邢耀瑩 ，王姿楊 ，王 露 ，楊苗苗 ，龐 哲 ，趙 寧 ，崔治家 ，邵 晶 ,

1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000

2. 西北中藏藥省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730000

3. 國家中醫(yī)藥管理局三級(jí)實(shí)驗(yàn)室（中藥化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），甘肅 蘭州 730000

4. 甘肅省中醫(yī)藥研究中心，甘肅 蘭州 730000

5. 甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000

6. 甘肅省中藥制藥工藝工程研究中心，甘肅 蘭州 730000

藥對(duì)是中藥配伍組方的基本單位之一，通過組方的配伍分解，從闡釋藥對(duì)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制入手，是能有效、全面地闡釋中藥復(fù)方的重要途徑之一[1]。牛蒡子、甘草2 藥作為基本藥對(duì)配伍歷史悠久，獨(dú)立成方使用最早見《太平圣惠方》中記載：“牛蒡子散，牛蒡子1 兩（微炒）、甘草1 分（炙微赤，銼），治口瘡久不愈”[2]。后經(jīng)《證類治裁》《奇效良方》《本草綱目》等多部中醫(yī)藥典籍進(jìn)行轉(zhuǎn)載后形成了應(yīng)用主治各異的新處方，如明代《痘治理辨》中記載“牛蒡子甘草散，牛蒡子（麩炒）1 兩、甘草（炙）1 錢，麻痘初作，服此則稀”[3]；清代《雜病源流犀燭》中記載“甘草鼠粘湯，甘草1 兩、鼠粘根2 兩，主治肺熱，咽喉痛”等[4-5]?，F(xiàn)今常用的中藥復(fù)方如銀翹散、五福化毒丸、羚羊感冒片等中也多含有牛蒡子-甘草藥對(duì)，證明了牛蒡子-甘草藥對(duì)配伍使用的廣泛性和臨床有效性[6-7]。其中牛蒡子辛苦而寒，具有疏散風(fēng)熱、宣肺透疹、解毒利咽之功[8]，甘草甘平，能夠清熱解毒、潤肺止咳、緩急止痛等[9]，2 藥相伍，清補(bǔ)合法?，F(xiàn)代研究表明牛蒡子、甘草均具有抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等作用，與牛蒡子含有的木脂素類（牛蒡苷、牛蒡苷元）、綠原酸類（綠原酸A、B、C）等成分以及甘草含有黃酮類（甘草素、異甘草素、甘草查耳酮A）和三萜皂苷類（甘草酸、甘草次酸）等成分密切相關(guān)[10-11]。

炎癥反應(yīng)是機(jī)體對(duì)外界物理、化學(xué)或生物刺激及感染、內(nèi)源組織損傷等做出的防御性免疫反應(yīng)，廣泛發(fā)生于機(jī)體的細(xì)胞、組織和器官等[12]。依據(jù)其發(fā)生程度和持續(xù)時(shí)間的不同分為急性炎癥和慢性炎癥，急性炎癥持續(xù)時(shí)間較短，如局部組織損傷所致的發(fā)熱、紅腫、疼痛等。慢性炎癥持續(xù)時(shí)間較長，炎癥因子的長期異常分泌會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎、糖尿病、自身免疫性疾病以及腫瘤等多種炎癥性疾病的發(fā)生[13]。當(dāng)機(jī)體處于過度炎癥的環(huán)境下，巨噬細(xì)胞通過釋放大量炎癥因子來調(diào)控炎癥反應(yīng)，如一氧化氮（nitric oxide，NO）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等[14]。脂多糖為革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，能夠刺激巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子，常作為構(gòu)建RAW264.7 巨噬細(xì)胞炎癥模型的常用試劑，且該模型作為篩選抗炎藥物的經(jīng)典模型被廣泛應(yīng)用[15]。目前有關(guān)牛蒡子、甘草的報(bào)道主要聚焦于各單味藥材的研究，而對(duì)于2 藥配伍使用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究較少，探討其抗炎活性具有實(shí)際意義。

