■ 方瓊亞 孔祎頔 李 民 李 科 劉曉蕊 劉?；?王桂芹

（吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術教育部國際合作聯(lián)合實驗室，吉林省動物營養(yǎng)與飼料科學重點實驗室，吉林長春 130118）

泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）屬鯉形目、鰍科、泥鰍屬，溫水性魚類，食性廣泛，易于馴化，具有較高的經(jīng)濟價值[1-2]。醫(yī)學上，泥鰍還含有多種微量元素，可參與人體代謝[3]，具有益氣補陽、溫里平肝及清熱活血等作用[4]。近年來，我國多采用高密度養(yǎng)殖模式飼養(yǎng)泥鰍，不當?shù)募夹g操作和水質(zhì)環(huán)境的惡化極容易導致泥鰍生長、免疫性能降低和應激反應，其中以出血病與細菌性爛鰓病最為常見[5-6]。隨之防腐劑和抗生素的濫用也逐漸出現(xiàn)弊端[7]。因此，解決養(yǎng)殖水產(chǎn)動物病害防治和水體藥物殘留這一難題關鍵是尋找一種安全、可靠且綠色的替代品，目前越來越多研究表明原花青素具有該潛力。左晟希[8]通過在飼料中添加葡萄籽原花青素發(fā)現(xiàn)原花青素可提高肉雞的免疫能力；Mu等[9]研究發(fā)現(xiàn)原花青素可以通過提高羔羊的能量代謝、氨基酸代謝、抗氧化代謝和抑制花生四烯酸代謝來緩解飼喂高精料飼料導致的結(jié)腸上皮炎癥反應；Wang 等[10]發(fā)現(xiàn)在飼料中添加花生衣原花青素能夠提高美洲鰻鱺幼魚（Anguilla rostrata）的增重和飼料利用率。原花青素（Oligomeric proanthocyanidins，OPC）以低聚體形式廣泛存在于各種植物中，具有促生長、抗氧化及抗炎等功效，是安全性極高的新型飼料添加劑[11]。雖然，OPC 是當下具有研究潛力的天然植物提取物添加劑之一，但其對泥鰍生長、免疫功能及抗氧化能力影響的相關研究尚未涉及。因此，本研究以泥鰍為研究對象，探究在飼料中添加不同水平的OPC對泥鰍生長、免疫功能以及抗氧化能力的影響，為泥鰍的綠色養(yǎng)殖和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中OPC的科學應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及飼料

將泥鰍暫養(yǎng)于水族箱中，馴化14 d，期間投喂基礎飼料?；A飼料中以魚粉為蛋白源，其配方和營養(yǎng)水平見表1。分別在基礎飼料中添加0、100、200、400、800 mg/kg 的OPC（純度95%）[分別記為對照（CON）、OPC100、OPC200、OPC400、OPC800 組]。飼料原料經(jīng)處理后制成直徑為1.5 mm的顆粒。

表1 試驗飼料配方及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎，%）

1.2 試驗設計及飼養(yǎng)管理

試驗于吉林農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)養(yǎng)殖實驗室進行，暫養(yǎng)結(jié)束后，選取健康且體型一致的泥鰍300 尾，初始體重為（2.13±0.01） g，隨機分配至5 個組中的15 個魚桶（每組3 個重復，每桶20 尾魚）。每天分別在09：00、16：00 飽食投喂2 次，飼養(yǎng)8 周。試驗期間保持溫度（23±2） ℃；pH（7.5±0.1）；氨氮＜0.5 mg/L；亞硝酸鹽＜0.05 mg/L和溶解氧＞7.0 mg/L。

1.3 樣品收集

飼養(yǎng)結(jié)束后，禁食24 h，對每桶魚計數(shù)并稱重；隨機取10 尾泥鰍，采用MS-222 麻醉泥鰍后從泥鰍尾部靜脈采血，4 ℃靜置12 h，4 000 r/min離心15 min收集血清，-20 ℃保存待測。取泥鰍的肝臟和腸道組織于液氮中快速冷凍，-80 ℃保存待測。

