徐 楊 ，何芷綺，劉曉鳳，蘇 杰，馬錦雯，向宇陽，劉 濤

1. 成都大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610100

2. 成都大學(xué)張瀾學(xué)院，四川 成都 610100

3. 四川天一學(xué)院，四川 德陽 618000

4. 成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610100

中醫(yī)學(xué)是中國古代在“陰陽五行”理論指導(dǎo)下對(duì)人體生理病理進(jìn)行研究的學(xué)科，強(qiáng)調(diào)整體觀和辨證論治，在臨床應(yīng)用中多以復(fù)方給藥[1-2]，然而，中藥成分復(fù)雜，各成分間相互作用，具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)。在“整體調(diào)控”的認(rèn)知模式下，中藥復(fù)方制劑的作用機(jī)制大多尚不明確。代謝組學(xué)技術(shù)最早由Nicholson 教授[3]提出，是對(duì)不同生物體、樣本或組織的所有代謝物進(jìn)行定性和定量分析，并尋找代謝物與生理、病理、表型變化相對(duì)關(guān)系的研究方式，研究藥物進(jìn)入機(jī)體后對(duì)體內(nèi)內(nèi)源性代謝物的影響，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分。代謝組學(xué)的主要目的是測(cè)量生物系統(tǒng)對(duì)生物刺激或基因操縱的全局動(dòng)態(tài)代謝變化。區(qū)別于傳統(tǒng)研究中“自下而上”的方法，其通過對(duì)復(fù)雜生物體中內(nèi)源性小分子代謝物進(jìn)行定性分析和定量監(jiān)測(cè)，篩選具有明顯濃度變化的代謝產(chǎn)物作為機(jī)體接受生理刺激后相關(guān)代謝變化的生物標(biāo)志物，進(jìn)而研究其在生物系統(tǒng)內(nèi)的作用途徑。代謝產(chǎn)物的濃度通常伴隨著相應(yīng)疾病的傳變而變化，因此，代謝組學(xué)動(dòng)態(tài)分析生物體代謝情況變化的整體性、系統(tǒng)性特點(diǎn)與中醫(yī)“整體觀”的基本特點(diǎn)相吻合，與中醫(yī)藥多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)相契合[4]，近年來在中藥研究中應(yīng)用廣泛。將代謝組學(xué)運(yùn)用在中醫(yī)藥研究的過程中，建立“藥物-代謝物-代謝途徑”網(wǎng)絡(luò)，能夠更好地闡述中藥“辨證論治”過程的作用機(jī)制。本文通過對(duì)近年來代謝組學(xué)的研究思路、在中藥復(fù)方制劑研究中的應(yīng)用和目前面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行綜述，為進(jìn)一步完善代謝組學(xué)研究方法并闡明中藥復(fù)方制劑作用機(jī)制提供參考。

1 代謝組學(xué)簡(jiǎn)介

代謝組學(xué)關(guān)注的對(duì)象通常是相對(duì)分子質(zhì)量1 000以下的小分子化合物，包括脂質(zhì)、核酸、氨基酸、肽、有機(jī)酸和碳水化合物等[5]，其研究的經(jīng)典樣本為血樣、尿液及特定的細(xì)胞或組織提取液等，近年來也出現(xiàn)了一些基于疾病特異性的新樣本研究方法，如腸道代謝組學(xué)、單細(xì)胞代謝組學(xué)、外周血單個(gè)核細(xì)胞代謝組學(xué)、細(xì)胞器代謝組學(xué)（溶酶體、線粒體）、微生物代謝組學(xué)[6]等，這些新樣本研究方法更貼切疾病本身的層面，更能夠準(zhǔn)確反應(yīng)出機(jī)體用藥后的代謝波動(dòng)情況，為精確的代謝組學(xué)研究提供思路，楊瀾等[7]以大鼠糞便為樣本，研究脈絡(luò)舒通丸對(duì)股骨折后后肢腫脹大鼠糞便代謝物的調(diào)節(jié)作用，并將其腸道代謝組學(xué)與腸道菌群聯(lián)合分析，結(jié)果顯示糞便代謝中顯著差異代謝物石膽酸、脫氧膽酸、膽酸與Papilibacter、Intestinimonas、Turicibacte、葡萄球菌呈顯著正相關(guān)，表明腸道代謝物與腸道菌群密切相關(guān)，進(jìn)一步說明代謝研究中樣本選擇的重要性。

代謝組學(xué)根據(jù)研究的目標(biāo)和方法，可分為非靶向和靶向代謝組學(xué)。結(jié)合中藥、中藥復(fù)方制劑成分繁多、作用機(jī)制復(fù)雜的特點(diǎn)，代謝組學(xué)圍繞中醫(yī)藥核心，聯(lián)合多技術(shù)、新手段發(fā)展出很多分支，如脂質(zhì)代謝組學(xué)、空間代謝組學(xué)、序貫代謝組學(xué)[8]、功能代謝組學(xué)等。

1.1 非靶向代謝組學(xué)

