■ 劉 倩 羅國良 郭 利 李曉成 宋 莊 郭肖蘭 鐘 偉*

（1.吉林農(nóng)業(yè)科技學院，吉林吉林 132109；2.中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，吉林長春 130112；3.吉林大北農(nóng)農(nóng)牧科技有限公司，吉林長春 130102）

當前我國中藥企業(yè)發(fā)展迅速，中藥需求與日俱增，中藥渣等固體廢棄物如何安全合理且綠色處理已成為當前一大難題。研究表明，中藥渣若直接飼喂會影響動物適口性，消化利用率極低，其中所殘留的生物活性成分和豐富營養(yǎng)物質(zhì)得不到有效利用，易造成浪費[1]。利用微生物發(fā)酵技術(shù)可明顯降低中藥渣中纖維素和木質(zhì)素含量，提高蛋白質(zhì)和氨基酸等營養(yǎng)成分含量，改善適口性，從而提高中藥渣飼料化利用的效率[2-4]。

乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌是常用發(fā)酵中藥渣的益生菌菌種[5]，可達到減毒增效、節(jié)約藥源、產(chǎn)生活性物質(zhì)等作用[6]。戴燊等[7]用黑曲霉及植物乳桿菌混菌發(fā)酵中草藥后，粗蛋白、粗脂肪等明顯提高，中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、木質(zhì)素等明顯降解，其營養(yǎng)價值明顯提高。聶芙蓉等[8]用酵母菌、枯草芽孢桿菌混合發(fā)酵女貞子后使其粗蛋白和生物活性成分含量均有所提高，纖維含量降低。李秋月等[9]證實微生物發(fā)酵中草藥后其活性成分會被酶解為小分子物質(zhì)，增強其原有藥效。但目前大部分研究注重于中藥發(fā)酵后營養(yǎng)價值、活性成分的改變及發(fā)酵代謝產(chǎn)物的藥理功能，對于菌制劑發(fā)酵中藥渣后效果及優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)缺少相關(guān)研究。因此，本研究對中藥渣進行菌制劑發(fā)酵，篩選出最優(yōu)發(fā)酵菌制劑組合和添加比例，并從初始水分含量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間三方面進行菌制劑發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化分析，以期為中藥渣的二次利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

本研究樣品為中成藥經(jīng)有效成分提取后剩余的殘渣，由吉林通化修正藥業(yè)有限公司提供，主要成分為玄參、板藍根、麥冬、天冬等。

1.2 復合發(fā)酵菌制劑

發(fā)酵菌劑由植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum,Lp)、酵母菌(Bacillus subtilis, Bs)、枯草芽孢桿菌(Saccharomyces cerevisiae, Sc)作為發(fā)酵菌種，均為實驗室保藏菌種，活菌總量≥5×108CFU/mL。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 試驗一：不同種類菌制劑對中藥渣發(fā)酵后營養(yǎng)價值的影響

試驗以中藥渣為發(fā)酵底料，噴漿玉米皮、豆粕、麥麩為發(fā)酵輔料，設(shè)定初始含水量為50%，采用單因素完全隨機化設(shè)計，以單一菌、等比例兩兩復合及三者復合共設(shè)置8 個處理組（CON、Lp、Sc、Bs、Lp+Sc、Lp+Bs、Sc+Bs、Lp+Sc+Bs）。待樣品攪拌均勻后裝入帶有單向呼吸閥的密封發(fā)酵袋中，置于30 ℃培養(yǎng)箱中連續(xù)發(fā)酵3 d，每個樣品3 個重復。發(fā)酵達到72 h，取出發(fā)酵藥渣混勻后采取四分法取樣進行測定pH 及各營養(yǎng)物質(zhì)含量。

1.3.2 試驗二：不同添加比例的植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌對中藥渣發(fā)酵后營養(yǎng)價值的影響

以試驗一得到的最佳處理組為基礎(chǔ)，進行4×4 雙因素試驗，其中A 因素為植物乳桿菌，設(shè)4 個添加水平（1、2、3、5），分別為3、6、9 mL 和15 mL；B 因素為枯草芽孢桿菌，設(shè)4 個添加水平（1、2、3、5），分別為3、6、9 mL 和15 mL。共16 個處理組。待樣品攪拌均勻后裝入帶有單向呼吸閥的密封發(fā)酵袋中，置于30 ℃培養(yǎng)箱中連續(xù)發(fā)酵72 h，每個樣品3 個重復。發(fā)酵達到72 h，取出發(fā)酵藥渣混勻后采取四分法取樣進行測定pH及各營養(yǎng)物質(zhì)含量。

