7 d SD乳鼠用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇消毒,腹腔麻醉后頸椎脫臼法處死,在無菌條件下剪開胸骨,立即取出心臟置于含有肝素鈉的冷D-Hank’s溶液中,顯微鏡下去除殘留的大血管和筋膜,緩沖液反復(fù)漂洗去除血液,用眼科剪剪成1.5～2.0 mm3的組織塊,用D-Hank’s液仔細(xì)漂洗。組織塊轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中,加入3 g/L的Ⅱ型膠原酶6 ml,37℃下置于水平搖床上搖動(dòng)90 min,取上清液立即加入6 ml含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的DMEM培養(yǎng)基終止膠原酶反應(yīng),1 500 r/min離心5 min,再懸浮在含有10% FBS、100 IU/ml青霉素和100 g/ml鏈霉素的DMEM(高糖)中。然后,采用差速貼壁法分離CFs,在37℃培育90 min后,收集上清液,貼壁細(xì)胞就是小鼠心肌細(xì)胞(mCF),將上清液轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中,同時(shí)加入5-Brdu(B5002,sigma)抑制CFs的生長(zhǎng),24 h后,顯微鏡下可見跳動(dòng)的小鼠心肌細(xì)胞(mCM)。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)傳代,即為原代培養(yǎng)的第一代,第二代至第三代CFs被用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞免疫熒光法鑒定CFs

采用細(xì)胞免疫熒光法鑒定CFs的純度,鑒定標(biāo)準(zhǔn)為Vimentin(+)、α-SMA(-)和Cardiac Troponin T(-)符合三條即為CFs。將CFs均勻種于六孔板中,細(xì)胞融合到60%,棄去培養(yǎng)基,磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗3遍,用4%多聚甲醛處理20 min,用PBS清洗3次,每次5 min,加入體積分?jǐn)?shù)0.2%的Triton X-100 15 min,用PBS清洗3次,每次5 min。用5%牛血清白蛋白在室溫下孵育30 min以阻斷非特異性結(jié)合,然后在4℃下用抗Anti-alpha smooth muscle Actin抗體(Abcam,ab7817,1∶400)和抗Vimentin抗體(Abcam,ab92547,1∶400),Cardiac Troponin T(Abcam,ab209813,1∶400)處理過夜。第二天,清洗細(xì)胞以去除游離抗體,然后用Alexa Fluor 486山羊抗兔抗體(Life Technologies)進(jìn)行染色,并用1 μg/ml DAPI核染色(D9564;Sigma Aldrich)進(jìn)行反染色。所有的熒光圖像都是用Nikon Eclipse Ti-U熒光顯微鏡獲得的。

1.5 CCK-8法檢測(cè)CFs活力

采用CCK-8比色法(C0037、碧云天),按生產(chǎn)廠家的方法測(cè)定TUDCA對(duì)CFs的毒性。培養(yǎng)條件:取第三代對(duì)數(shù)期CFs制成細(xì)胞懸液接種于96孔板,每孔加入細(xì)胞懸液100 μl(細(xì)胞數(shù)為每孔5×103個(gè)),在培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中培養(yǎng)24 h,然后分別加入0、1、10、100和1 000 μM、10和100 mM的TUDCA培養(yǎng)24 h。處理后,細(xì)胞用PBS沖洗,每孔加入100 ml含有CCK-8的DMEM溶液(10 μl),然后在37℃孵育2 h,用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度(OD)值。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

使用Transwell實(shí)驗(yàn)評(píng)估CFs的遷移。CFs生長(zhǎng)至70%～80%匯合時(shí),血清饑餓過夜,加入藥物干預(yù),之后用胰蛋白酶消化并對(duì)它們進(jìn)行計(jì)數(shù),將0.15×106個(gè)細(xì)胞鋪在Transwell(8 μm孔徑)的頂部,該Transwell已用0.5% BSA的Hank’s平衡鹽溶液包被。底部腔室含有10%血清的培養(yǎng)基,用作化學(xué)引誘劑。5 h后,用PBS洗滌孔,用棉簽輕輕擦拭Transwell的頂面以除去非遷移細(xì)胞。在室溫下向孔中加入冰冷的甲醇10 min,用自來水洗滌孔5次。然后通過加入蘇木精對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色,使其保持接觸3 min,最后在自來水中沖洗孔2次。在顯微鏡的×20物鏡下拍攝每個(gè)Transwell的照片,并為每個(gè)well拍攝6個(gè)隨機(jī)選擇的視野,避開外部邊緣。Image J用于量化每個(gè)膜上的細(xì)胞數(shù)量。