非靶向代謝組學(xué)是指全面檢測(cè)和分析生物樣本中的所有代謝物，可以全面了解機(jī)體受藥物干預(yù)后代謝物的變化，而不局限于已有的研究結(jié)論。非靶向代謝組學(xué)研究利用高通量的分析方法，如核磁共振和質(zhì)譜等，全面分析樣本代謝譜以發(fā)現(xiàn)未知代謝物和代謝通路，同時(shí)也面臨著大量的復(fù)雜數(shù)據(jù)需要處理和解釋的問題。在其“全局性”的指導(dǎo)下，非靶向代謝組學(xué)發(fā)展出了脂質(zhì)代謝組學(xué)、揮發(fā)物代謝組學(xué)、空間代謝組學(xué)等新技術(shù)[6]，這些新技術(shù)在不同方向上彌補(bǔ)了典型非靶向代謝組學(xué)的缺點(diǎn)。如典型代謝組學(xué)中關(guān)于代謝物空間分布的全部信息丟失問題可以通過空間代謝組學(xué)解決，空間代謝組學(xué)還可更好地反映結(jié)構(gòu)多樣的小分子物質(zhì)，展示差異代謝物在機(jī)體內(nèi)的代謝分布，幫助研究者深入了解中藥復(fù)雜成分和作用機(jī)制。作為一種新型的分子影像技術(shù)，空間代謝組學(xué)能夠直接從生物組織中獲得大量已知或未知的內(nèi)源性代謝物和外源性藥物等分子的結(jié)構(gòu)、含量和空間分布信息[9]，采取的研究技術(shù)為空氣動(dòng)力輔助離子化解吸電噴霧電離質(zhì)譜成像，基于此技術(shù)，空間代謝組學(xué)具有免標(biāo)記、無需基質(zhì)、周期短的優(yōu)勢(shì)[10]，F(xiàn)ox 等[9]發(fā)現(xiàn)寬帶相干反斯托克斯拉曼散射（broadband coherent anti-stokes Raman scattering，BCARS）光譜成像技術(shù)可提供靈敏度和空間分辨率，以至在亞細(xì)胞水平上區(qū)分不同的密切相關(guān)的化學(xué)物質(zhì)，BCARS 與解吸電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用可以更好地表征代謝物空間和時(shí)間模式，且BCARS 可以持續(xù)研究活體、完整的標(biāo)本，以提供直接觀察代謝過程的動(dòng)力學(xué)解釋。

1.2 靶向代謝組學(xué)

靶向代謝組學(xué)是對(duì)選定的特定代謝物或代謝通路進(jìn)行檢測(cè)和分析，以對(duì)其進(jìn)行深入分析，深度闡釋藥物在特定代謝途徑的作用機(jī)制。靶向代謝組學(xué)通過專門的代謝物提取技術(shù)和檢測(cè)手段用于開展研究，用于分離研究者感興趣的代謝物，從而減少其他高豐度代謝物的干擾[11]，故靶向代謝組學(xué)較非靶向代謝組學(xué)更能準(zhǔn)確地對(duì)代謝物進(jìn)行定量分析，并為其生物學(xué)解釋提供更好定義和補(bǔ)充的數(shù)據(jù)集。靶向代謝組學(xué)發(fā)展出了功能代謝組學(xué)、糖代謝、脂質(zhì)代謝、酶代謝和基于特定小分子代謝物或代謝途徑研究等的各類靶向代謝組學(xué)（特定脂質(zhì)、特定核苷酸代謝）等。其中，功能代謝組學(xué)可通過精確捕捉疾病反應(yīng)代謝物生物標(biāo)志物和功能性化合物（次級(jí)代謝物）間的分子相互作用，揭示中藥衍生物阻斷疾病相關(guān)決定性分子的生物合成，調(diào)節(jié)病原致病時(shí)的生化相互作用過程，實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的發(fā)現(xiàn)和治療，從而表征中醫(yī)“系統(tǒng)治療”的特點(diǎn)[12]。

非靶向和靶向代謝組學(xué)在中藥研究中都具有重要作用，非靶向代謝組學(xué)可應(yīng)用在中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)、藥效研究、藥物相互作用和中藥毒性研究等方面，靶向代謝組學(xué)則基于其“靶向性”被用于中藥活性成分、代謝途徑、代謝酶及中藥藥效重要標(biāo)志物等方面。需要指出的是，靶向和非靶向代謝組學(xué)并非嚴(yán)格對(duì)立，實(shí)際研究中往往結(jié)合二者的方法和策略，以全面了解代謝物的變化和對(duì)機(jī)體的影響。一些代謝組學(xué)研究技術(shù)依據(jù)研究焦點(diǎn)和目的，既可劃分為非靶向代謝組學(xué)，也可以被視為靶向代謝組學(xué)，如序貫代謝[8]、腸道代謝等。在腸道非靶向代謝組學(xué)中，通過全面分析腸道微生物與宿主的相互作用，揭示腸道代謝的變化與其宿主健康的聯(lián)系[7]。而在腸道靶向代謝組學(xué)中，研究者可能選擇少數(shù)特定的代謝物或代謝通路，如短鏈脂肪酸、膽汁酸、氨基酸等，研究腸道代謝的特定方面；出于不同研究目的，即使對(duì)同類物質(zhì)進(jìn)行研究（如脂質(zhì)），當(dāng)研究者關(guān)注機(jī)體內(nèi)全部脂質(zhì)的代謝水平變化時(shí)，通常采用非靶向代謝組學(xué)工具，如果關(guān)注的是特定的某一脂質(zhì)小分子或途徑，則以靶向代謝組學(xué)方法展開研究。