1.3.3 試驗三：不同發(fā)酵條件對中藥渣營養(yǎng)價值和生物活性成分含量的影響

以試驗一和試驗二得到的最優(yōu)結(jié)果為正交試驗處理組，以發(fā)酵物料的初始水分含量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時間（C）作為試驗因素，設(shè)計三因素三水平的正交試驗，各因素具體水平參數(shù)如表1。發(fā)酵步驟同上，混合均勻后在不同條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后取出，四分法取樣，測定pH、各營養(yǎng)物質(zhì)含量、生物活性成分及毒素含量。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化組合因素水平

1.4 指標檢測

1.4.1 pH測定

稱取發(fā)酵后的中藥渣10 g，置于錐形瓶中（容量為250 mL），加入90 mL純化水于錐形瓶中混勻，然后用紗布過濾后取濾液于燒杯內(nèi)，用酸度計（雷磁，型號PHS-3C，02220128號）進行pH測定。

1.4.2 常規(guī)營養(yǎng)成分含量的測定

飼料中干物質(zhì)（DM）含量參照GB/T 6435—2006，采用恒溫烘干法測定；粗蛋白（CP）含量參照GB/T 6432—1994 的方法，采用凱氏定氮法測定；粗脂肪(EE)含量參照GB/T 6433—2006 的方法，采用索氏抽提法測定；粗纖維（CF）含量參照GB/T 6434—2006 的方法，采用濾袋法測定；中性洗滌纖維（NDF）含量參照GB/T 20806—2006的方法，酸性洗滌纖維（ADF）含量參照NY/T 1459—2007 的方法，均采用濾袋法測定；粗灰分（Ash）含量參照GB/T 6438—1992 的方法，采用灼燒法測定。

1.4.3 生物活性成分及安全性指標的測定

還原糖含量和類黃酮含量測定分別采用微量法和可見分光光度法，嚴格按照試劑盒說明書測定，試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司。

生物堿含量和乳酸含量測定采用分光光度法和微量法，嚴格按照試劑盒說明書測定，試劑盒均購自江蘇科銘生物技術(shù)有限公司。

嘔吐毒素含量和黃曲霉毒素B1 含量測定均采用雙抗體一步夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），嚴格按照試劑盒說明書測定，試劑盒均購自上海優(yōu)選生物科技有限公司。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用 Excel 2010進行初步處理，之后再采用SAS 9.4 進行統(tǒng)計分析。單因素試驗采用one-way ANOVA 方差分析，雙因素試驗采用GLM 程序進行統(tǒng)計分析，用Duncan’s 法進行多重比較。正交試驗結(jié)果采用極差分析和一般線性模型進行方差分析。數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示，P＜0.05時表示差異顯著，P＞0.05時表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類菌制劑對中藥渣發(fā)酵后營養(yǎng)價值的影響

如表2 所示，各試驗組pH 顯著低于CON 組（P＜0.05）；各試驗組DM 含量顯著低于CON 組（P＜0.05）；Bs、Sc+Bs、Lp+Sc+Bs 組CP 含量顯著高于CON 組和其他試驗組（P＜0.05）；Lp、Sc、Lp+Bs、Sc+Bs、Lp+Sc+Bs組EE 含量顯著低于CON 組（P＜0.05）；Lp+Sc、Lp+Bs、Lp+Sc+Bs組NDF含量顯著低于CON 組和其他試驗組（P＜0.05）；除Lp 組和Bs 組Ash 含量顯著高于CON 組（P＜0.05），其他組間Ash含量均無顯著差異（P＞0.05）；各組間CF含量、ADF含量無顯著差異（P＞0.05）。

表2 不同菌制劑處理后中藥渣內(nèi)營養(yǎng)成分含量變化

2.2 不同添加比例的植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌對中藥渣發(fā)酵后營養(yǎng)價值的影響