1.7 Western blot法檢測(cè)ERS通路相關(guān)蛋白和纖維化因子的表達(dá)

CFs進(jìn)行相應(yīng)的干預(yù)后,用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液(Beyotime,中國(guó))裂解,然后在冰上孵育30 min。細(xì)胞裂解產(chǎn)物在4℃下12 000 r/min離心10 min,用BCA蛋白分析試劑盒(Beyotime,P0012)測(cè)定蛋白濃度。蛋白質(zhì)樣本是在5×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)加載緩沖液中稀釋,煮沸5 min。提取的蛋白質(zhì)用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離,轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF;MA)膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉60 min后加入Herpud1、GRP78、ATF6、α-SMA、Vimentin 、Cardiac Troponin T 和CollagenⅠ的多克隆抗體4℃孵育過夜。次日,用PBST洗滌后,加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,在37℃下作用1 h,用ECL Western blotting底物(Pierce;Thermo Scientific)顯示W(wǎng)estern blot,并用Quantity One軟件進(jìn)行分析。每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CFs的鑒定

將從健康SD乳鼠中分離的CFs進(jìn)行鑒定,顯微鏡下觀察CFs呈現(xiàn)不規(guī)則的長(zhǎng)梭形,且無搏動(dòng)功能。用細(xì)胞免疫熒光法鑒定CFs的純度,見圖1。

CFs中波形蛋白(Vimentin)、心肌肌鈣蛋白T(Cardiac troponin T)和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的表達(dá)

2.2 TGF-β1上調(diào)CFs中ERS相關(guān)伴侶蛋白和纖維化因子

心肌纖維化主要累及CFs。在此,我們從細(xì)胞水平研究了TGF-β1對(duì)ERS相關(guān)因子和纖維化因子表達(dá)的影響。用10 ng/ml TGF-β1刺激CFs 0、6、12和24 h,發(fā)現(xiàn)24 h后細(xì)胞纖維化標(biāo)志物CollagenⅠ、Vimentin和α-SMA的表達(dá)均顯著高于Control組(均為P<0.05),ERS通路相關(guān)蛋白Herpud1、GRP78和ATF6的表達(dá)均升高(均為P<0.05),見圖2。

Herpud1:同型半胱氨酸內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激泛素樣結(jié)構(gòu)域1;GRP78:葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78;ATF6:轉(zhuǎn)錄激活因子6;Vimentin:波形蛋白;α-SMA:α-平滑肌肌動(dòng)蛋白;CollagenⅠ:Ⅰ型膠原蛋白;A:Western blot檢測(cè)TGF-β1在不同時(shí)間處理下ERS通路相關(guān)蛋白的表達(dá),與Control組比較,aP<0.05;與6 h組比較,bP<0.05;與12 h組比較,cP<0.05(n=3);B:Western blot檢測(cè)TGF-β1在不同時(shí)間處理下纖維化相關(guān)因子的表達(dá),與Control組比較,aP<0.05;與6 h組比較,bP<0.05;與12 h組比較,cP<0.05(n=3)

Herpud1:同型半胱氨酸內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激泛素樣結(jié)構(gòu)域1;CollagenⅠ:Ⅰ型膠原蛋白;α-SMA:α-平滑肌肌動(dòng)蛋白;Vimentin:波形蛋白;TGF-β1:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1;HG:高糖;A:Herpud1的敲除效率,與NC組比較,aP<0.05;B:Western blot檢測(cè)敲除Herpud1后纖維化相關(guān)因子的表達(dá),與HG+siNC組比較,aP<0.05;與TGF-β1+siHerpud1組比較,bP<0.05(n=3);C:Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CFs的遷移

