陳曉靜,周莉,劉凱琪,段菊鳳,劉明,李洪亮,汪選斌,2,3

[1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院藥學(xué)部和藥學(xué)院,十堰 442000;2.湖北醫(yī)藥學(xué)院生物醫(yī)藥研究院,十堰 442000;3.武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖北醫(yī)藥學(xué)院),十堰 442000]

預(yù)知子(AkebiaeFructus)為湖北武當(dāng)山地區(qū)特色中藥,α-常春藤皂苷(α-hederin)為其主要活性成分,也是其質(zhì)量標(biāo)志物[1-2]。α-常春藤皂苷可體外抑制胰腺癌、肺腺癌、喉癌、結(jié)腸癌、組織細(xì)胞淋巴瘤、急性單核白血病等細(xì)胞的增殖[3-4],在體內(nèi)亦可抑制肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[5],可導(dǎo)致HCC胞膜孔隙形成[4,6],使活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)升高,膜滲透性增加,產(chǎn)生凋亡[5,7-9],抑制HCC轉(zhuǎn)移[10]。但α-常春藤皂苷誘導(dǎo)HCC凋亡的機(jī)制尚不完全清楚。筆者在本研究將α-常春藤皂苷作用于HCC,研究其誘導(dǎo)凋亡可能的機(jī)制,以期為解釋預(yù)知子抗肝癌作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡雄性Balb/c裸鼠10只,無(wú)特定病原體(specific pathogen free,SPF)級(jí),購(gòu)買(mǎi)于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,飼養(yǎng)于湖北醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2019-0010。實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理規(guī)定[倫理審查批件編號(hào):TY20222505,湖北醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)(福)第2022-實(shí)090號(hào)]。

1.2藥品與試劑 α-常春藤皂苷購(gòu)于成都埃法生物科技有限公司(貨號(hào):AB1189,含量>98%);陽(yáng)性對(duì)照藥喜樹(shù)堿(camptothecin,CPT)購(gòu)于Selleck公司(上海),貨號(hào):S1288;噻唑藍(lán)[3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,MTT]購(gòu)于合肥Biosharp公司(貨號(hào):3580GR001);PI/Annexin V 凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于BD生命科學(xué)(美國(guó)Becton,Dickinson and Company,貨號(hào):556547);Noxa單抗隆一抗(兔抗人,1：1 000,貨號(hào):14766S)、p-p53單抗隆一抗(兔抗人,1：1 000,貨號(hào):9287T),p53單抗隆一抗(兔抗人,1：1 000,貨號(hào):2527S)、Bcl-2單抗隆一抗(小鼠抗人,1：1 000,貨號(hào):3498T)、Bax單抗隆一抗(兔抗人,1：1 000,貨號(hào):5023)、Cytc單抗隆一抗(小鼠抗人,1：1 000,貨號(hào):4280T)、caspase 3單抗隆一抗(小鼠抗人,1：1 000,貨號(hào):9662)、Cleaved-caspase3單抗隆一抗(兔抗人,1：1 000,貨號(hào):9579)、caspase9單抗隆一抗(小鼠抗人,1：1 000,貨號(hào):9504)、Cleaved-caspase9單抗隆一抗(兔抗人,1：1 000,貨號(hào):9509)、PARP單抗隆一抗(兔抗人,1：1 000,貨號(hào):9532)、Cleaved-PARP單抗隆一抗(兔抗人,1：1 000,貨號(hào):5625)以及相應(yīng)二抗均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate delydrogenase,GAPDH)單克隆一抗(小鼠抗人,1：1 000)購(gòu)自Proteintech(美國(guó)蛋白質(zhì)技術(shù)公司,貨號(hào):60004)。小干擾RNA干擾siRNA Noxa購(gòu)自美國(guó)Santa Cruze公司(貨號(hào):14766S),小干擾RNA干擾siRNA p53購(gòu)自美國(guó)Santa Cruze公司(貨號(hào):K0816)。

