葉偉文,高琳,蔡國偉,賴燁才,秦飛

(廣州白云山醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司白云山制藥總廠/廣東省化學(xué)藥原料與制劑關(guān)鍵技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510515)

頭孢克肟是首個(gè)第3代口服頭孢菌素[1],為低溶解、低滲透藥物[2],由藤澤制藥株式會(huì)社研發(fā),于1987年在日本上市,白云山制藥總廠最早于1993年獲得頭孢克肟膠囊的全國首仿藥品注冊證書。溶出曲線研究可預(yù)測藥物在體內(nèi)的溶解情況,提高生物等效性(bioequivalence,BE)實(shí)驗(yàn)的成功率,已成為評(píng)價(jià)藥品質(zhì)量差異的重要手段[3-5]。

2020年版《中華人民共和國藥典》[6]收載的頭孢克肟膠囊溶出度測定方法為紫外-可見分光光度法,溶出液需要稀釋后才能測定,而《醫(yī)療用醫(yī)藥品品質(zhì)情報(bào)集》[7]推薦方法為高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法,但后者檢測時(shí)間長,效率低,不利于高通量樣品檢測。核殼型色譜填料由實(shí)心硅膠核和外層多孔硅膠殼組成,該類型填料的色譜柱具有快速、高分辨率和低背壓的特點(diǎn),在藥品領(lǐng)域的快速分析中已被廣泛應(yīng)用[8-10]。筆者在本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選核殼型色譜柱建立快速測定頭孢克肟膠囊溶出度的HPLC法,考察頭孢克肟膠囊在多種介質(zhì)的溶出行為,并結(jié)合BE實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以期為其一致性評(píng)價(jià)提供借鑒。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Thermo UltiMate 3000型高效液相色譜儀(美國Thermo公司,DAD檢測器);FADT-1202RC型自動(dòng)溶出度儀(上海富科思分析儀器有限公司);CPA225D電子天平(德國Sartorius公司,感量:0.01 mg);TDL-50B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);E300H超聲波清洗器(德國Elmassonic)。

1.2試藥 頭孢克肟膠囊仿制制劑(白云山制藥總廠,規(guī)格:0.1 g,批號(hào):02180401、02180501、02180502);頭孢克肟膠囊參比制劑(長生堂制藥株式會(huì)社,規(guī)格:0.1 g,批號(hào):CB011);頭孢克肟對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院,批號(hào):130503-201706,含量:89.2%);甲醇(德國默克公司,批號(hào):11736420346)、乙腈(德國默克公司,批號(hào):10955330820)、三氟乙酸(美國天地有限公司,批號(hào):I6110077)為色譜純,水為純化水,氯化鈉(批號(hào):20171105)、氫氧化鈉(批號(hào):20171002)、磷酸二氫鉀(批號(hào):20180102)、無水磷酸氫二鈉(批號(hào):20180104)、一水合檸檬酸(批號(hào):20171205)、鹽酸(批號(hào):20180104)均為分析純(廣州化學(xué)試劑廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1溶出方法與溶出介質(zhì)的選擇

2.1.1溶出方法 2020年版《中華人民共和國藥典》[6]采用籃法,轉(zhuǎn)速100 r·min-1,而《醫(yī)療用醫(yī)藥品品質(zhì)情報(bào)集》[7]采用槳法,轉(zhuǎn)速50 r·min-1,溶出介質(zhì)均為900 mL。頭孢克肟主要在腸道吸收[2],前期研究選擇區(qū)分力較好的pH值6.8磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)介質(zhì)和溶出速度較快的pH值7.5 PBS介質(zhì)進(jìn)行對(duì)比,取頭孢克肟膠囊分別采用籃法(100 r·min-1)和槳法(50 r·min-1)進(jìn)行溶出實(shí)驗(yàn),結(jié)果見圖1。相比之下槳法(50 r·min-1)區(qū)分力更好,最終選擇的溶出條件為:槳法,50 r·min-1,溶出介質(zhì)900 mL。

A.pH值6.8 PBS;B.pH值7.5 PBS。

2.1.2溶出介質(zhì) 參考《醫(yī)療用醫(yī)藥品品質(zhì)情報(bào)集》[7],選擇pH值1.2鹽酸、pH值6.8 PBS、pH值7.5PBS和水為溶出介質(zhì)。

