胡楠,蔣振偉,錢敏燕,張雯婷,陳陸俊,鄭曉,應(yīng)漢杰,蔣敬庭

(1.蘇州大學附屬第三醫(yī)院藥學部,常州 213000;2.蘇州大學附屬第三醫(yī)院腫瘤生物診療中心,常州 213000;3.南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院,南京 211816)

蟲草素(cordycepin,Cor)又稱3-脫氧腺苷,是蛹蟲草的主要活性成分,是從真菌分離出的第一個核苷類抗生素[1]。作為一種腺苷衍生物,蟲草素具有降糖降脂、保護神經(jīng)、抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等多種藥理作用[2-3]。蟲草素可通過嘌呤核苷代謝途徑,在腺苷脫氨酶催化作用下快速脫氨形成代謝產(chǎn)物3′-脫氧肌苷(3′-deoxyinosine,3′-Deo)[4]。蟲草素及代謝物的化學結(jié)構(gòu)式見圖1。蟲草素的快速脫氨使其在體內(nèi)半衰期短,清除率高。因此,蟲草素無論是口服還是靜脈注射給藥,在體內(nèi)的暴露量都非常少。有研究報道,灌胃給藥后大鼠全血樣品中未檢測到蟲草素原型藥物,大鼠靜脈給予蟲草素后在體內(nèi)半衰期僅1.6 min[5-6]。蟲草素發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)目前尚未明確,且由于樣本采集以及分析方法局限性,限制了對蟲草素在體內(nèi)代謝過程的客觀評估和宏觀認識。因此,筆者在本研究建立一種同時測定大鼠血漿蟲草素及3′-Deo濃度的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)方法,并應(yīng)用于藥動學研究。

圖1 蟲草素(Cor)、3′-脫氧肌苷(3′-Deo)和內(nèi)標2-氯腺苷(2-Chl)的結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1儀器 Jasper高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀、Triple Quad 4500MD三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(上海愛博才思分析儀器貿(mào)易有限公司),Vortex-Genie 2渦旋混合器(美國英思科公司),5417R低溫高速離心機(艾本德中國有限公司),Direct-Q純水儀(密理博中國有限公司),BT25S電子分析天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司,感量:0.01 mg)。

1.2試劑 蟲草素對照品(南京生命原健康科技有限公司,含量:94%,批號:SC11332019200201);3′-Deo(中國食品藥品檢定研究院,批號:140813-201501);內(nèi)標2-氯腺苷(2-chloadenosine,2-Chl,阿拉丁公司,批號:B2212295,含量:99%);甲醇(Merck公司,色譜純);乙酸銨(Sigma-Aldrich公司,分析純)。

1.3實驗動物 雄性SD大鼠[常州卡文斯實驗動物有限公司提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK (蘇)2021-0013,實驗動物合格證號:202111743]。

1.4方法

1.4.1色譜條件 Kinetex C18(3 mm×100 mm,2.6 μm)(Phenomenex,USA),流動相A:水(5 mmol·L-1乙酸銨),流動相B:甲醇。梯度洗脫,流動相A和B比例:0～0.5 min,95：5;0.5～2 min,25：75;2～3.5 min,25：75;3.5～3.7 min,5：95;3.7～5.2 min,5：95;5.2～5.3 min,95：5;5.3～6 min,95：5。流速:0.45 mL·min-1,柱溫40 ℃。

1.4.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(electron spray ionization,ESI)正離子檢測模式,多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)掃描。蟲草素、3′-Deo和2-Chl選用離子對、去簇電壓和碰撞電壓分別為蟲草素:m/z 252.2→136.2,88 V和22 V;3′-Deo:m/z253.2→137.1,40 V和21 V;內(nèi)標2-Chl:m/z302.1→170.1,50 V和24 V。

1.4.3標準品儲備液的配制 精密稱取蟲草素10 mg,3′-Deo 10 mg,2-Chl 5 mg,分別加入適量甲醇溶解,配制成蟲草素、3′-Deo和2-Chl濃度分別為1、2、1 mg·mL-1的標準品儲備液。