1.3儀器 酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司,型號(hào):A5082);流式細(xì)胞分析儀(美國(guó)Beckman Coulter公司,型號(hào):CytoFLEX);二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司,型號(hào):Model 3111);凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司,型號(hào):ChemiDocTM XRS+)。

1.4細(xì)胞及培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞系Bel-7402和HepG2來(lái)自湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院中藥藥理實(shí)驗(yàn)室。細(xì)胞以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2環(huán)境中。

1.5MTT檢測(cè) 參照文獻(xiàn)檢測(cè)α-常春藤皂苷對(duì)HCC的體外抑制作用[12],將HCC細(xì)胞分別與0(對(duì)照組,Control組)、10、15、20和30 μmol·L-1α-常春藤皂苷共培養(yǎng)0、24和48 h。5 mg·mL-1MTT染色,酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490 nm處讀取吸光度值,計(jì)算細(xì)胞抑制率。

1.6流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)檢測(cè) 以Annexin V-FITC/PI染色,并以FCM檢測(cè)凋亡率[12]。即將Bel-7402和HepG2細(xì)胞接種到6孔板,24 h后加入0(對(duì)照組,Control組)、10、20、30 μmol·L-1α-常春藤皂苷。按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行:Annexin V(1.25%,5 μL)-FITC/PI(20 μg·mL-1,5 μL)于室溫下避光染色5 min,流式細(xì)胞分析儀上檢測(cè)凋亡。

1.7轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析 將0(對(duì)照組,s0)、10(s10)、20(s20)和30(s30) μmol·L-1α-常春藤皂苷作用于HCC 24 h。收集樣品并送上海Bioin生物技術(shù)有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測(cè)。

1.8RNA干擾 將Bel-7402細(xì)胞分為對(duì)照組、siRNA干擾空白組(Con siRNA)、siRNA組(p53 siRNA或Noxa siRNA)和siRNA-p53/Noxa+α-hederin組(siRNA-p53+α-hederin 30 μmol·L-1或siRNA-Noxa+α-hederin 30 μmol·L-1)。HCC細(xì)胞于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期置于6孔板,CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。將脂質(zhì)體3000(lipofectamine 3000,美國(guó)Invitrogen公司)加入Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋,稀釋比例1：1。加入細(xì)胞轉(zhuǎn)染48～72 h,以蛋白免疫印跡(western blotting,WB)檢測(cè)蛋白表達(dá)變化。

1.9實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR) 為檢測(cè)α-常春藤皂苷及RNA干擾對(duì)HCC基因的影響,以qRT-PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá)[11](表1)。

表1 qRT-PCR引物序列

1.10WB實(shí)驗(yàn) 在α-常春藤皂苷(10、20和30 μmol·L-1),喜樹(shù)堿(陽(yáng)性對(duì)照,10 μmol·L-1),脂質(zhì)體-質(zhì)粒干預(yù)HCC細(xì)胞24 h前后進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)[11],于凝膠成像儀檢測(cè)蛋白條帶。

1.11蛋白穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 以放線菌酮(cycloheximide,CHX,50 μg·mL-1)和(或)α-常春藤皂苷作用于Bel-7402及HepG2細(xì)胞0(對(duì)照組,Control組)、1、2、4、6和8 h[12],WB檢測(cè)蛋白表達(dá)量。

1.12體內(nèi)移植瘤實(shí)驗(yàn) 取生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Bel-7402細(xì)胞,于裸鼠前肢右側(cè)腋下接種0.2 mL(細(xì)胞密度1×106個(gè)·mL-1)。造模24 h后每2 d觀察瘤體生長(zhǎng)情況,約1周后,接種的裸鼠均出現(xiàn)圓形或橢圓形、直徑約11 mm皮下質(zhì)硬結(jié)節(jié),即為造模成功。將造模成功的小鼠正常喂養(yǎng),隨機(jī)分為模型組(DMSO)和給藥組(α-常春藤皂苷10 mg·kg-1),每組5只,腹腔注射給藥。小鼠稱(chēng)體質(zhì)量,檢測(cè)瘤體大小,觀察22 d內(nèi)裸鼠腫瘤體積變化,給藥完畢后處死裸鼠,剝離腫瘤并稱(chēng)質(zhì)量,瘤體置-80 ℃冰箱備用。