2.1.3取樣時(shí)間 結(jié)合本品在各介質(zhì)的溶出速度,pH值1.2鹽酸、pH值6.8 PBS和水介質(zhì)的取樣時(shí)間點(diǎn)分別為5、15、30、60、90,120和180 min,pH值7.5 PBS介質(zhì)的取樣時(shí)間點(diǎn)為5、10、15、30、45、60和90 min。

2.2溶液的制備 ①空白輔料溶液:取空白輔料適量及一粒明膠空心膠囊,置100 mL量瓶中,分別加入相應(yīng)溶出介質(zhì)超聲溶解并稀釋定容,濾過,取續(xù)濾液。②對(duì)照品貯備液:精密稱取頭孢克肟對(duì)照品適量,置250 mL量瓶,加適量甲醇溶解,加水稀釋至刻度,搖勻,制成1.115 8 mg·mL-1頭孢克肟(以C16H15N5O7S2計(jì))對(duì)照品貯備液。③對(duì)照品溶液:精密量取上述貯備液2 mL,置20 mL量瓶,分別加入相應(yīng)溶出介質(zhì)稀釋定容,作為對(duì)照品溶液。④供試品溶液:取本品1粒,按“2.1.1節(jié)”溶出方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),于設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)取溶出液適量,濾過,取續(xù)濾液。⑤系統(tǒng)適用性溶液:取頭孢克肟對(duì)照品約23 mg,置20 mL量瓶,加水稀釋定容,于95 ℃水浴45 min,冷卻至室溫后濾過,取續(xù)濾液[6]。

2.3分析方法的建立和驗(yàn)證

2.3.1HPLC色譜條件 以Thermo Accucore C18(50 mm×4.6 mm,2.6 μm)為色譜柱;以乙腈-0.8%三氟乙酸溶液(20：80)為流動(dòng)相;檢測波長254 nm;柱溫45 ℃;流速1.2 mL·min-1;等度洗脫;進(jìn)樣量5 μL?！夺t(yī)療用醫(yī)藥品品質(zhì)情報(bào)集》[7]采用四丁基氫氧化銨溶液和乙腈為流動(dòng)相,在常規(guī)C18色譜柱中頭孢克肟出峰時(shí)間約為12 min,且該有機(jī)鹽試劑對(duì)色譜柱填料的損耗較大。本研究優(yōu)選核殼型C18色譜柱,流動(dòng)相換作乙腈-三氟乙酸溶液,使頭孢克肟出峰時(shí)間縮短至1 min內(nèi),極大地提升了檢測效率。2種方法的典型色譜圖見圖2。

A.《醫(yī)療用醫(yī)藥品品質(zhì)情報(bào)集》檢測方法;B.本研究提出的檢測方法;1.頭孢克肟。

A.pH值1.2鹽酸;B.pH值6.8 PBS;C.pH值7.5 PBS;D.水;a.空白輔料;b.對(duì)照品;c.供試品;1.頭孢克肟。

2.3.2專屬性實(shí)驗(yàn) 取空白輔料溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液,按“2.3.1節(jié)”色譜條件測定,色譜圖見圖

3,結(jié)果表明輔料均無干擾。

2.3.3系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 取系統(tǒng)適用性溶液,按“2.3.1節(jié)”色譜條件測定,色譜圖見圖4,結(jié)果表明頭孢克肟峰與雜質(zhì)峰的分離度>1.5,本方法系統(tǒng)適用性良好。

1.頭孢克肟;2.頭孢克肟(E)異構(gòu)體。

2.3.4線性關(guān)系考察 精密量取“2.2節(jié)”貯備液0.1、0.2、0.5、1、2、4、6 mL,分別置20 mL量瓶,用相應(yīng)溶出介質(zhì)稀釋配制成不同濃度對(duì)照品溶液。按“2.3.1節(jié)”色譜條件測定,以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,結(jié)果表明頭孢克肟濃度在5.58～334.74 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,見表1。

表1 頭孢克肟的回歸方程

2.3.5精密度實(shí)驗(yàn) 取對(duì)照品溶液(111.58 μg·mL-1)連續(xù)測定6次,記錄峰面積,見表2,結(jié)果表明本方法精密度良好。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.6濾膜吸附實(shí)驗(yàn) 取本品1粒,加入pH值1.2鹽酸900 mL,超聲處理30 min,作為供試品溶液,同法制備另外3種介質(zhì)的供試品溶液。取供試品溶液適量離心處理,取上清液;另取供試品溶液1.5 mL過孔徑0.45 μm濾膜,棄去濾液一半后取續(xù)濾液。取上述2種溶液按“2.3.1節(jié)”色譜條件測定,記錄峰面積,計(jì)算濾膜對(duì)頭孢克肟的吸附率,公式如下:

結(jié)果顯示,4種供試品溶液的吸附率分別為0.67%、0.49%、0.56%和0.44%,表明濾膜對(duì)頭孢克肟無明顯吸附作用。

2.3.7溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取“2.3.6節(jié)”4種供試品溶液,過濾后于室溫放置0、2、4、6和8 h后,按“2.3.1節(jié)”色譜條件測定,結(jié)果4種供試品溶液的峰面積RSD分別為0.48%、0.18%、0.10%和0.26%,表明供試品溶液在室溫8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取本品,按“2.2節(jié)”制備各介質(zhì)的供試品溶液,于溶出終點(diǎn)取樣,重復(fù)取樣6次,按“2.3.1節(jié)”色譜條件測定,記錄峰面積,見表3,結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.9回收率實(shí)驗(yàn) 分別精密量取“2.2節(jié)”貯備液0.5、1和2 mL,置20 mL量瓶,加入相當(dāng)于1粒頭孢克肟膠囊的空白輔料和膠囊殼,并用相應(yīng)介質(zhì)稀釋配制成相當(dāng)于標(biāo)示量(111 μg·mL-1)25%、50%和100%的溶液,各介質(zhì)每個(gè)濃度溶液平行制備3份,按“2.3.1節(jié)”色譜條件測定,見表4,結(jié)果表明本方法回收率良好。

表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.10耐用性實(shí)驗(yàn) 按“2.2節(jié)”方法制備pH值7.5 PBS介質(zhì)的供試品溶液(90 min取樣)和對(duì)照品溶液,以“2.3.1節(jié)”色譜條件為基礎(chǔ),按表5條件和參數(shù)進(jìn)行調(diào)整,每個(gè)色譜條件進(jìn)樣測定3次,按外標(biāo)法計(jì)算供試品溶液藥物濃度的RSD,結(jié)果見表5,表明本方法耐用性良好。

表5 耐用性考察結(jié)果

2.4溶出曲線測定和相似性評(píng)價(jià) 取本品參比制劑(批號(hào):CB011)和仿制制劑3批(批號(hào):02180401、02180501和02180502),按“2.1節(jié)”進(jìn)行溶出度實(shí)驗(yàn)(n=12),于各時(shí)間點(diǎn)分別取溶出液1.5 mL,過濾后按“2.3.1節(jié)”色譜條件測定,以外標(biāo)法計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的溶出度,結(jié)果見表6—9,溶出曲線見圖5。參考《普通口服固體制劑溶出度實(shí)驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》[11],采用相似因子(f2)法評(píng)價(jià)兩制劑溶出曲線的相似性,計(jì)算公式如下:

表6 pH值1.2鹽酸中的溶出實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表7 pH值6.8 PBS中的溶出實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表8 pH值7.5 PBS中的溶出實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表9 水中的溶出實(shí)驗(yàn)結(jié)果

A.pH值1.2鹽酸;B.pH值6.8 PBS;C.pH值7.5 PBS;D.水。

式中Rt和Tt分別表示參比制劑與受試制劑在各取樣時(shí)間點(diǎn)的溶出度,n為取樣時(shí)間點(diǎn)個(gè)數(shù),當(dāng)f2≥50,可判斷兩制劑的溶出曲線相似。結(jié)果顯示,3批仿制制劑與參比制劑在4種介質(zhì)中的f2因子均>50,見表10,表明仿制制劑和參比制劑的溶出行為一致。

表10 頭孢克肟膠囊在不同介質(zhì)中的相似因子(f2)