1.4.4血漿樣品的處理 取血漿50 μL,加入含有內(nèi)標2-Chl(10 ng·mL-1)的甲醇溶液150 μL沉淀蛋白,渦旋震蕩3 min,16 400 r·min-1離心10 min (r=8.8 cm),取上清液100 μL,加超純水100 μL,渦旋30 s,16 400 r·min-1離心10 min (r=8.8 cm),取上清液進樣。

1.4.5方法學驗證 ①專屬性實驗 取不同來源大鼠空白血漿6份、加入待測藥物對照品的大鼠血漿樣品、用藥后血漿樣品,按照“1.4.4節(jié)”方法處理分析。

②標準曲線和定量下限 精密量取蟲草素與3′-Deo儲備液適量,加甲醇溶液梯度稀釋成分別含蟲草素5、10、20、50、100、200、500、1 000 ng·mL-1,3′-Deo10、20、50、100、200、500、1 000、2 000 ng·mL-1標準系列工作溶液。取工作液5 μL,加空白血漿45 μL,配成相當于蟲草素0.5、1、2、5、10、20、50、100 ng·mL-1,3′-Deo1、2、5、10、20、50、100、200 ng·mL-1的標準曲線。按照“1.4.4節(jié)”方法處理。以待測物與內(nèi)標物峰面積比為縱坐標(Y)、待測物濃度 (ng·mL-1)為橫坐標(X),以加權(quán)(W=1/X2)最小二乘法進行線性回歸運算。

③精密度與準確度 取標準品儲備液加入空白血漿,配制成分別含蟲草素和3′-Deo低、中、高濃度的質(zhì)量控制(quality control,QC)樣本,其中蟲草素濃度分別為1.5、7.5和75 ng·mL-1,3′-Deo濃度分別為2.5、20和160 ng·mL-1。按照“1.4.4節(jié)”方法處理,每個濃度取6份,在2周內(nèi)測定3次。根據(jù)當天標準曲線計算QC樣品濃度,得到批內(nèi)和批間精密度、準確度。

④提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 按“精密度與準確度”項下制備蟲草素和3′-Deo各3個濃度QC樣本,按照“1.4.4節(jié)”方法處理、進樣,測得待測物峰面積比值A(chǔ)1。取空白血漿進行預處理,分別取上清液加入相應(yīng)低、中、高濃度標準溶液,每個濃度6份,測得待測物峰面積比(A2),提取回收率(%)=A1/A2×100%。取純化水代替空白血漿進行上述操作,制備基質(zhì)效應(yīng)考察樣本,測得待測物峰面積比(A3),基質(zhì)效應(yīng)(%)=A2/A3×100%。

⑤穩(wěn)定性實驗 按“精密度與準確度”項下制備蟲草素和3′-Deo各3個濃度QC樣本,分別考察蟲草素室溫和4 ℃下放置15、30、60、120、180和480 min,-20 ℃和-80 ℃下放置8、12、24和48 h后穩(wěn)定性,-80 ℃凍融1次及以上穩(wěn)定性以及進樣器4 ℃8 h穩(wěn)定性?？疾?′-Deo室溫和4 ℃ 8 h穩(wěn)定性,-20和-80 ℃下48 h穩(wěn)定性,-80 ℃凍融3次穩(wěn)定性和進樣器4 ℃8 h穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1專屬性實驗結(jié)果 蟲草素、3′-Deo與內(nèi)標2-Chl保留時間分別為3.15、2.85和3.29 min,血漿內(nèi)源性物質(zhì)在待測物保留時間內(nèi)無干擾,結(jié)果見圖2。