2 代謝組學(xué)在中藥研究中的研究流程和方法

在中藥研究中，代謝組學(xué)研究可以分為中藥樣品前處理、濕法實(shí)驗(yàn)和干法實(shí)驗(yàn)3 個(gè)階段共5 個(gè)流程。中藥樣品前處理是指對(duì)中藥樣品進(jìn)行一系列處理步驟，以提取和制備樣品中的代謝產(chǎn)物，去除可能干擾分析的雜質(zhì)以便進(jìn)行后續(xù)的分析和研究；濕法實(shí)驗(yàn)階段包括代謝樣本采集和樣品分析2 個(gè)流程；干法實(shí)驗(yàn)階段包括代謝物數(shù)據(jù)分析和生物內(nèi)涵解釋2 個(gè)流程，見圖1。

圖1 中藥復(fù)方制劑研究的代謝組學(xué)基本研究流程Fig. 1 Basic metabolomics research flow of traditional Chinese medicine compound preparation

2.1 中藥樣品前處理

中藥鮮品藥材一般需液氮冷凍后研磨成粉后進(jìn)行冷凍干燥，再選擇甲醇或乙腈等有機(jī)溶劑進(jìn)行提?。恢兴庯嬈瑒t根據(jù)其所含化合物的類別，采用對(duì)應(yīng)的溶劑進(jìn)行飲片中有效成分的提取[4]；中藥復(fù)方制劑則應(yīng)結(jié)合中藥復(fù)方制劑的理化性質(zhì)選擇合適的溶媒，并采用合適的配制方法，建立供試品的配制規(guī)程，并記錄實(shí)驗(yàn)中完整的配制過程及關(guān)鍵參數(shù)。中藥復(fù)方給藥制劑一般多采用現(xiàn)用現(xiàn)配的方式。

2.2 樣品采集

在代謝組學(xué)研究中，研究目的不同，動(dòng)物代謝測(cè)定樣本有異，可為血液、尿液、糞便等，采集過程中應(yīng)避免樣本受到污染，采集后應(yīng)及時(shí)處理，避免樣本理化性質(zhì)發(fā)生明顯變化，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論。此外，同類疾病的造模方式不同也會(huì)影響對(duì)同藥物治療后機(jī)體代謝水平變化，徐霞[13]對(duì)脾虛濕困型潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）大鼠進(jìn)行代謝組學(xué)研究時(shí)，將大鼠造模分為脾虛濕困型UC 和單純UC，研究結(jié)果顯示，參苓白術(shù)散治療過程中，2 組不同造模方式大鼠共存在3 個(gè)潛在生物標(biāo)志物，亦分別存在顯著變化的潛在生物標(biāo)志物11、9 個(gè)，說明對(duì)于同類疾病，造模方法不同，其給藥后的代謝變化可能會(huì)出現(xiàn)同中有異的情況。此外，對(duì)于相同疾病，采集分析的樣品種類不同，代謝組學(xué)的研究結(jié)果也會(huì)有所差異，Liu 等[14]在對(duì)抑郁癥小鼠進(jìn)行代謝組學(xué)研究時(shí)，制備和分析的樣品為腎組織提取液，代謝組學(xué)結(jié)果表明精氨酸代謝途徑是抑郁癥小鼠受干擾最明顯的代謝途徑，而Chen 等[15]在研究抑郁癥小鼠代謝紊亂時(shí)，使用分析的樣品則是慢性輕度應(yīng)激（chronic mild stress，CMS）小鼠嗅球，其代謝組學(xué)結(jié)果表明色氨酸異常代謝是CMS 抑郁模型嗅球的核心發(fā)病機(jī)制。此類因分析樣品不同而代謝組學(xué)結(jié)果不同的研究對(duì)比不在少數(shù)，提示后續(xù)研究者在代謝組學(xué)研究過程中，對(duì)代謝樣品選取中需要多加考察和辨證擇取，更要考慮特定疾病的病灶和藥物作用靶點(diǎn)等。

2.3 樣品分析

該流程主要包括樣品前處理、代謝物色譜分析和代謝物質(zhì)譜分析。目前，代謝組學(xué)對(duì)生物樣本常用的處理方法為溶劑沉淀、液液萃取、固相萃取和超臨界萃取等[16]。液相色譜和氣相色譜是代謝物色譜分析過程中運(yùn)用最廣泛的工具，二者能夠有效地實(shí)現(xiàn)代謝物分離。在這2 種技術(shù)基礎(chǔ)上，根據(jù)不同的研究需求已發(fā)展出了更具針對(duì)性的研究方法，如高效液相色譜法、毛細(xì)管高效液相色譜法、超高效液相色譜法等[17]。檢測(cè)方面，質(zhì)譜和核磁共振是其中的主流檢測(cè)手段。質(zhì)譜常常與液相或氣相色譜聯(lián)用而作為一種定量測(cè)定代謝物濃度的工具；而核磁共振則作為另一種獨(dú)立的檢測(cè)方法，具有不損壞分析物，可有效觀察代謝物動(dòng)力學(xué)和螯合作用的特點(diǎn)，二者各有優(yōu)劣[18]。