2.3 下調(diào)Herpud1基因的表達(dá)可抑制TGF-β1所誘導(dǎo)的CFs纖維化

通過體外培養(yǎng)心臟組織中的原代細(xì)胞,我們發(fā)現(xiàn)Herpud1在CFs中的表達(dá)明顯高于心肌細(xì)胞,見圖3。Herpud1在CFs中的高表達(dá)是否意味著Herpud1具有調(diào)節(jié)CFs活化的作用?為了研究Herpud1是否與CFs活化及纖維化有直接關(guān)系,我們轉(zhuǎn)染siRNA-Herpud1以下調(diào)CFs中Herpud1基因的表達(dá)。與NC組相比,針對(duì)Herpud1的3個(gè)siRNA序列(siRNA1、siRNA2、siRNA3)顯著降低Herpud1的表達(dá)(均為P<0.05),見圖4A。在隨后的實(shí)驗(yàn)中,我們選擇了產(chǎn)生最大效應(yīng)的小干擾RNA序列(siRNA1),并在有或無TGF-β1刺激的情況下瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CFs。與siNC組相比,siRNA-Herpud1(Herpud1 siRNA)顯著降低CFs中Herpud1蛋白的水平,同時(shí)也降低了纖維化標(biāo)志物CollagenⅠ、Vimentin和α-SMA的水平(均為P<0.05),見圖4B,表明下調(diào)Herpud1可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的CFs纖維化。同時(shí),Transwell實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了下調(diào)Herpud1可抑制CFs的遷移,見圖4C。以上實(shí)驗(yàn)表明,敲除Herpud1可抑制CFs中TGF-β1的促纖維化作用。

2.4 TUDCA對(duì)CFs的毒性

通過CCK-8測(cè)定,檢測(cè)不同濃度的TUDCA在24 h內(nèi)對(duì)CFs的毒性。鑒于10 mM TUDCA在24 h后即可引起細(xì)胞毒性,因此選擇100和1 000 μM TUDCA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),見圖5。

OD:吸光度;TUDCA:牛磺熊去氧膽酸;與0 μM TUDCA組比較,aP<0.05

2.5 TUDCA抑制TGF-β1誘導(dǎo)的CFs活化和ERS

首先,我們研究了TUDCA對(duì)ERS通路相關(guān)蛋白的影響。Western blot結(jié)果顯示,TGF-β1刺激的ATF6、GRP78和Herpud1蛋白水平高于HG組,然而,相較于TGF-β1干預(yù)組,TUDCA干預(yù)顯著降低了這些蛋白的水平,并且1 000 μM TUDCA產(chǎn)生的作用強(qiáng)于100 μM TUDCA(P<0.05),見圖6。免疫熒光染色結(jié)果顯示,TGF-β1刺激的α-SMA的表達(dá)顯著升高,TUDCA干預(yù)逆轉(zhuǎn)了TGF-β1對(duì)α-SMA的作用,見圖7A。Western blot結(jié)果顯示,TGF-β1刺激的CollagenⅠ、Vimentin和α-SMA蛋白水平高于對(duì)照組,然而,TUDCA干預(yù)逆轉(zhuǎn)了TGF-β1對(duì)這些蛋白的影響(P<0.05),見圖7B。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明,TUDCA干預(yù)可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的CFs活化和ERS。

ATF6:轉(zhuǎn)錄激活因子6;Herpud1:同型半胱氨酸內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激泛素樣結(jié)構(gòu)域1;GRP78:葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78;HG:高糖;TGF-β1:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1;TUDCA:?；切苋パ跄懰?Western blot檢測(cè)ERS通路信號(hào)因子的表達(dá),與HG組比較,aP<0.05;與TGF-β1組比較,bP<0.05(n=3)

TGF-β1:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1;TUDCA:?；切苋パ跄懰?α-SMA:α-平滑肌肌動(dòng)蛋白;Vimentin:波形蛋白;CollagenⅠ:Ⅰ型膠原蛋白;HG:高糖;A:免疫熒光染色法檢測(cè)CFs纖維化因子的表達(dá)(×100);B:Western blot檢測(cè)TUDCA對(duì)纖維化相關(guān)因子的影響,與HG組比較,aP<0.05;與TGF-β1組比較,bP<0.05(n=3)

2.6 過表達(dá)Herpud1逆轉(zhuǎn)了TUDCA對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的CFs纖維化的抑制作用