如表3 所示，不同添加比例菌種處理后組間pH和DM、CP、CF、NDF、ADF、Ash 含量存在顯著差異（P＜0.05）。植物乳桿菌不同添加比例組間pH 和DM、CP 含量存在顯著差異（P＜0.05），隨菌種添加比例增加，pH 升高，DM 含量降低；植物乳桿菌不同添加比例組間EE、CF、NDF、ADF、Ash 含量無顯著差異（P＞0.05）?？莶菅挎邨U菌不同添加比例組間pH 和DM、NDF 含量存在顯著差異（P＜0.05）；枯草芽孢桿菌不同添加比例組間EE、CP、CF、ADF、Ash 含量無顯著差異（P＞0.05）。兩種菌株的不同添加比例對pH和DM、CP、CF、NDF、ADF、Ash 含量變化具有顯著交互作用（P＜0.05）。

表3 菌制劑不同添加比例對中藥渣內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)含量的影響

2.3 不同發(fā)酵條件對中藥渣營養(yǎng)價值和生物活性成分含量的影響

2.3.1 不同發(fā)酵條件下中藥渣中pH 和DM、EE、CP、Ash含量的變化

由表4 正交試驗結(jié)果極差分析表明，發(fā)酵條件對pH 影 響 因 素 的 主 次 順 序 為A＞C＞B，最 佳 組 合 為A3B1C3，即初始水分含量55%、發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵時間72 h。對各處理組pH 進行方差分析結(jié)果如表5 所示，初始水分含量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間對該指標影響均為差異顯著（P＜0.05）。

表5 中藥渣發(fā)酵后營養(yǎng)物質(zhì)方差分析

由表4 正交試驗結(jié)果極差分析表明，發(fā)酵條件對DM 含量影響因素的主次順序為A＞B＞C，最佳組合為A1B3C1，即初始水分含量45%、發(fā)酵溫度40 ℃、發(fā)酵時間24 h。對各處理組DM含量進行方差分析結(jié)果如表5所示，初始水分含量、發(fā)酵溫度對該指標影響為差異顯著（P＜0.05），發(fā)酵時間對該指標無顯著影響（P＞0.05）。

由表4 正交試驗結(jié)果極差分析表明，發(fā)酵條件對EE 含量影響因素的主次順序為B＞C＞A，最佳組合為A2B2C2，即初始水分含量50%、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間48 h。對各處理組EE 含量進行方差分析結(jié)果如表5所示，發(fā)酵溫度對該指標影響為差異顯著（P＜0.05），初始水分含量、發(fā)酵時間對該指標無顯著影響（P＞0.05）。

由表4 正交試驗結(jié)果極差分析表明，發(fā)酵條件對CP 含量影響因素的主次順序為B＞C＞A，最佳組合為A3B2C2，即初始水分含量55%、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間48 h。對各處理組CP 含量進行方差分析結(jié)果如表5所示，發(fā)酵溫度對該指標影響為差異顯著（P＜0.05），初始水分含量、發(fā)酵時間對該指標無顯著影響（P＞0.05）。

由表4 正交試驗結(jié)果極差分析表明，發(fā)酵條件對Ash 含量影響因素的主次順序為B＞C＞A，最佳組合為A1B3C3，即初始水分含量45%、發(fā)酵溫度40 ℃、發(fā)酵時間72 h。對各處理組Ash 含量進行方差分析結(jié)果如表5 所示，初始水分含量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間對該指標影響均為差異顯著（P＜0.05）。

2.3.2 不同發(fā)酵條件下藥渣內(nèi)纖維含量的變化

由表6 正交試驗結(jié)果極差分析表明，發(fā)酵條件對CF 含量影響因素的主次順序為B＞A＞C，最佳組合為A1B3C3，即初始水分含量45%、發(fā)酵溫度40 ℃、發(fā)酵時間72 h。對各處理組CF 含量進行方差分析結(jié)果如表7 所示，發(fā)酵溫度對該指標影響為差異顯著（P＜0.05），初始水分含量、發(fā)酵時間對該指標無顯著影響（P＞0.05）。

表6 中藥渣發(fā)酵后纖維含量極差分析

表7 中藥渣發(fā)酵后纖維含量方差分析

由表6 正交試驗結(jié)果極差分析表明，發(fā)酵條件對NDF 含量影響因素的主次順序為A＞C＞B，最佳組合為A3B1C3，即初始水分含量55%、發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵時間72 h。對各處理組NDF 含量進行方差分析結(jié)果如表7 所示，初始水分含量對該指標影響為差異顯著（P＜0.05）,發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間對該指標無顯著影響（P＞0.05）。