2.4 數(shù)據(jù)分析

此步驟將樣本上機(jī)分析處理后，將質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行降噪、峰提取、歸一化、中心化等處理后得到代謝組學(xué)數(shù)據(jù)集，通過多元統(tǒng)計(jì)方法處理數(shù)據(jù)集，其統(tǒng)計(jì)方法包括無監(jiān)督方法和監(jiān)督方法。無監(jiān)督方法包括主成分分析（principal component analysis，PCA）和層次聚類分析，在不使用任何類別成員的情況下，根據(jù)所使用的算法研究全局變化。這種類型的方法是挑選數(shù)據(jù)集中主要變異的理想模式。在監(jiān)督形式的模式識(shí)別中，如許多形式的判別分析，類別成員關(guān)系會(huì)被用來驅(qū)動(dòng)聚類[19]。完成多變量分析后通過將關(guān)鍵變量投影重要性指標(biāo)（variable importance in projection，VIP）、樣本間代謝物濃度的差異倍數(shù)、某代謝物在比較分組間的表達(dá)差異顯著與否等作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出差異代謝物，常用的代謝物鑒定平臺(tái)為人類代謝組數(shù)據(jù)庫、MetLin 數(shù)據(jù)庫、生物磁共振庫等[6]。

2.5 生物內(nèi)涵解釋

生物內(nèi)涵解釋即生物功能挖掘，尋找藥物進(jìn)入機(jī)體后，機(jī)體內(nèi)受顯著影響的代謝途徑，以此連接藥物作用和生物體的代謝變化，常用的生物功能挖掘平臺(tái)為京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）、MetaboAnalyst 等。

為了滿足定向研究的需求，更多新興的代謝組學(xué)方法出現(xiàn)，如空間代謝組學(xué)研究，該方法對(duì)樣品的處理要求較典型代謝組學(xué)更高，在完成組織樣品處理后，還需要進(jìn)行切片處理和質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，有利于研究者獲取樣品內(nèi)不同位置的代謝物信息，以進(jìn)一步了解生物體內(nèi)代謝的空間分布特征。樣本獲取和切片制備是空間代謝組學(xué)研究質(zhì)譜成像結(jié)果準(zhǔn)確性和真實(shí)性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)于中藥材樣本處理，也發(fā)展出了相應(yīng)的包埋處理冷凍切片分析和轉(zhuǎn)印法間接分析等適應(yīng)中藥材研究的技術(shù)[20]。

3 代謝組學(xué)在中藥復(fù)方制劑中的應(yīng)用

傳統(tǒng)的藥動(dòng)學(xué)定量研究藥物在生物體內(nèi)的過程（吸收、分布、代謝和排泄），往往專注于評(píng)估藥物的全身暴露和相關(guān)處置[21]，由于中藥所含化學(xué)成分復(fù)雜，體內(nèi)代謝過程尚不完全清楚，加之中藥復(fù)方制劑由多味藥物組成，各藥材在體內(nèi)的協(xié)同或拮抗關(guān)系尚不明晰，因此，采用傳統(tǒng)的藥動(dòng)學(xué)無法闡釋中藥復(fù)方制劑在體內(nèi)的過程。而代謝組學(xué)立足機(jī)體代謝變化，通過研究機(jī)體給藥后的差異代謝物，揭示中藥復(fù)方制劑的作用途徑，為中藥復(fù)方配伍科學(xué)性提供了實(shí)驗(yàn)證明。

3.1 對(duì)生物體內(nèi)生物代謝途徑的影響

中藥復(fù)方制劑進(jìn)入生物體內(nèi)，其藥效物質(zhì)將影響生物各類物質(zhì)的代謝水平，代謝組學(xué)通過研究和比較這些代謝物的變化情況，篩選出具有指導(dǎo)意義的顯著變化代謝物（差異代謝物），是揭示中藥復(fù)方制劑作用機(jī)制的前提，為研究中藥復(fù)方制劑的關(guān)鍵藥效成分提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為研究中藥質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）[4]的篩選提供參考。