1.4 生長指標測定

使用以下公式計算平均增重率、特定生長率、飼料系數(shù)、蛋白質(zhì)效率、成活率、肥滿度、臟體比及肝體比。

增重率（%）=100×（Wt-W0）/W0

特定生長率（%/d）=100×（lnWt-lnW0）/t

飼料系數(shù)=I/（Wt-W0）

蛋白質(zhì)效率=（Wt-W0）/（I×C）

成活率（%）=100×（試驗末存活魚總數(shù)/試驗初存活魚總數(shù)）

肥滿度（g/cm3）=100×Wt/L3

臟體比（%）=100×Wv/Wt

肝體比（%）=100×Wh/Wt

式中：I——攝入飼料的重量（g）；

t——試驗時間（d）；

W0、Wt——分別為試驗初始和結(jié)束時泥鰍的體重（g）；

C——飼料蛋白質(zhì)的含量（%）；

L——體長（cm）；

Wv、Wh——分別為試驗泥鰍內(nèi)臟團、肝臟的重量（g）。

1.5 免疫及抗氧化相關酶測定

采用上海酶聯(lián)生物科技有限公司試劑盒對血清中補體3（C3）、補體4（C4）、免疫球蛋白M（IgM）和溶菌酶（LYS）含量進行測定。采用南京建成生物技術研究所有限公司試劑盒測定肝臟和腸道中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、谷胱甘肽（GSH）活性、丙二醛（MDA）含量及血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）活性。測定方法均參考上海酶聯(lián)試劑盒和南京建成生物工程研究所有限公司試劑盒說明書[12-13]。

1.6 統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，用Duncan’s 法多重比較進行組間差異分析，數(shù)據(jù)用“平均值±標準誤”表示，P＜0.05表示顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 OPC對泥鰍生長和飼料利用的影響

由表2可知，經(jīng)過8周的飼養(yǎng)試驗后，OPC 對泥鰍的生長和飼料利用有不同程度影響，OPC200、400、800 組的泥鰍的終末體質(zhì)量、增重率及特定生長率較對照組均顯著升高（P＜0.05），但OPC800 組相較于OPC400 組有所下降，當OPC 添加量為400 mg/kg 時，此三項指標達到最高。所有OPC 添加組的飼料系數(shù)均顯著低于對照組（P＜0.05），且在OPC200 組達到最低值，在OPC400、800組呈上升趨勢。與對照組相比，蛋白質(zhì)效率隨著OPC 添加量的提高呈現(xiàn)上升后降低的趨勢，其中OPC200、400 組顯著高于對照組（P＜0.05），且OPC200 組達到最大值，OPC200 組蛋白質(zhì)效率高于OPC800 組和OPC100 組。各組成活率與對照組相比均無顯著差異（P＞0.05）。

表2 OPC對泥鰍生長和飼料利用的影響

由表3 可知，與對照組相比，所有OPC 添加組的肥滿度和肝體比指標均有所下降，且OPC200 組的肝體比顯著下降（P＜0.05），OPC400 組泥鰍的肥滿度和肝體比均顯著下降（P＜0.05），而OPC100 組和OPC800組的形體指標均無顯著差異（P＞0.05）。

表3 OPC對泥鰍形體指標的影響

2.2 OPC對泥鰍血清生化指標的影響

由圖1A 可知，OPC400 和OPC800 組泥鰍血清中的AST 含 量 均 顯 著 低 于 對 照 組（P＜0.05），其 中OPC400 組 的AST 含 量 達 到 最 低 值，OPC100 組 和OPC200 組的AST 含量呈下降趨勢。由圖1B 可知，OPC200、400、800組泥鰍血清中的ALT 含量顯著低于對照組（P＜0.05），且OPC400組出現(xiàn)最低值。

圖1 OPC對泥鰍血清指標的影響

2.3 OPC對泥鰍免疫指標的影響

由圖2A 可知，所有OPC 添加組的泥鰍血清中的C3 含量均顯著高于對照組（P＜0.05），且OPC200 組C3水平顯著高于OPC100 組（P＜0.05）。由圖2B、2D 可知，OPC200、400、800 組的泥鰍血清中C4 和LYS 含量均顯著高于對照組（P＜0.05），且隨著OPC 添加量的增加泥鰍血清中C4 水平呈先上升后下降的趨勢，其中400組達到最大值。由圖2C可知，所有OPC添加組的IgM含量變化與對照組相比均不顯著（P＞0.05）。