如何全面地反映牛蒡子-甘草藥對(duì)抗炎活性成分的關(guān)鍵在于探索牛蒡子-甘草藥對(duì)的抗炎作用物質(zhì)基礎(chǔ)。中藥譜效學(xué)以中藥指紋圖譜為研究基礎(chǔ)，與藥效評(píng)價(jià)相結(jié)合，并應(yīng)用生物信息學(xué)方法建立譜-效相關(guān)性分析，可為揭示中藥藥效物質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)[16]。本研究基于牛蒡子、甘草藥對(duì)臨床應(yīng)用的歷史有效性和廣泛性，以收集到的18 批樣品研究建立牛蒡子-甘草藥對(duì)HPLC 指紋圖譜，以脂多糖刺激RAW264.7 細(xì)胞制備炎性細(xì)胞，分析HPLC 共有峰與炎性指標(biāo)間的譜效相關(guān)性，以期為牛蒡子-甘草藥對(duì)抗炎的有效成分群的闡釋及藥效學(xué)機(jī)制研究提供科學(xué)基礎(chǔ)，為進(jìn)一步開發(fā)利用該藥對(duì)提取物的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考，也為含有該藥對(duì)的中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制的全面闡釋提供研究基礎(chǔ)和思路方向。

1 材料

1.1 細(xì)胞

RAW264.7 細(xì)胞株（批號(hào)JF4RFYWU3S）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥材

炒牛蒡子、甘草藥材購自不同生產(chǎn)廠家，以同一廠家藥材為原則進(jìn)行配對(duì)，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)崔治家教授分別鑒定為菊科牛蒡?qū)僦参锱］駻rctium lappaL.的干燥成熟果實(shí)和豆科甘草屬植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖。具體信息見表1。

表1 牛蒡子-甘草樣品信息Table 1 Information of Arctii Fructus-Glycyrrhizae Radix et Rhizoma samples

1.3 試劑

甲醇（批號(hào)20220103）、乙腈（批號(hào)20221005）、甲酸（批號(hào)20280825）為色譜純，均購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；95%乙醇（批號(hào)20190301）為分析純，購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司；對(duì)照品異甘草苷（批號(hào)Y15A10H95344）、異綠原酸B（批號(hào)AF20060701）、甘草素（批號(hào)C26A10Q87040）、異綠原酸A（批號(hào)AF20020302）、甘草查耳酮A（批號(hào) A19GB145817 ）、 牛蒡苷元（ 批號(hào)Y26D6Y17483）、甘草酸（批號(hào)Y02J11L113432）、甘草苷（批號(hào)Z07J12X136344）、牛蒡子苷（批號(hào)Z11D6B7394）、異甘草素（批號(hào)H03D9Z76567）、綠原酸（批號(hào) B20782）、異綠原酸 C（批號(hào)AF20121801）、甘草次酸（批號(hào)B31O9D73752）均購自上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%；脂多糖（批號(hào)820F036）、MTT（批號(hào)917Q054）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號(hào)1121E0324）、PBS 緩沖液（批號(hào)P1020）購自北京索萊寶科技有限公司；RAW264.7 細(xì)胞專用培養(yǎng)基（批號(hào)WHAA23E072）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.4 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；BS110S 型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；SB-5200DTD 型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；AP-01P 型真空泵（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）；800Y 型高速多功能粉碎機(jī)（永康市鉑歐五金制品有限公司）；OHG-9070B 型智能電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海瑯實(shí)設(shè)備有限公司）；Benchmark plus 型酶標(biāo)儀（上海新振儀器設(shè)備有限公司）；CKX41+DP21 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；CPY-180 型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；IC1000 型Countstar 自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（上海睿鈺生物科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 指紋圖譜的建立

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱定綠原酸、甘草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、異甘草苷、牛蒡子苷、甘草素、甘草酸、異甘草素、牛蒡苷元、甘草查耳酮A、甘草次酸對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為40、48、36、48、44、40、44、48、44、40、40、44、40 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱定炒牛蒡子、甘草飲片粉末（過3 號(hào)篩）各2 g，于具塞錐形瓶中，移液管量取80 mL 95%乙醇加入，稱定質(zhì)量，45 ℃超聲提取30 min（40 kHz、250 W），補(bǔ)足減失的質(zhì)量后抽濾，取續(xù)濾液5 mL，水浴揮干溶劑，經(jīng)同體積甲醇復(fù)溶后即得供試品溶液；余量濾液揮干溶劑，干浸膏留存。