由表6 正交試驗結(jié)果極差分析表明，發(fā)酵條件對ADF 含量影響因素的主次順序為B＞A＞C，最佳組合為A1B3C3，即初始水分含量45%、發(fā)酵溫度40 ℃、發(fā)酵時間72 h。對各處理組ADF含量進行方差分析，結(jié)果如表7 所示，發(fā)酵溫度對該指標影響為差異顯著（P＜0.05），初始水分含量、發(fā)酵時間對該指標無顯著影響（P＞0.05）。

2.3.3 不同發(fā)酵條件下藥渣內(nèi)生物活性成分含量的變化

由表8 正交試驗結(jié)果極差分析表明，發(fā)酵條件對類黃酮含量影響因素的主次順序為A＞C＞B，最佳組合為A3B2C2，即初始水分含量55%、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間48 h。對各處理組類黃酮含量進行方差分析結(jié)果如表9 所示，初始水分含量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間對該指標均無顯著影響（P＞0.05）。

表8 中藥渣發(fā)酵后生物活性成分極差分析

由表8 正交試驗結(jié)果極差分析表明，發(fā)酵條件對還原糖含量影響因素的主次順序為C＞B＞A，最佳組合為A2B2C1，即初始水分含量50%、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間24 h。對各處理組還原糖含量進行方差分析結(jié)果如表9 所示，發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間對該指標影響為差異顯著（P＜0.05），初始水分含量對該指標均無顯著影響（P＞0.05）。

由表8 正交試驗結(jié)果極差分析表明，發(fā)酵條件對生物堿含量影響因素的主次順序為C＞A＞B，最佳組合為A2B1C2，即初始水分含量50%、發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵時間48 h。對各處理組生物堿含量進行方差分析結(jié)果如表9 所示，初始水分含量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間對該指標均無顯著影響（P＞0.05）。

由表9 正交試驗結(jié)果極差分析表明，發(fā)酵條件對乳酸含量影響因素的主次順序為C＞A＞B，最佳組合為A3B2C3，即初始水分含量55%、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間72 h。對各處理組乳酸含量進行方差分析結(jié)果如表9 所示，初始水分含量、發(fā)酵時間對該指標影響為差異顯著（P＜0.05），發(fā)酵溫度對該指標均無顯著影響（P＞0.05）。

2.3.4 不同發(fā)酵條件下藥渣內(nèi)毒素含量的測定

發(fā)酵后藥渣中存在對應(yīng)毒素的測定結(jié)果如表10所示，結(jié)果表明黃曲霉毒素B1 和嘔吐毒素的含量均符合我國飼料衛(wèi)生標準。

表10 中藥渣發(fā)酵后毒素含量

3 討論

3.1 不同種類的植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌處理對中藥渣發(fā)酵效果的影響

藥渣中由于自身抗營養(yǎng)因子存在，直接利用效果不佳。相關(guān)研究表明，經(jīng)微生物菌種發(fā)酵處理后，可以提升營養(yǎng)價值、改善適口性等[10]。藥渣在發(fā)酵過程中產(chǎn)生酒香味，改善藥渣氣味，利于提高適口性，可以提高發(fā)酵效率和發(fā)酵質(zhì)量。試驗中不論是單一菌還是復合菌發(fā)酵，藥渣的營養(yǎng)成分均發(fā)生了變化，在發(fā)酵過程中，菌株自身生長繁殖需要消耗一定的營養(yǎng)物質(zhì)，同時與發(fā)酵底物及輔料間相互作用產(chǎn)生了部分易降解的代謝產(chǎn)物，造成DM 含量降低。一般物料發(fā)酵后的pH 范圍為3.8～4.5，pH 越低，越利于發(fā)酵保存[11]。本試驗所測定pH 范圍符合文獻報道，并與李亞新等[12]和韋票等[13]研究結(jié)果相一致，添加菌劑組pH 顯著低于對照組，且添加Lp 菌劑的各組pH 顯著低于其他未添加組，說明植物乳酸桿菌具有促進發(fā)酵產(chǎn)生乳酸、降低pH 的作用。與對照組相比，經(jīng)Bs、Sc+Bs、Lp+Sc+Bs 處理后CP 含量顯著提升了9.95%、8.56%、10.44%，Lp+Bs 組NDF 含量顯著降低6.53%，Ash 含量顯著降低6.54%，與楊旭等[14]、王馨影[15]等、葉丙奎[16]研究結(jié)果相一致。而與空白對照組相比，Lp+Bs 組pH、CF、NDF、ADF、Ash含量分別降低15.70%、1.15%、6.53%、4.94%、6.49%，CP 含量提高3.34%；與Lp+Sc+Bs 組相比，Lp+Bs 組pH、NDF、ADF 含量分別降低1.26%、2.14%、0.48%，符合Ahmed 等[17]和白冰等[18]文獻報道。單一菌種添加模式無法同時兼顧發(fā)酵品質(zhì)與有氧暴露后腐敗抑制的要求[19-20]，混菌發(fā)酵已為研究熱點。孫宜新等[21]研究發(fā)現(xiàn)復合菌種發(fā)酵組比單一菌種發(fā)酵組的大葉枸中有益菌含量分別提高11.59%和7.89%。綜上所述，最佳菌制劑組合為Lp+Bs組。