代謝組學(xué)通過分析獲得的差異代謝物富集相關(guān)代謝途徑，為揭示中藥復(fù)方制劑作用機(jī)制提供了新方法。Cui 等[22]使用代謝組學(xué)方法研究芪桂銀方對(duì)感染碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌小鼠的代謝變化，以小鼠血液作為樣本研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)芪桂銀方可以顯著逆轉(zhuǎn)小鼠體內(nèi)由于感染碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌而發(fā)生異常表達(dá)的代謝物，主要包括乳酸D1、10S-EpOME、苯丙氨酸等，揭示了芪桂銀方可通過苯丙氨酸代謝、維生素K1 表達(dá)、DL-乳酸表達(dá)等代謝途徑逆轉(zhuǎn)小鼠異常代謝、調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂的作用。Li 等[23]采用非靶向代謝組學(xué)研究對(duì)比柴胡桂枝干姜湯與匹維溴銨治療腸易激綜合征的療效，證明柴胡桂枝干姜湯對(duì)血漿代謝的影響大于匹維溴銨，其治療結(jié)果顯示患者血漿中L-肉堿和?；鈮A水平升高，患者體內(nèi)肉堿介導(dǎo)的脂質(zhì)代謝顯著增強(qiáng)，研究還預(yù)測(cè)柴胡桂枝干姜湯作用于腸易激綜合征時(shí)最有效活性成分可能是黃芩苷，為柴胡桂枝干姜湯后續(xù)活性物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究提供了方向。Chen 等[24]通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)大鼠血清的全局代謝組學(xué)圖譜，分析得到了特定的血清代謝產(chǎn)物和相應(yīng)的代謝途徑，闡述了人參附子對(duì)中79 種化合物通過提高細(xì)胞色素P450 家族2 亞家族D 成員6、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶2 的表達(dá)和降低環(huán)氧化物水解酶2、單胺氧化酶B 靶蛋白的表達(dá)，直接調(diào)節(jié)下游特異性血清代謝產(chǎn)物，在心力衰竭的治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

經(jīng)典名方是我國中醫(yī)藥精華，具有歷史悠久、療效佳等特點(diǎn)，桃紅四物湯是傳統(tǒng)中醫(yī)經(jīng)典名方之一，已被收錄在中華人民共和國國家醫(yī)藥產(chǎn)品管理局和國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《古方目錄（第一批）》中。Tao 等[25]通過非靶向超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)冠心病患者的血清代謝譜進(jìn)行分析，研究證實(shí)桃紅四物湯可通過上調(diào)脂肪酸代謝，下調(diào)葡萄糖代謝、花生四烯酸代謝和甘油磷脂代謝及調(diào)節(jié)氨基酸代謝實(shí)現(xiàn)其活血化瘀、調(diào)脂等藥效。He 等[26]基于超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，以血虛血瘀證大鼠為研究模型，在其血漿代謝產(chǎn)物中尋找和篩選桃紅四物湯治療血虛血瘀證的潛在作用代謝途徑，共篩選出23 種潛在的差異代謝物，證明桃紅四物湯主要通過干預(yù)氨基酸代謝、?；撬岷偷团；撬岽x等8條代謝途徑改善血虛血瘀證。二陳湯出自《太平惠民和劑局方》，是治療“痰濕證”的基礎(chǔ)方，被譽(yù)為“天下理氣第一方”。Chen 等[27]采用液質(zhì)聯(lián)用代謝組學(xué)技術(shù)研究二陳湯對(duì)血脂異常痰濕內(nèi)阻征小鼠的影響，由代謝譜分析獲得64 種差異代謝物，富集后獲得34 種差異代謝途徑，其中三羧酸循環(huán)和色氨酸、絲氨酸、血清谷氨酰胺、嘧啶及丙酮酸的代謝途徑是二陳湯在血脂異常痰濕內(nèi)阻征治療過程中降低小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的最相關(guān)代謝途徑。Gu 等[28]通過超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用與血漿非靶向代謝組學(xué)分析相結(jié)合，闡明了高尿酸癥導(dǎo)致大鼠體內(nèi)嘌呤、脂質(zhì)和氨基酸等代謝紊亂，而二妙丸可能通過苯丙氨酸代謝、甘油磷脂代謝和色氨酸代謝等代謝途徑對(duì)高尿酸癥大鼠產(chǎn)生治療作用，同時(shí)該研究首次建立了能同時(shí)定量高尿酸癥大鼠體內(nèi)9 種嘌呤代謝產(chǎn)物的血漿靶向代謝組學(xué)方法，為后續(xù)的靶向代謝研究提供了新啟發(fā)。

3.2 闡釋中藥復(fù)方制劑配伍內(nèi)涵

“藥有個(gè)性之特長(zhǎng)，方有合群之妙用”，中藥復(fù)方配伍具有目的性、動(dòng)態(tài)性、環(huán)境適應(yīng)性等特點(diǎn)[29]，體現(xiàn)了中醫(yī)辨證施治。中藥復(fù)方配伍的科學(xué)內(nèi)涵解釋一直是中醫(yī)藥研究領(lǐng)域的重要問題，研究者運(yùn)用代謝組學(xué)等方法對(duì)中藥復(fù)方的各藥材間協(xié)同作用進(jìn)行研究，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)復(fù)方中某一味或少數(shù)幾味藥材在復(fù)方中發(fā)揮的作用，一定程度揭示了中藥復(fù)方配伍原理，有望進(jìn)一步全面評(píng)價(jià)中藥復(fù)方配伍科學(xué)性。