2 結(jié)果

2.1α-常春藤皂苷誘導(dǎo)HCC細(xì)胞凋亡 以不同濃度α-常春藤皂苷[0(對(duì)照組)、10、15、20和30 μmol·L-1]干預(yù)Bel-7402和HepG2細(xì)胞24、48 h后,細(xì)胞存活率均呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性下降(圖1A)。FCM結(jié)果顯示,HCC細(xì)胞呈劑量依賴(lài)性凋亡(圖1B)。WB結(jié)果顯示,裂解態(tài)凋亡蛋白比例增加,提示α-常春藤皂苷可上調(diào)Bel-7402和HepG2細(xì)胞中凋亡蛋白PARP、Caspase9和Caspase3活性(圖2)。

A.α-常春藤皂苷干預(yù)后肝癌細(xì)胞生存率曲線;B.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝癌細(xì)胞的凋亡情況。①與對(duì)照組比較,t=1.667～29.33,P<0.05;②與對(duì)照組比較,t=-49.06～-11.27,P<0.01。

A.α-常春藤皂苷對(duì)Bel-7402中凋亡蛋白的影響;B.α-常春藤皂苷對(duì)HepG2中凋亡蛋白的影響。CPT為陽(yáng)性對(duì)照。①與α-常春藤皂苷濃度為0組比較,t=-0.880 0～0.123 3,P<0.01。

2.2α-常春藤皂苷激活HCC細(xì)胞的p53/Noxa通路 見(jiàn)圖3。轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn),作用于Bel-7402細(xì)胞24 h后,α-常春藤皂苷10 μmol·L-1組較對(duì)照組(s0組)上調(diào)基因365個(gè),下調(diào)基因122個(gè);而α-常春藤皂苷20 μmol·L-1組(s20組)和30 μmol·L-1組(s30組)分別上調(diào)基因336和2 596個(gè),下調(diào)基因155和2 226個(gè)(圖3A)。

A.α-常春藤皂苷干預(yù)Bel-7402細(xì)胞差異基因的韋恩圖;B、C.α-常春藤皂苷干預(yù)Bel-7402細(xì)胞差異基因的熱圖;D.α-常春藤皂苷干預(yù)Bel-7402細(xì)胞差異基因的信號(hào)通路圖;E.KEGG分析Noxa與凋亡、p53信號(hào)的相關(guān)性。s0:空白對(duì)照組;s10.α-常春藤皂苷10 μmol·L-1組;s20.α-常春藤皂苷20 μmol·L-1組;s30.α-常春藤皂苷30 μmol·L-1組。

A.α-常春藤皂苷對(duì)Bel-7402細(xì)胞p53/Noxa通路蛋白表達(dá)的影響;B.α-常春藤皂苷對(duì)HepG2細(xì)胞p53/Noxa通路蛋白表達(dá)的影響。①與α-常春藤皂苷濃度為0 μmol·L-1時(shí)比較,t=-1.313～0.21,P<0.01。

α-常春藤皂苷30 μmol·L-1組與對(duì)照組(Control)熱圖比較,差異顯著(圖3B),顯示Bax、PMIAP1(Noxa)、Cytc和TP53(p53)表達(dá)上調(diào)(圖3C)。將158個(gè)差異基因在京都基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)和基因本體(Gene Ontology,GO)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能富集分析,發(fā)現(xiàn)p53為重要信號(hào)之一(圖3D)。α-常春藤皂苷還可上調(diào)HCC類(lèi)固醇/萜類(lèi)骨架生物合成信號(hào)(圖3B)。通過(guò)癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)p53信號(hào)與Noxa mRNA水平關(guān)系密切,提示與促凋亡正相關(guān)(圖3E)。WB結(jié)果也發(fā)現(xiàn)α-常春藤皂苷增加了p-p53、Noxa、Bax和Cytc蛋白的表達(dá),下調(diào)了Bcl-2蛋白的表達(dá),與轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果近似,提示α-常春藤皂苷增加了Noxa表達(dá),并可提高p53活性(圖4)。