3.2 不同添加比例的植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌處理對中藥渣發(fā)酵效果的影響

在發(fā)酵過程中復合菌種混合后進行厭氧發(fā)酵，其中枯草芽孢桿菌等好氧菌的存在為植物乳桿菌的生長繁殖創(chuàng)造了厭氧環(huán)境,而枯草芽孢桿菌降解纖維的能力有限[22]，與植物乳桿菌混合后發(fā)酵起到微生物間的協(xié)同作用，達到優(yōu)勢互補，相輔相成，發(fā)揮單一菌株起不到的作用[23]。研究表明，發(fā)酵菌劑的接種量越高，藥渣的發(fā)酵效果越好。隨著微生物增殖量增加，其所消耗底物中所需要的營養(yǎng)就越多[24]。周勇等[25]研究試驗發(fā)現(xiàn)，當嗜酸乳桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母菌、枯草芽孢桿菌、乳酸芽孢桿菌以2∶1∶2∶1 的比例混合發(fā)酵復合中藥渣后，發(fā)酵效果較優(yōu)。李若熙等[26]研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌與植物乳桿菌（1∶1）混菌發(fā)酵時，綜合發(fā)酵能力最強。秦夢等[27]發(fā)現(xiàn)中藥渣堆肥發(fā)酵效果隨菌劑接種量的增加而增強，但當菌種接種量超過0.5%時，發(fā)酵效果顯著降低。本試驗結(jié)果與上述文獻研究所得結(jié)論相似，在指定發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間下，其DM、CP、EE等營養(yǎng)物質(zhì)含量隨菌制劑添加比例的增加呈現(xiàn)先降低再增加的趨勢；CF、NDF、ADF等纖維類營養(yǎng)物質(zhì)含量呈先增加后降低或先增加后降低再增加的變化趨勢，但均在植物乳桿菌與枯草芽孢桿菌1：1 等比例混合時，DM、CP、EE 等營養(yǎng)物質(zhì)含量較高，CF、NDF、ADF等纖維類營養(yǎng)物質(zhì)含量較低。所以綜合各項指標變化，認為菌制劑的最佳添加比例為兩者等比例混合，且添加比例為1∶1。

3.3 不同發(fā)酵條件對中藥渣發(fā)酵效果的影響

3.3.1 初始水分含量

初始水分含量是影響發(fā)酵的重要因素，過高或過低均會影響菌種生長繁殖進而影響發(fā)酵品質(zhì)[28]。含水量過低時，菌種不能充分獲取營養(yǎng)物質(zhì)，生長發(fā)育緩慢；含水量過高時，藥渣易黏連結(jié)塊、腐敗變質(zhì)，影響發(fā)酵效果[29]。有研究表明，當發(fā)酵飼料水分含量在40%～60%時可使發(fā)酵飼料品質(zhì)維持穩(wěn)定[30]。安琦等[31]發(fā)現(xiàn)當黃芪藥渣內(nèi)含水量為50%～70%時，乳酸菌數(shù)量較高，發(fā)酵較為適宜。孫合美等[32]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵飼料中水分含量為30%～40%可以使發(fā)酵菌種活菌數(shù)增多，飼料pH 較為穩(wěn)定。陳鑫等[33]研究也證實以50%的初始含水量發(fā)酵紅芪藥渣效果良好。但不同藥渣藥材組成不同，其發(fā)酵適宜的含水量也可能不同，因此本試驗設(shè)定45%、50%、55%三個水平的初始含水量進行發(fā)酵中藥渣，以發(fā)酵后中藥渣的營養(yǎng)成分含量變化及生物活性成分含量評定中藥渣適宜發(fā)酵的初始水分含量，結(jié)果表明當含水量為55%時發(fā)酵效果最好。