2.1.3 色譜條件[17]色譜柱為Agilent SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長254 nm；體積流量0.5 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相為乙腈-0.2%甲酸水溶液，梯度洗脫：0～5 min，20%乙腈；5～15 min，20%～25%乙腈；15～20 min，25%～27%乙腈；20～25 min，27%～29%乙腈；25～35 min，29%～31%乙腈；35～40 min，31%～33%乙腈；40～45 min，33%～50%乙腈；45～50 min，50%～52%乙腈；50～70 min，52%～54%乙腈；70～75 min，54%～55%乙腈；75～80 min，55%～57%乙腈；80～95 min，57%～80%乙腈；95～105 min，80%～90%乙腈；105～110 min，90%乙腈。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度試驗(yàn) 取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，以響應(yīng)值較大且分離度較好的第7 個(gè)峰為參照峰，計(jì)算得13 種對(duì)照品相對(duì)峰面積的RSD 均小于3%，結(jié)果顯示所用儀器的精密度較好。

2.2.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一牛蒡子-甘草藥對(duì)（S1），按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備6 個(gè)平行供試品溶液，依據(jù)“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以響應(yīng)值較大且分離度較好的第7 個(gè)峰為參照峰，計(jì)算得13 種成分相對(duì)峰面積的RSD 均小于3%，說明所選用的色譜方法具有較好的重復(fù)性。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一牛蒡子-甘草藥對(duì)（S1）供試品溶液分別于0、2、4、8、12、24 h 按“2.1.3”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測定，以響應(yīng)值較大且分離度較好的第7 個(gè)峰為參照峰，計(jì)算得13 種成分相對(duì)峰面積的RSD 均小于3%，表明所制備的供試品溶液在24 h內(nèi)質(zhì)量穩(wěn)定。

2.3 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

2.3.1 指紋圖譜的生成 取18 批牛蒡子-甘草藥對(duì)樣品（S1～S18），按“2.1.2”項(xiàng)下方法依次制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。測定結(jié)果導(dǎo)出為TXT 格式，依次導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012 年版）軟件，得到18批樣品（S1～S18）的疊加圖譜。采用中位數(shù)法，時(shí)間寬度為0.2 min，以S1 作為參照?qǐng)D譜，經(jīng)多點(diǎn)校正后采用mark 峰匹配，共確定38 個(gè)共有峰，生成對(duì)照?qǐng)D譜，見圖1。

圖1 18 批牛蒡子-甘草藥對(duì)樣品 (S1～S18) 的指紋圖譜疊加圖及其對(duì)照指紋圖譜 (R)Fig. 1 Fingerprint overlay of 18 batches of Arctii Fructus-Glycyrrhizae Radix et Rhizoma drug pair samples (S1—S18) and their control fingerprints (R)

2.3.2 相似度評(píng)價(jià) 選擇分離度好、含量較高的38個(gè)色譜峰作為牛蒡子-甘草藥對(duì)的指紋圖譜共有特征峰，以對(duì)照指紋圖譜為參照，對(duì)18 批牛蒡子-甘草藥對(duì)指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)見表2，從表中可以看出，牛蒡子-甘草藥對(duì)的指紋圖譜相似度均＞0.7，表明所建立的指紋圖譜方法可用于牛蒡子-甘草藥對(duì)的整體質(zhì)量控制。

表2 18 批牛蒡子-甘草藥對(duì)共有模式相似度Table 2 Similarity of common pattern between 18 batches of Arctii Fructus-Glycyrrhizae Radix et Rhizoma drug pair

2.4 共有峰的指認(rèn)與分析

2.4.1 共有峰的指認(rèn) 取“2.1.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，得混合對(duì)照品溶液色譜圖（圖2）。通過與供試品溶液出峰的保留時(shí)間比對(duì)，可指認(rèn)牛蒡子-甘草藥對(duì)共有峰F2、F5～F8、F11、F13、F15、F17、F20、F21、F26、F35 分別為綠原酸、甘草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、異甘草苷、牛蒡子苷、甘草素、甘草酸、異甘草素、牛蒡苷元、甘草查耳酮A、甘草次酸。