A.空白血漿;B.空白血漿加標準品;C.大鼠給藥后血漿樣品。

2.2標準曲線與定量下限 蟲草素標準曲線為:Y=3.425 9X+0.253 4(r=0.998 3),在0.5～100 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,定量下限0.5 ng·mL-1(S/N>10)。3′-Deo標準曲線為:Y=0.195 8X+0.288 6(r=0.998 6),在1～200 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,定量下限1 ng·mL-1(S/N>10)?？蓾M足血漿樣本中蟲草素與3′-Deo含量測定。

2.3精密度與準確度實驗結(jié)果 蟲草素與3′-Deo低、中、高濃度質(zhì)控樣本精密度和準確度良好,日內(nèi)與日間RSD均<10%,準確度水平均>95%,均符合生物樣本分析要求,結(jié)果見表1。

表1 蟲草素與3′-Deo準確度與精密度實驗結(jié)果

2.4提取回收率與基質(zhì)效應(yīng) 蟲草素及3′-Deo低、中、高濃度質(zhì)控樣本提取回收率良好,蟲草素及3′-Deo提取回收率別為89.6%～106.7%和87.9%～94.4%,兩種物質(zhì)RSD均不超過7.3%。蟲草素及3′-Deo基質(zhì)效應(yīng)分別為90.2%～117.3%和95.2%～100.0%,RSD<9.1%,結(jié)果見表2。

表2 蟲草素與3′-Deo提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)

2.5穩(wěn)定性 本研究主要考察室溫穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性、4 ℃穩(wěn)定性、-20 ℃穩(wěn)定性、-80 ℃穩(wěn)定性及進樣器穩(wěn)定性。

血漿樣本中的蟲草素在室溫和4 ℃放置時穩(wěn)定性較差,隨著時間延長,降解增加(圖3),其中室溫放置15 min和4 ℃放置30 min內(nèi)降解率<15%。蟲草素在-20 ℃和-80 ℃ 保存48 h內(nèi)較穩(wěn)定(圖3)。室溫下不同濃度蟲草素在血漿樣本中的降解和代謝物3′-Deo生成情況見圖4。隨著時間延長,血漿蟲草素含量逐漸減少,而代謝物3′-Deo含量逐漸增加,8 h后血漿幾乎檢測不到蟲草素,代謝物3′-Deo生成量占原藥71.2%～89.6%。

A.室溫;B.4℃;C.-20 ℃;D.-80 ℃。

A.蟲草素1.5 ng·mL-1;B.蟲草素7.5 ng·mL-1;C.蟲草素75 ng·mL-1。

蟲草素在室溫15 min、4 ℃ 30 min、-20 ℃ 48 h、-80 ℃ 48 h、自動進樣器4 ℃ 8 h、凍融一次條件下穩(wěn)定(表3)。蟲草素在凍融2次及以上穩(wěn)定性差。3′-Deo穩(wěn)定性較好,在室溫8 h、4 ℃ 8 h、-20 ℃48 h、-80 ℃48 h、自動進樣器4 ℃ 8 h、凍融3次條件下穩(wěn)定(表4)。

表3 蟲草素穩(wěn)定性實驗結(jié)果

表4 3′-Deo穩(wěn)定性實驗結(jié)果

2.6藥動學研究結(jié)果 大鼠灌胃蟲草素 10 mg·kg-1后血漿蟲草素與3′-Deo藥動學參數(shù)見表5。蟲草素與3′-Deo血藥濃度-時間曲線見圖5。

表5 大鼠灌胃蟲草素后蟲草素與3’ -Deo的藥動學參數(shù)

圖5 大鼠灌胃蟲草素10 mg·kg-1后蟲草素 (A)與3′-Deo (B)血藥濃度-時間曲線

3 討論

筆者在本研究建立了一種具有較高靈敏度和準確度、可同時檢測血漿樣本中蟲草素及代謝物3′-Deo的LC-MS/MS方法。蟲草素極性較大,在HILIC柱中保留較差,在C18柱中保留較好。筆者考察了不同流速(0.35、0.4和0.5 mL·min-1)的影響,發(fā)現(xiàn)隨著流速增大,3′-Deo峰型變差,出現(xiàn)裂峰,0.35 mL·min-1流速較合適。此外,有機相比例增加會導致3′-Deo峰展寬并伴隨基線升高,但對蟲草素無影響。