Liu 等[14]根據(jù)“功效組”策略將“逍遙散”拆方為“健脾組”和“疏肝組”，通過腎臟代謝組學(xué)聯(lián)合腸道微生物群分析發(fā)現(xiàn)逍遙散可通過調(diào)節(jié)腎組織中精氨酸、?；撬岷偷团；撬峒肮劝彼岷凸劝滨０反x等代謝途徑發(fā)揮其抗抑郁和調(diào)節(jié)腸道微生物群穩(wěn)定的作用，而疏肝組和健脾組分別調(diào)節(jié)4 和5 種差異代謝產(chǎn)物，表明2 個(gè)功效組協(xié)同表現(xiàn)出抗抑郁作用，驗(yàn)證了“疏肝組”“健脾組”中藥材配伍的合理性、有效性。Chen 等[30]使用代謝組學(xué)和血清藥物化學(xué)結(jié)合，揭示了柴胡-白芍藥對(duì)可通過提高大鼠體內(nèi)苯甲酸和柴胡皂苷元F 的濃度以影響D-氨基酸氧化酶和順烏頭酸脫羧酶的活性，從而發(fā)揮其抗抑郁作用。該研究采用代謝組學(xué)和血清藥物化學(xué)結(jié)合的這種方法被稱為“中藥組學(xué)”，可以有效發(fā)現(xiàn)中藥入血成分，探索中醫(yī)證候生物標(biāo)志物和藥效機(jī)制，為進(jìn)一步闡明中藥配伍機(jī)制提供可靠的方法。

代謝組學(xué)可通過“藥物-差異代謝物-代謝途徑”進(jìn)一步探索中藥復(fù)方的作用機(jī)制，Hu 等[31]在對(duì)補(bǔ)中益氣湯調(diào)脾氣虛的療效進(jìn)行評(píng)價(jià)和活性成分篩選中，創(chuàng)造性提出了基于“內(nèi)源性-靶點(diǎn)-外源性”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的代謝組學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和血清藥理學(xué)相結(jié)合的策略。整體代謝組學(xué)契合中醫(yī)理論多系統(tǒng)、多靶點(diǎn)的整體觀，是研究中醫(yī)科學(xué)的最佳方法之一。《傷寒論》中記載：“病者氣血俱見于面，病已血先見”，機(jī)體血液變化與病情的發(fā)生和恢復(fù)密切相關(guān)，對(duì)機(jī)體進(jìn)行代謝變化檢測(cè)有利于對(duì)病情診斷和藥效評(píng)價(jià)。通過分析和驗(yàn)證疾病的特定早期生物標(biāo)志物，可以更好地了解病理過程和物質(zhì)代謝途徑，以確定中藥復(fù)方制劑的Q-Marker 和作用機(jī)制。與傳統(tǒng)的診斷方法相比，即使是微小的代謝物變化也有助于更敏感地發(fā)現(xiàn)早期病理變化。代謝組學(xué)在中藥復(fù)方作用機(jī)制研究中的應(yīng)用見表1。

表1 代謝組學(xué)在中藥復(fù)方制劑研究中的應(yīng)用Table 1 Application of metabolomics in study of traditional Chinese medicine compound preparations

4 代謝組學(xué)的發(fā)展

代謝組學(xué)研究可以有效地表示藥物進(jìn)入生物體，機(jī)體受擾動(dòng)后其內(nèi)源性代謝物水平的動(dòng)態(tài)變化情況，以確定該藥物治療特定疾病過程中作用的機(jī)體代謝途徑，但單一代謝組學(xué)只能定性、定量地從化合物到代謝途徑對(duì)中藥的作用機(jī)制進(jìn)行闡述，無法很好回答關(guān)于中藥復(fù)方中與藥效直接關(guān)聯(lián)的指標(biāo)性化合物在對(duì)機(jī)體的代謝調(diào)節(jié)過程中起何作用，及中藥復(fù)方除了對(duì)機(jī)體代謝影響外，還對(duì)哪些生理過程產(chǎn)生影響等問題。為了更好地闡明上述問題，研究過程中需要多組學(xué)結(jié)合研究。腸道微生物與機(jī)體代謝密切相關(guān)，而中藥制劑普遍為口服，這使消化道成為機(jī)體代謝中藥的主要途徑[50]，將腸道微生物組學(xué)與代謝組學(xué)聯(lián)合應(yīng)用，或許更能厘清中藥復(fù)方制劑在生物體內(nèi)的變化及其作用后的機(jī)體代謝變化，He 等[26]通過代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯治療氣滯血瘀證的23 種差異代謝物后，聯(lián)合腸道微生物群研究，指出經(jīng)桃紅四物湯干預(yù)后，大鼠腸道微生物有益菌豐度增加，致病菌豐度減少。腸道微生物群與差異代謝產(chǎn)物的相關(guān)性分析表明，二者通過相互調(diào)節(jié)影響大鼠血液系統(tǒng)，改善血虛血瘀證，進(jìn)一步解釋了桃紅四物湯作用機(jī)制。Wang 等[43]對(duì)四妙丸在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎過程中的作用代謝途徑進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)四妙丸主要通過影響大鼠機(jī)體花生四烯酸代謝和色氨酸代謝來調(diào)整其體內(nèi)代謝物質(zhì)水平，又通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)多組學(xué)結(jié)合分析，最終確定了四妙丸通過炎癥途徑發(fā)揮治療作用，黃柏堿是其藥效物質(zhì)之一。多組學(xué)技術(shù)彌補(bǔ)了單一代謝組學(xué)的部分局限，近年來，計(jì)算機(jī)技術(shù)的引入為代謝組學(xué)研究提供了啟示，如網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接技術(shù)等方法，通過“理論預(yù)測(cè)-試驗(yàn)驗(yàn)證”相印證，為更全面的揭示中藥“辨證論治”的核心過程提供科學(xué)依據(jù)。如網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)常用于建立“藥物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，并結(jié)合系統(tǒng)生物學(xué)等方法以研究中藥作用機(jī)制[51]，為代謝組學(xué)研究差異代謝物和顯著代謝途徑提供理論預(yù)測(cè)，而代謝組學(xué)的結(jié)合則為其提供了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。代謝組學(xué)聯(lián)合多方法研究在中藥復(fù)方制劑研究中的情況見表2。