最后,我們研究了TUDCA對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的CFs纖維化的抑制作用是否通過Herpud1介導(dǎo)。使用過表達(dá)的方法促進(jìn)CFs中Herpud1蛋白的表達(dá)。

結(jié)果表明,TUDCA可抑制TGF-β1所誘導(dǎo)的Herpud1的水平,同時(shí),TUDCA對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的CFs纖維化的抑制作用可被Herpud1過表達(dá)所抑制,但在TUDCA+oeVec處理的細(xì)胞中不能實(shí)現(xiàn)(P<0.05),見圖8。這些結(jié)果表明,Herpud1過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)TUDCA對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的CFs纖維化的抑制作用。

Vimentin:波形蛋白;α-SMA:α-平滑肌肌動(dòng)蛋白;CollagenⅠ:Ⅰ型膠原蛋白;Herpud1:同型半胱氨酸內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激泛素樣結(jié)構(gòu)域1;TGF-β1:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1;TUDCA:牛磺熊去氧膽酸;Western blot檢測(cè)過表達(dá)Herpud1后纖維相關(guān)因子的表達(dá),與TGF-β1組比較,aP<0.05;與TUDCA+oeVec組比較,bP<0.05(n=3)

3 討論

近年來,糖尿病及其并發(fā)癥的患病率呈逐年上升趨勢(shì),嚴(yán)重影響居民的健康生活,成為一個(gè)日益嚴(yán)重的公共健康風(fēng)險(xiǎn)[13]。DCM是發(fā)生在糖尿病患者身上的一種獨(dú)立于冠心病、心臟瓣膜病等心血管疾病的影響心臟結(jié)構(gòu)和功能的病變[14]。DCM的主要病理特征是心肌間質(zhì)纖維化、心臟重構(gòu)和舒張功能障礙,最終發(fā)展為收縮功能障礙的心力衰竭[15]。其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,但確切的機(jī)制目前未明。因此,在這里我們主要探索心肌纖維化的機(jī)制及阻斷或延緩其進(jìn)展的藥物。CFs活化所導(dǎo)致的細(xì)胞外基質(zhì)的沉積被認(rèn)為是心肌纖維化的基礎(chǔ)。其中,TGF-β被認(rèn)為是心肌纖維化過程中的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,在CFs活化中起著重要的調(diào)控作用[16]。DCM中,高糖可增加CFs中TGF-β1基因的轉(zhuǎn)錄和下游信號(hào)的激活,促進(jìn)DCM心肌纖維化過程[17]。因此,抑制TGF-β1介導(dǎo)的CFs活化可有效預(yù)防和控制DCM。尋找潛在的抑制心肌纖維化、改善心臟功能的藥物對(duì)治療糖尿病具有十分重要的作用。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中主要負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)合成、折疊和修飾的細(xì)胞器。正確折疊和修飾的蛋白質(zhì)被運(yùn)送到高爾基體,與胞膜融合,釋放到細(xì)胞外空間。糖尿病本身是一種錯(cuò)誤折疊蛋白疾病,大量錯(cuò)誤折疊或未折疊的蛋白于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔積聚,引起ERS并激活未折疊蛋白反應(yīng)[18]。目前研究認(rèn)為ERS與DCM的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。許多藥物可通過抑制ERS來減少心肌細(xì)胞凋亡,改善心臟功能,延緩DCM的發(fā)生發(fā)展[8]。值得注意的是,ERS與TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化應(yīng)激和蛋白尿密切相關(guān)[19]。Herpud1是錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的跨膜蛋白,其N端和C端均暴露于細(xì)胞質(zhì)中,是UPR的下游靶蛋白和ERAD的組成部分和調(diào)節(jié)者[20]。Herpud1蛋白的表達(dá)水平與ERS的程度呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),Herpud1基因的啟動(dòng)子區(qū)存在ERS反應(yīng)原件,在ERS狀態(tài)下,多種特異的轉(zhuǎn)錄因子(如XBP-1、CHOP等)與ERS反應(yīng)原件結(jié)合以促進(jìn)Herpud1基因的轉(zhuǎn)錄[20]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),Herpud1參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成。通過轉(zhuǎn)染Herpud1 siRNA,我們發(fā)現(xiàn)沉默內(nèi)皮細(xì)胞中的Herpud1蛋白,可部分逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮細(xì)胞損傷,改善內(nèi)皮功能[9, 21]。但是,Herpud1在DCM的中的表達(dá)和作用并不明確。目前有關(guān)糖尿病和細(xì)胞表型改變的研究中,Herpud1被報(bào)道可影響胰島素的分泌,參與骨骼肌的糖代謝[22-23]。Herpud1在成骨細(xì)胞分化過程中同樣發(fā)揮重要作用,Herpud1敲除可抑制前成骨細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化,減少骨礦物質(zhì)的沉積[24]。我們的前期研究表明,敲除Herpud1能抑制血管平滑肌細(xì)胞由收縮型向合成型分化,減輕動(dòng)脈粥樣硬化的形成[8]。然而,Herpud1在DCM發(fā)病和CFs活化中的作用和機(jī)制并不清楚。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)心臟組織中的各種細(xì)胞,我們發(fā)現(xiàn)Herpud1在CFs中的表達(dá)明顯高于心肌細(xì)胞。Herpud1在CFs中的高表達(dá)是否意味著Herpud1具有調(diào)節(jié)CFs活化的作用呢?通過體外培養(yǎng)CFs,我們發(fā)現(xiàn)沉默Herpud1基因可逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的CFs活化。上述結(jié)果提示,Herpud1可能在DCM的CFs活化中起重要作用。