蟲草素在血漿樣本中穩(wěn)定性較差,室溫放置超過15 min或4 ℃放置超過30 min可降解超過15%。在空白血漿樣本中加入蟲草素,室溫下放置8 h后血漿中蟲草素幾乎全部降解。為進一步研究蟲草素降解過程,筆者對蟲草素血漿樣本室溫放置不同時間后的濃度進行了動態(tài)分析,發(fā)現(xiàn)隨著血漿中蟲草素含量降低,代謝物3′-Deo含量逐漸增加,3′-Deo生成量占原藥71.2%～89.6%,提示血漿中的酶無論是在體內(nèi)還是體外均可代謝蟲草素,且3′-Deo是生成含量最多的代謝物。為保證藥動學研究準確性,對蟲草素藥動學操作流程進行優(yōu)化,縮短樣本在室溫放置時間,加快樣本處理過程,即取血后立即在低溫下處理樣本,并將整個過程控制在30 min內(nèi),減少蟲草素在血漿樣本中的降解。

臨床應(yīng)用蟲草素一般采取口服給藥,動物研究常采用灌胃給藥途徑,劑量2～50 mg·kg-1[7-9]。有關(guān)蟲草素藥動學研究的報道筆者較少見到。吳靈玉等[5]通過HPLC法檢測大鼠灌胃40 mg·kg-1蟲草素后血藥濃度,由于HPLC檢測靈敏度限制,給藥后10～120 min均未檢測到蟲草素原型藥物。LEE等[10]研究了大鼠灌胃蟲草素8 mg·kg-1藥動學,同樣未檢測到蟲草素原型。本研究中,由于采用了高靈敏度LC-MS/MS方法,在多個時間點檢測到血漿中蟲草素濃度,但蟲草素在大鼠體內(nèi)暴露量非常低,血藥濃度僅約10 ng·mL-1。在吳靈玉等[5]的研究中,曾檢測到一個分子量為252的未知代謝物(推測為3′-Deo),該物質(zhì)在30 min時含量最高,隨后降低,而在本研究中3′-Deotmax為(29.2±8.4)min,與之一致。LEE等[10]也在血漿中檢測到了代謝物3′-Deo,其Cmax為(202±98)ng·mL-1,t1/2為(1.11±0.39)h,AUC為(17 820±2 160) ng·min·mL-1,與本研究中3′-Deo的藥動學參數(shù),Cmax為(142±50)ng·mL-1,t1/2為(100.4±27.5) min,AUC為(18 034±4 981)ng·min·mL-1,較為接近。也有學者研究了大鼠靜脈注射給藥蟲草素(10 mg·kg-1)藥動學,其結(jié)果顯示全血中蟲草素峰濃度較高[(3.1±0.9) μg·mL-1],但半衰期短[(1.6±0.0) min][6]。

蟲草素在體內(nèi)可被代謝生成多種代謝物,但有關(guān)其代謝物的鑒定尚未明確[11]。血漿中檢測到含量最多的代謝物是3′-Deo,但對其的活性及藥理作用目前尚無統(tǒng)一認識。目前普遍認為,3′-Deo是蟲草素的一種無活性代謝物[10,12]。也有研究認為,3′-Deo具有一定抗寄生蟲、抗腫瘤作用[13-15]。近期有學者提出,蟲草素在體內(nèi)存在補償代謝途徑,即3′-Deo可轉(zhuǎn)化為有活性的5'-三磷酸蟲草素,從而發(fā)揮藥理作用[10]。對蟲草素口服吸收和生物轉(zhuǎn)化過程以及暴露-效應(yīng)關(guān)系的研究,對于闡明蟲草素發(fā)揮各種藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)具有重要意義。蟲草素及其代謝物的體內(nèi)代謝過程及其與藥理活性的關(guān)系,仍有待進一步深入研究。