表2 代謝組學(xué)聯(lián)合多方法研究在中藥復(fù)方制劑研究中的情況Table 2 Metabolomics combined with multi-method study in study of traditional Chinese medicine compound preparations

5 代謝組學(xué)面臨的挑戰(zhàn)

代謝組學(xué)已經(jīng)廣泛運(yùn)用于中醫(yī)藥研究并取得了諸多進(jìn)展，進(jìn)一步揭示了中藥和中成藥的Q-Marker及作用機(jī)制，還為中醫(yī)“辨證施治”思想提供了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度的理解啟發(fā)，但仍面臨一些挑戰(zhàn)。

5.1 多數(shù)代謝分析結(jié)果缺乏實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

代謝組學(xué)研究基于數(shù)據(jù)庫開展研究，目前常用的數(shù)據(jù)庫有KEGG、人類代謝組數(shù)據(jù)庫等，由于各數(shù)據(jù)庫收錄容量和范圍、各實(shí)驗(yàn)室對(duì)數(shù)據(jù)庫的選擇等原因，可能導(dǎo)致研究過程中因?yàn)闊o法完全篩選出藥物作用的全部生物標(biāo)志物，使得研究結(jié)果出現(xiàn)局限甚至重要代謝途徑遺漏問題；數(shù)據(jù)的篩選標(biāo)準(zhǔn)亟待優(yōu)化。在對(duì)代謝數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA、偏最小二乘判別分析或正交偏最小二乘判別分析等分析中，關(guān)鍵變量篩選標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性還有待考察，如VIP 值、樣本間代謝物濃度的差異倍數(shù)、代謝物在對(duì)比的2 組中是否存在顯著差異的表達(dá)量，很多研究采用VIP＞1、P＜0.05、差異倍數(shù)＞1[35-36]結(jié)合進(jìn)行分析。在實(shí)踐中，有時(shí)會(huì)根據(jù)篩選出的差異代謝物數(shù)量進(jìn)行自主調(diào)整篩查標(biāo)準(zhǔn)，如Liang 等[45]在對(duì)黃芪-郁金抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用進(jìn)行代謝組學(xué)研究時(shí)，血清差異脂質(zhì)代謝物篩選過程選用的標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05、差異倍數(shù)≥1.2或≤0.83，但這些限定范圍還缺乏一定文獻(xiàn)支撐。

5.2 代謝分析結(jié)果不可回溯

中藥成分復(fù)雜，且不同中藥材間存在許多交叉有效成分，代謝組學(xué)研究雖然可以揭示中藥復(fù)方在治療特定疾病過程中的差異代謝物和其作用的代謝途徑，但其篩選出的差異代謝物無法具體回溯到中藥復(fù)方某一個(gè)或少數(shù)幾味中藥材中。有研究者通過“功效組”研究策略解決上述問題，將中藥復(fù)方拆解為幾個(gè)中藥材組合作為多個(gè)藥效組進(jìn)行研究[38]，“拆方”思路或許為更好地將代謝組學(xué)研究運(yùn)用在對(duì)中藥復(fù)方中某一味或幾味中藥材的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用途徑研究提供啟示。

5.3 研究結(jié)果存在“萬能途徑”現(xiàn)象

代謝組學(xué)從代謝途徑上表征藥物作用后的差異代謝物和其作用的一些特定代謝途徑，但由于已知的代謝途徑及其研究仍有限，現(xiàn)有研究中基于代謝組學(xué)的中醫(yī)藥研究結(jié)果通常指向幾個(gè)普遍的代謝途徑，如能量代謝[34,37]、?；撬岷偷团；撬岽x[14,26,34,42]等，且由表1 可見大部分中藥復(fù)方制劑均作用了患病動(dòng)物的各類氨基酸代謝，難以更深層次闡釋藥物的作用機(jī)制，譬如藥物如何影響生物體細(xì)胞中mRNA 轉(zhuǎn)錄、基因表達(dá)等更微觀層次。