圖2 OPC對泥鰍血清免疫指標的影響

2.4 OPC對泥鰍抗氧化能力的影響

由圖3A、3B、3D 可知，在肝臟中，OPC400、800 組的CAT 及GST 活性顯著高于對照組（P＜0.05），當OPC添加量為400 mg/kg時，GSH-Px在肝臟中的水平顯著高于對照組（P＜0.05）；且OPC400 組的該三項指標均達到峰值；而在腸道中，OPC200、400和800組的CAT、GSH-Px 和GST 活性與對照組相比顯著提高（P＜0.05），其中，OPC200 組的GSH-Px、SOD 和GST 達到最高值，OPC400 組的CAT 活性達到最高水平。由圖3C 可知，與對照組相比，除OPC100 組肝臟和腸道中的SOD 活性差異不顯著（P＞0.05），其余組均顯著高于對照組（P＜0.05），且各組間差異均不顯著（P＞0.05）。由圖3E 可知，在肝臟中，除OPC100 組的GSH 活性與對照組相比無顯著差異（P＞0.05），其余OPC 添加組均顯著高于對照組（P＜0.05），但在腸道中所有OPC 添加組GSH 活性均顯著高于對照組（P＜0.05），且OPC200組的肝臟和腸道GSH 活性達到最高。由圖3F 可知，在肝臟和腸道中，各OPC 添加組的MDA 含量均顯著低于對照組（P＜0.05），其中OPC400 組的肝臟和腸道中的MDA含量最低。

圖3 OPC對泥鰍肝臟和腸道抗氧化指標的影響

3 討論

3.1 OPC對泥鰍生長、飼料利用的影響

添加適量OPC在飼料中，能顯著增強水生動物的生長性能、飼料利用率和蛋白質(zhì)的合成。相關研究顯示，適量的OPC 能夠顯著改善南美洲鰻鱺（Anguilla rostrata）、鯽（Carassius auratus）和雜交鱘（Acipenser baeri Brandt ♀×A.schrenckii Brandt♂）生長性能[14-16]。本研究中，與對照組相比，OPC200、400、800 組泥鰍的終末體質(zhì)量、增重率及特定生長率顯著提升。與本研究結(jié)果相似的，如：飼喂添加量200～600 mg/kg葡萄籽原花青素的飼料可以顯著提高鯽（Carassius auratus）的增重率和特定生長率[13]；Wang 等[10]研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加600～1 200 mg/kg 的花生皮原花青素能有效提高美洲幼鰻（Anguilla rostrata）終末體質(zhì)量、增重率及飼料效率；Xu等[14]發(fā)現(xiàn)飼料中添加50、100 mg/kg的葡萄籽原花青素能夠顯著改善雜交鱘（Acipenser baeri Brandt ♀×A.schrenckii Brandt♂）增重率、特定生長率和飼料效率。結(jié)合以往研究可知，添加適量的原花青素能夠促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收，從而顯著改善泥鰍的生長性能。綜上所述，適量的OPC對水生動物的生長性能有顯著影響，但由于魚的種類、腸道微生物群系和OPC的來源不同所需的適宜OPC量不同。

肥滿度、肝體比及臟體比的高低反映了魚類的生長狀況和營養(yǎng)方式[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，OPC200 組泥鰍的肝體比顯著下降，OPC400 組能顯著降低泥鰍的肥滿度和肝體比。有研究表明，葡萄原花青素可通過降低肝臟FXR 轉(zhuǎn)錄因子活性來抑制小鼠脂肪積累[18]。由此可見，本研究中肥滿度和肝體比降低的原因與OPC緩解魚類肥胖表型的作用有一定關聯(lián)。

3.2 OPC對泥鰍肝臟健康的影響

AST 和ALT 作為肝功能指標，正常情況下只存在于肝臟中，當組織出現(xiàn)病變時，組織液中的AST 和ALT 增高[19]。本試驗中，OPC400、800 組AST 含量顯著低于對照組，OPC200、400、800 組ALT 含量顯著低于對照組和OPC100組。張波等[20]研究發(fā)現(xiàn)，乙醇灌胃的小鼠6 h 后分別飼喂100、300 mg/kg 的OPC 前后對照發(fā)現(xiàn)血清中ALT 水平顯著降低；韓建鑫等[21]研究發(fā)現(xiàn)，100 mg/kg OPC 有效降低了玉米赤霉烯酮致肝臟損傷的小鼠體內(nèi)的ALT 和AST含量。因此，在飼料中添加適量OPC能有效緩解肝臟的損傷程度。