2.5生物等效性實(shí)驗(yàn) 取頭孢克肟膠囊仿制制劑(T,批號(hào):02180401)和參比制劑(R,批號(hào):CB011),采用單中心、隨機(jī)、開放、單劑量、兩制劑、兩序列、兩周期交叉給藥實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法(清洗期4 d)進(jìn)行空腹和餐后人體生物等效性實(shí)驗(yàn)(空腹和餐后實(shí)驗(yàn)健康受試者各30例),受試者入選標(biāo)準(zhǔn):年齡≥18歲的健康受試者;身體質(zhì)量指數(shù)19.0～26.0 kg·m-2;男性體質(zhì)量≥50.0 kg,女性體質(zhì)量≥45.0 kg;無心血管、血液、肝、腎、內(nèi)分泌、呼吸、消化、神經(jīng)、精神、免疫、皮膚及代謝紊亂等疾病病史?？崭箤?shí)驗(yàn)于給藥前0 h(30 min內(nèi))和給藥后1.0、2.0、3.0、3.33、3.67、4.0、4.33、4.67、5.0、5.5、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、24.0 h時(shí)間點(diǎn)采集靜脈血,餐后實(shí)驗(yàn)于給藥前0 h(30 min內(nèi))和給藥后1.0、2.0、3.0、3.5、4.0、4.33、4.67、5.0、5.33、5.67、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、24.0 h時(shí)間點(diǎn)采集靜脈血[12],檢測各血樣中頭孢克肟的血藥濃度[13],通過Phoenix WinNonlin 7.0版軟件計(jì)算頭孢克肟藥動(dòng)學(xué)參數(shù)[藥-時(shí)曲線下面積(AUC0-t和AUC0-∞)],并用SAS9.4版統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)關(guān)鍵藥動(dòng)學(xué)參數(shù)達(dá)峰濃度(Cmax)、AUC0-t和AUC0-∞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,評(píng)價(jià)兩制劑生物等效性,結(jié)果見表11[14]。結(jié)果顯示,仿制制劑和參比制劑空腹和餐后藥動(dòng)學(xué)參數(shù)幾何均值比90%置信區(qū)間均在80%～125%,表明兩制劑生物等效[15]。

表11 兩種制劑的生物等效性評(píng)價(jià)結(jié)果

3 討論

3.1檢測方法的優(yōu)化 2020年版《中華人民共和國藥典》[6]收載的溶出度測定法為紫外-可見分光光度法,溶出液需要稀釋后才能測定,且不同介質(zhì)、不同時(shí)間的藥物濃度跨度較大,難以統(tǒng)一稀釋操作,不利于高通量樣品檢測。《醫(yī)療用醫(yī)藥品品質(zhì)情報(bào)集》[7]的HPLC法可直接進(jìn)樣檢測,但單個(gè)樣品的檢測時(shí)間約為15 min,且流動(dòng)相對(duì)色譜柱填料的損耗較大,需頻繁更換色譜柱。本研究優(yōu)選核殼型C18色譜柱、以乙腈-三氟乙酸水溶液為流動(dòng)相,建立了快速測定頭孢克肟膠囊溶出度的HPLC法,既省去了繁瑣操作,又減少了人為誤差,單個(gè)樣品的檢測時(shí)間約為1 min,極大地縮短了檢測時(shí)間、減少了有機(jī)溶劑和色譜柱的耗費(fèi),提高了檢測效率,達(dá)到降本增效的目的,適合研發(fā)和生產(chǎn)中高通量樣品的分析應(yīng)用。

3.2溶出方法的選擇 本研究參考《醫(yī)療用醫(yī)藥品品質(zhì)情報(bào)集》[7]采用槳法(50 r·min-1),與2020年版《中華人民共和國藥典》[6]的籃法(100 r·min-1)相比,更有區(qū)分力,能更好地反映制劑的內(nèi)在質(zhì)量差異。頭孢克肟主要在小腸吸收[2],結(jié)合本研究在4種介質(zhì)中的溶出情況,pH值6.8 PBS介質(zhì)可模擬小腸環(huán)境,且區(qū)分力較好,在處方工藝開發(fā)過程可作為重點(diǎn)考察的關(guān)鍵介質(zhì)。

3.3體內(nèi)外相關(guān)性 溶出曲線研究是評(píng)價(jià)口服固體制劑內(nèi)在質(zhì)量差異,保證臨床用藥有效的一種重要手段。本實(shí)驗(yàn)3批仿制制劑在體外多種介質(zhì)中與參比制劑的相似因子(f2)均>60,表明仿制制劑與參比制劑在各介質(zhì)中的溶出行為一致,批間差異小,且仿制制劑和參比制劑在人體內(nèi)空腹和餐后均為生物等效,表明本實(shí)驗(yàn)的溶出方法在一定程度上能預(yù)測藥物在體內(nèi)的溶解情況,可為頭孢克肟膠囊的一致性評(píng)價(jià)提供借鑒。