3.3.2 發(fā)酵溫度

溫度是影響菌種生長和代謝的關(guān)鍵因素。研究表明，大多數(shù)益生菌生長適宜溫度為20～33 ℃，最高不應(yīng)超37 ℃[34]。向宇[35]證實經(jīng)曲霉和芽孢桿菌固體發(fā)酵甘草藥渣的最適宜發(fā)酵溫度為30 ℃。孫曉燕等[36]利用混合菌種發(fā)酵中藥渣認為，25～37 ℃為發(fā)酵最佳溫度區(qū)間。賀曉玉[37]用蛹蟲草菌發(fā)酵五味子藥渣，發(fā)現(xiàn)當發(fā)酵溫度為26 ℃時可以提高五味子藥渣的利用價值，并能降低試驗成本。而本試驗所用菌種生長適宜的溫度為37 ℃，此時發(fā)酵效果最好。該結(jié)論與以上研究結(jié)果不一致，可能是由于最佳發(fā)酵溫度易受發(fā)酵底物和發(fā)酵菌種的影響，且同菌種不同發(fā)酵條件下所需發(fā)酵溫度也不同[38]。

3.3.3 發(fā)酵時間

發(fā)酵時間也是發(fā)酵成功與否的重要影響因素之一[39]，發(fā)酵時間過長，發(fā)酵環(huán)境不利于菌體生長，提高發(fā)酵生產(chǎn)成本；發(fā)酵時間過短，導致抗營養(yǎng)因子脫除量降低[40]，易降低發(fā)酵產(chǎn)量，影響發(fā)酵效果。武洪志等[41]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌發(fā)酵復方中草藥的最佳發(fā)酵時間為 2.7 d；岳鹍等[42]通過中心組合設(shè)計響應(yīng)面試驗建立二次回歸模型對大黃藥渣固態(tài)發(fā)酵條件進行優(yōu)化，確定最優(yōu)發(fā)酵時間為7.5 d。本試驗與上述研究的最佳發(fā)酵時間有所不同，可能是由于與本研究選定相關(guān)發(fā)酵質(zhì)量的評價指標不同，也有可能是因為所選用藥渣不同，藥材組成也不同。孟文文等[43]確定黑曲霉發(fā)酵玉屏風口服液藥渣的最佳發(fā)酵時間72 h；劉鋒[44]利用黑曲霉H-2 發(fā)酵黃芪藥渣產(chǎn)纖維素酶的最佳發(fā)酵時間是72 h。本試驗設(shè)定發(fā)酵時間的三個水平中通過結(jié)果證實最佳發(fā)酵時間為72 h，與以上研究結(jié)果相一致，藥渣的發(fā)酵處理效果較好。

3.4 不同發(fā)酵條件對藥渣安全性的影響

黃曲霉毒素B1 和嘔吐素通常用于評價飼料的安全性。飼料生產(chǎn)安全標準要求AFB1≤20 μg/kg，DON≤1 000 μg/kg。在試驗條件下，發(fā)酵后藥渣中AFB1 和DON 的含量遠低于國家對飼料中毒素含量的檢測標準，符合國家對飼料衛(wèi)生安全要求，說明經(jīng)本試驗發(fā)酵條件處理后的藥渣無安全風險。

4 結(jié)論

綜上所述，當菌制劑處理組合為植物乳桿菌與枯草芽孢桿菌混合且添加比例為1∶1 時，中藥渣具有較好發(fā)酵效果。在此條件下中藥渣的最佳發(fā)酵工藝條件為：初始水分含量為55%，發(fā)酵溫度為37 ℃，發(fā)酵時間為72 h。