2.3Noxa/p53是α-常春藤皂苷誘導(dǎo)HCC細(xì)胞凋亡的重要信號(hào) 以siRNA敲低p53和Noxa,siRNA-Noxa可減少Noxa的mRNA和蛋白表達(dá)(圖5A和5B);siRNA-p53可減少p53的mRNA和蛋白表達(dá)(圖5C和5D),提示α-常春藤皂苷可激活p53/Noxa信號(hào)。α-常春藤皂苷可逆轉(zhuǎn)siRNA-Noxa和siRNA-p53所致的低凋亡率(圖6)。

A.Noxa siRNA轉(zhuǎn)染的HCC細(xì)胞中Noxa mRNA和蛋白的表達(dá);B.α-常春藤皂苷對(duì)Noxa siRNA轉(zhuǎn)染的HCC細(xì)胞中p53/Noxa蛋白表達(dá)的影響;C.p53 siRNA轉(zhuǎn)染的HCC細(xì)胞中Noxa mRNA和蛋白的表達(dá);D.α-常春藤皂苷對(duì)p53 siRNA轉(zhuǎn)染的HCC細(xì)胞中p53/Noxa蛋白表達(dá)的影響。siRNA/NC表示轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒。①與siRNA/NC比較,t=-0.050 0～0.206 7,P<0.05;②與siRNA/NC比較,t=-1.463～1.237,P<0.01。

2.4α-常春藤皂苷增加HCC細(xì)胞中p53/Noxa蛋白穩(wěn)定性 CHX干預(yù)結(jié)果提示,p53和Noxa蛋白水平呈時(shí)間依賴(lài)性下降,給予α-常春藤皂苷后,p53和Noxa蛋白降解延遲(圖7)。

2.5α-常春藤皂苷抑制體內(nèi)移植瘤的生長(zhǎng) 與模型組比較,α-常春藤皂苷可抑制肝癌體內(nèi)移植瘤生長(zhǎng),該結(jié)果與體外細(xì)胞抑制結(jié)果相符(圖8)。

圖8 α-常春藤皂苷對(duì)肝癌體內(nèi)移植瘤的抑制作用

3 討論

HCC是預(yù)后差的惡性腫瘤[13-14]。近年來(lái),中藥抗肝癌研究日益引起研究者的興趣[15-16]。α-常春藤皂苷是武當(dāng)特色中藥預(yù)知子的活性成分和《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的預(yù)知子質(zhì)量標(biāo)志物,具有抗病毒、抗炎和抗腫瘤作用[17-19]。但α-常春藤皂苷是否通過(guò)Bcl-2相關(guān)的信號(hào)p53/Noxa發(fā)揮作用尚不明確。本研究中,α-常春藤皂苷可呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性地降低HCC細(xì)胞存活率,增加凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)蛋白活化,提示發(fā)生了凋亡。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn),α-常春藤皂苷干預(yù)后肝癌細(xì)胞Bax/Bcl-2、PMIAP1(Noxa)、Cytc和TP53(p53)表達(dá)增加[20]。KEGG分析發(fā)現(xiàn)Noxa與p53相關(guān)的凋亡信號(hào)密切相關(guān)。WB和RNA干擾結(jié)果也發(fā)現(xiàn),α-常春藤皂苷干預(yù)后肝癌細(xì)胞p53/Noxa信號(hào)激活。由于Noxa屬于僅含有BH3的Bcl-2家族蛋白,包括了啟動(dòng)區(qū)-155到-174位的p53潛在識(shí)別序列[21],本研究通過(guò)α-常春藤皂苷誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡,進(jìn)一步證實(shí)了激活p53/Noxa與凋亡的關(guān)系(圖9)[22]。前人文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)α-常春藤皂苷與人類(lèi)組織細(xì)胞淋巴瘤U973和人急性單細(xì)胞性白血病細(xì)胞THP-1的膜膽固醇存在相互作用而導(dǎo)致孔隙形成[4]。筆者的研究也發(fā)現(xiàn),α-常春藤皂苷可上調(diào)肝癌細(xì)胞類(lèi)固醇/萜類(lèi)骨架生物合成信號(hào),與前人研究結(jié)果近似,值得進(jìn)一步探討。