5.4 差異代謝物存在部分缺失的可能

代謝組學(xué)研究通?；趩畏治黾夹g(shù)展開，但單個(gè)分析技術(shù)最多只能表征幾百種代謝物，低覆蓋率較低，同時(shí)非靶向代謝組學(xué)中常見代謝物鑒定的不確定性使得非靶向代謝組學(xué)面臨檢測(cè)結(jié)果是否可靠和所得差異代謝物數(shù)量是否足夠的問題[52-53]，而靶向代謝組學(xué)強(qiáng)調(diào)特定代謝途徑或代謝產(chǎn)物，無法全面覆蓋整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)。可能導(dǎo)致遺漏重要的代謝途徑或產(chǎn)物，限制了對(duì)整體代謝調(diào)控的理解。值得注意的是，靶向代謝組學(xué)用的生物樣本的選擇和處理過程可能會(huì)產(chǎn)生一些變異性和誤差，從而導(dǎo)致所關(guān)注的代謝物流失，影響研究結(jié)果。靶向代謝研究主要關(guān)注代謝物的變化和代謝途徑的調(diào)控，缺乏對(duì)代謝物功能和代謝途徑的深入研究，此外，某些樣本（如靶向病灶樣本）的獲取可能具有一定的困難，限制了靶向代謝研究的范圍和可行性。因此，將代謝組學(xué)結(jié)果與生物學(xué)功能和疾病機(jī)制相結(jié)合仍然充滿挑戰(zhàn)。

5.5 其他

由于動(dòng)物活體的代謝本身就保持動(dòng)態(tài)變化，實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物的飼養(yǎng)環(huán)境、飼養(yǎng)過程、飼料的飼喂量和種類、實(shí)驗(yàn)過程的操作方法等均有可能對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生刺激而導(dǎo)致其體內(nèi)代謝水平發(fā)生明顯波動(dòng)，研究所用動(dòng)物類別及其性別也可能對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生影響。在代謝組學(xué)濕法實(shí)驗(yàn)階段，應(yīng)當(dāng)盡量保證飼養(yǎng)條件一致，嚴(yán)格遵照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》等規(guī)定科學(xué)飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以避免非用藥因素導(dǎo)致的顯著動(dòng)物代謝變化。

6 結(jié)語與展望

代謝組學(xué)研究在中醫(yī)藥領(lǐng)域研究方興未艾，但仍面臨一些挑戰(zhàn)，可以通過以下方式完善研究方案。（1）整合和更新眾多代謝研究數(shù)據(jù)庫，形成更完備的數(shù)據(jù)庫基礎(chǔ)，避免研究中重要代謝物和代謝途徑的遺失；（2）合理引入更多的系統(tǒng)生物學(xué)方法或技術(shù)，完成多組學(xué)、多方法、多技術(shù)整合應(yīng)用，擴(kuò)大代謝物鑒定覆蓋面，深度挖掘中藥復(fù)方制劑中復(fù)雜的衍生物和研究對(duì)象代謝物間的關(guān)系，深入探究代謝物生物功能，從而達(dá)到理論預(yù)測(cè)與試驗(yàn)驗(yàn)證相互印證的目的[54]；（3）基于中藥復(fù)方制劑配伍的多樣性和復(fù)雜性，合理運(yùn)用“中藥組學(xué)”和“功效組”等研究策略，將中藥復(fù)方“拆方分組”，揭示與某一條代謝途徑直接相關(guān)的藥材，溯本清源；（4）開展非靶向與靶向代謝組學(xué)結(jié)合研究，既可以更大程度理解機(jī)體受擾動(dòng)后的整體代謝變化，還可以將變化顯著的差異代謝物進(jìn)行靶向代謝研究，關(guān)注其變化和對(duì)特定代謝途徑的調(diào)控影響，避免研究中出現(xiàn)偏頗和遺漏。

代謝組學(xué)研究藥物作用于機(jī)體后、生物體內(nèi)發(fā)生的代謝變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物作用機(jī)制的追蹤。可以通過簡(jiǎn)便獲取生物流體樣品的方式，評(píng)估整體代謝譜，發(fā)現(xiàn)和區(qū)分病變與非病變組織[55]，回答了“中藥進(jìn)入生物體內(nèi)后，如何影響和調(diào)控機(jī)體代謝物水平”的問題，使中藥“整體調(diào)控”的認(rèn)知和研究走向更精微的水平，為揭開中藥內(nèi)涵的神秘本質(zhì)提供新的思路和研究工具。中藥研究與代謝組學(xué)相結(jié)合，有望在中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)、中藥藥效研究、中藥復(fù)方配伍內(nèi)涵和作用機(jī)制闡釋及推進(jìn)中藥復(fù)方制劑臨床運(yùn)用等方面取得重要進(jìn)展。代謝組學(xué)自興起的十余年內(nèi)發(fā)展如火如荼，成為研究者研究藥物作用機(jī)制的熱點(diǎn)工具，在利用代謝組學(xué)進(jìn)行研究的同時(shí)，還存在實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證不足、研究質(zhì)量良莠不齊、范圍覆蓋不全等問題，亟須修訂科學(xué)規(guī)范、嚴(yán)謹(jǐn)統(tǒng)一的代謝組學(xué)研究規(guī)程和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，出臺(tái)相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則，以促進(jìn)該學(xué)科的健康發(fā)展。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突