TUDCA是公認(rèn)的ERS抑制劑。TUDCA的化學(xué)名稱為3α,7β二羥基膽烷酰-N-?；撬?是由牛磺酸結(jié)合熊去氧膽酸,通過腸道菌群二次加工的產(chǎn)物。TUDCA目前主要用于治療膽囊膽固醇結(jié)石、原發(fā)硬化性膽管炎、原發(fā)膽汁性肝硬化等[10]。有研究發(fā)現(xiàn),TUDCA可減輕壓力負(fù)荷引起的心功能障礙[11],并通過抑制ERS減少糖尿病小鼠心肌缺血再灌注后巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn),從而減少心細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)[12]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明,TUDCA通過抑制TSP-1/TGF-β1途徑減輕慢性間歇性低氧所誘導(dǎo)的肺纖維化[25]。并且作為ERS的抑制劑,TUDCA可通過減輕ERS來緩解壓力負(fù)荷所致的心肌重構(gòu)[26]。但截至目前,并未有研究探究TUDCA在DCM中的作用及其可能機(jī)制,以及ERS在DCM中的作用。本研究發(fā)現(xiàn),TUDCA通過下調(diào)Herpud1來調(diào)節(jié)ERS,進(jìn)而延緩TGF-β1介導(dǎo)的心肌纖維化,過表達(dá)Herpud1后,則可緩解TUDCA對(duì)TGF-β1介導(dǎo)的心肌纖維化的抑制作用。提示TUDCA有可能成為治療DCM心肌纖維化的有效藥物。

本研究以Western blot為主要分析方法。然而,其只能用于定性鑒定蛋白質(zhì)或粗略地半定量蛋白質(zhì)水平。對(duì)于未來的研究,還需要更多的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)和成纖維細(xì)胞特異性敲除的動(dòng)物模型來證實(shí)本研究的結(jié)論。此外,有研究表明,高糖等因素可活化TGF-β1,隨后與其Ⅱ型受體結(jié)合,繼而募集并結(jié)合TGF-β1 RI,然后引起受體Smads蛋白家族的胞漿蛋白磷酸化,促進(jìn)CFs活化[6]。因此,仍需進(jìn)一步的研究來明確ERS調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞活化的機(jī)制。

綜上所述,本研究首次發(fā)現(xiàn)TUDCA能通過ERS通路來抑制TGF-β1所誘導(dǎo)的CFs纖維化。本研究初步證實(shí)了TUDCA對(duì)心肌纖維化的抑制作用,為后續(xù)臨床開展相關(guān)研究探索TUDCA干預(yù)DCM患者提供了科學(xué)依據(jù),為拓展TUDCA的臨床適應(yīng)證提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明,Herpud1在DCM的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用,調(diào)節(jié)CFs內(nèi)Herpud1水平有望成為干預(yù)DCM的新的研究方向。

利益沖突：無