圖9 α-常春藤皂苷誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡機(jī)制示意圖

p53激活凋亡通路與其磷酸化[23-24]和轉(zhuǎn)錄后泛素化降解程度[25]相關(guān)。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn),α-常春藤皂苷可上調(diào)p53磷酸化蛋白表達(dá),并逆轉(zhuǎn)敲低p53/Noxa信號(hào)引起的凋亡減少,且阻礙了p53/Noxa蛋白降解,提示α-常春藤皂苷是通過(guò)上調(diào)p53/Noxa信號(hào)、穩(wěn)定p53/Noxa蛋白水平[25-27]而發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡作用。值得注意的是,由圖4A結(jié)果可見(jiàn),α-常春藤皂苷干預(yù)后,p53總蛋白無(wú)變化,但由于磷酸化水平(p-p53)升高,故p-p53/p53比值增加,提示α-常春藤皂苷干預(yù)可增加p53活性。但同樣給予30 μmol·L-1α-常春藤皂苷,圖5與圖4相比,p53蛋白總量增高,這可能由于RNA干擾實(shí)驗(yàn)中加入了空白質(zhì)粒(siRNA/NC)的干擾或?qū)嶒?yàn)條件改變所致。

此外,p53存在野生型和突變型。野生型主要功能是維持細(xì)胞基因組穩(wěn)定性,負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡,而突變型則刺激和促進(jìn)腫瘤發(fā)生。在人類(lèi)腫瘤中,p53突變型至少占50%。在肝癌中,p53外顯子7的突變概率是8.4%。超過(guò)36%的突變?cè)?49位密碼子第3堿基[28]。人肝癌細(xì)胞系常用于體內(nèi)外肝細(xì)胞癌的研究。本研究中使用的細(xì)胞系為Bel-7402[29]和HepG2[30-31],其p53基因均為野生型,因此在本研究中適用。

關(guān)于α-常春藤皂苷體外濃度問(wèn)題,文獻(xiàn)報(bào)道α-常春藤皂苷對(duì)HepG2、SMMC-7721和Huh-7肝癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)折算成摩爾濃度分別為18.5～103.35、17.72～123.84和21.89 μmol·L-1[5,31],使用CD147抗體和殼聚糖納米粒(α-Hed-CS-CD147-NPs)可提高抑制率而降低IC50值(對(duì)HepG2細(xì)胞由103.35 μmol·L-1降至42.19 μmol·L-1;對(duì)SMMC-7721細(xì)胞由123.84 μmol·L-1降至43.52 μmol·L-1)[31]。另有文獻(xiàn)報(bào)道,α-常春藤皂苷抑制HepG2和Hcclm3遷移和侵襲的濃度為5 μmol·L-1(非細(xì)胞毒性濃度),α-常春藤皂苷體內(nèi)劑量為5 mg·kg-1[10]。本研究中,筆者發(fā)現(xiàn)10～30 μmol·L-1α-常春藤皂苷可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡,體內(nèi)則為劑量10 mg·kg-1,與文獻(xiàn)結(jié)果類(lèi)似。

綜上所述,α-常春藤皂苷通過(guò)激活和穩(wěn)定p53/Noxa信號(hào)而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡,其機(jī)制值得深入探討(圖9)。