3.3 OPC對泥鰍免疫指標的影響

OPC 作為一種國際上公認的抗炎天然添加物，能顯著增強NK 細胞活性、刺激B 細胞和T 細胞的反應[22]，具有抗腸道細菌感染功能[23]，在增強動物免疫機能方面具備廣闊的發(fā)展前景。C3、C4、IgM 與LYS是體液免疫的組成部分，是炎癥反應的重要診斷依據(jù)[24]。本研究中，與對照組相比，所有OPC 添加組的C3 均顯著提高。OPC200、400、800 組的C4 和LYS 均顯著高于對照組。相關研究表明，沙棘籽原花青素可顯著增強小鼠的中性粒細胞和巨噬細胞的吞噬活性從而增強小鼠的免疫能力[25]。研究發(fā)現(xiàn)，OPC 能通過破壞細菌細胞壁、細胞膜以及菌體結(jié)構成分達到抑菌作用[26]。因此，OPC 能夠增強泥鰍免疫功能的原因與其能提高免疫細胞的殺傷能力和對細菌結(jié)構的破壞有關，具體作用機制需進一步研究。

3.4 OPC對泥鰍抗氧化能力的影響

CAT、GSH-Px、SOD、GST和GSH是天然的抗氧化防御機制，MDA 水平高低是細胞受損程度的重要參數(shù)[27-28]。本研究中，OPC 添加量為400 mg/kg 時，泥鰍肝臟中GSH-Px 活性顯著提升，OPC 添加量為400、800 mg/kg 時，泥鰍肝臟的CAT 和GST 活性顯著提升，當OPC 添加量為200、400 mg/kg 和800 mg/kg 時，與對照組相比，泥鰍肝臟中的SOD 和GSH 活性顯著提高，且腸道中的CAT、GSH-Px、SOD、GST 的活性顯著提升，OPC 添加濃度為100、200、400、800 mg/kg 時，泥鰍腸道中GSH活性顯著高于對照組，而腸道和肝臟中的MDA 活性相較于對照組顯著降低。Kim 等[29]研究發(fā)現(xiàn)萘普生藥物可誘導機體產(chǎn)生ROS，從而導致胃損傷，而飼喂80 mg/kg 黑米糠花青素能有效緩解經(jīng)萘普生處理后的大鼠胃組織中CAT、SOD 和GSH-Px 水平的下降。有研究表明，飼料中添加50 mg/L 的原花青素飼喂經(jīng)砷處理的小鼠，其GSH、T-AOC 和SOD 顯著升高，MDA 水平顯著下降[30]。盧文麒等[12]研究發(fā)現(xiàn)，添加300、600 mg/kg OPC能有效降低組胺脅迫下美洲鰻鱺（Anguilla rostrata）MDA 水平，同時，600 mg/kg OPC 能顯著提高其GSH 活性。綜上，適宜添加量的OPC 能有效降低自由基的產(chǎn)生從而改善機體受到的損傷，增強魚類的抗氧化能力。

近年來，人們越來越緊密關注植物提取物用作新型飼料添加劑，而OPC研究的興起為高度集約化養(yǎng)殖造成魚類應激反應等問題提供了新的解決思路，其多樣性的功能備受人們青睞。本研究結(jié)果能為泥鰍的品質(zhì)健康和OPC 在水產(chǎn)動物的利用提供參考依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

4 結(jié)論

綜上，分析研究飼料中添加OPC 對泥鰍生長、免疫和抗氧化功能的影響表明，飼料中添加適宜濃度的OPC 一定程度上可促進泥鰍的攝食和生長、增強其免疫功能及改善泥鰍的抗氧化能力。研究結(jié)果建議，為提高泥鰍的生長性能、免疫力和抗氧化能力可在飼料中添加200～400 mg/kg OPC。