圖2 混合對(duì)照品色譜圖Fig. 2 Chromatogram of mixed control

2.4.2 聚類分析 聚類分析能夠從整體角度分析并比較不同樣品間的相似性，排除相關(guān)性較差變量的影響[18]。對(duì)18 批牛蒡子-甘草藥對(duì)的數(shù)據(jù)采用聚類分析法[19]進(jìn)行分析以探索其差異性。使用SPSS 26.0軟件，以18 批牛蒡子-甘草藥對(duì)指紋圖譜的38 個(gè)共有峰的峰面積作為變量，選擇平方歐式距離為測度，采用組間均聯(lián)法進(jìn)行系統(tǒng)聚類，對(duì)其進(jìn)行聚類分析。結(jié)果顯示，當(dāng)平方歐式距離為10 時(shí)，18 批樣品可以被分為3 類，S7、S18、S1、S14、S11、S2、S6、S8 為第1 類，S10、S17、S12、S16、S13、S15、S5、S9、S3 為第2 類，S4 為第3 類，聚類分析樹狀圖見圖3。

圖3 聚類分析樹狀圖Fig. 3 Cluster analysis tree diagram

2.4.3 主成分分析（principal component analysis，PCA） PCA 能將多個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個(gè)主成分，這些主成分是原始變量的線性組合，且彼此之間互不相關(guān)，可以直觀顯示出不同樣品之間的整體差異性，進(jìn)一步尋找不同批牛蒡子-甘草藥對(duì)質(zhì)量的差異性變量[20]。將18 批牛蒡子-甘草藥對(duì)指紋圖譜的38個(gè)共有峰的峰面積作為變量，結(jié)合SIMCA 14.1與SPSS 26.0 軟件對(duì)其進(jìn)行PCA，以特征值＞1，自動(dòng)得到5 個(gè)主成分，累積方差貢獻(xiàn)率為92.272%，相關(guān)信息見表3，結(jié)合總方差解釋結(jié)果，觀察碎石圖（圖4），當(dāng)折線由陡峭突然變得平穩(wěn)時(shí)，陡峭到平穩(wěn)對(duì)應(yīng)的因子個(gè)數(shù)即為參考提取因子個(gè)數(shù)。結(jié)果表明，5 個(gè)主成分能夠充分體現(xiàn)38 個(gè)共有峰的基本特征值和主要信息，可以作為牛蒡子-甘草藥對(duì)質(zhì)量的差異性變量反映其整體質(zhì)量，具有進(jìn)一步研究的意義。

圖4 公因子碎石圖Fig. 4 Common factor lithotripsy diagram

表3 主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率Table 3 Eigenvalues and variance contribution rates of principal component

主成分載荷矩陣反映了各變量對(duì)主成分的貢獻(xiàn)大小和作用方向[21]。依據(jù)表4 可以看出38 個(gè)共有峰中F2～F4、F7、F22～F25、F27～F30、F32～F34、F36、F37 位于第1 個(gè)主成分上有較高的載荷，F(xiàn)3、F4、F7～F10、F12、F13、F14、F16、F17～F19、F33 位于第2 個(gè)主成分上有較高的載荷，F(xiàn)12、F14、F19、F21、F22、F26、F31、F38 位于第3 個(gè)主成分上有較高的載荷，F(xiàn)1、F6、F8、F15、F20、F35 位于第4 主成分上有較高的載荷，F(xiàn)5、F11、F22 位于第5 主成分上有較高的載荷，主成分含義較清晰，說明影響樣品質(zhì)量差異的并不是單一成分，而是由多個(gè)成分聚集產(chǎn)生作用，對(duì)應(yīng)中藥治療疾病多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。選擇6 個(gè)主成分進(jìn)行PCA，繪制主成分得分圖，結(jié)果見圖5，樣品總體可聚為2 類（S4與S13 為離群樣品），與聚類分析結(jié)果基本一致，樣品間產(chǎn)生差異可能與采收季節(jié)、產(chǎn)地加工和炮制等相關(guān)。進(jìn)一步根據(jù)各主成分值及貢獻(xiàn)率分別計(jì)算綜合得分，評(píng)價(jià)18 批牛蒡子-甘草藥對(duì)樣品的質(zhì)量，結(jié)果見表5，綜合得分的排名反映出18 批牛蒡子-甘草藥材的質(zhì)量差異，排名越高質(zhì)量越好。

圖5 主成分得分圖Fig. 5 Principal component score chart

表4 主成分矩陣Table 4 Principal component matrix

2.5 18 批牛蒡子-甘草對(duì)脂多糖所致RAW264.7 細(xì)胞炎癥模型的影響

2.5.1 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7 細(xì)胞采用專用培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.5.2 樣品制備 取“2.1.2”項(xiàng)下留存干浸膏（樣品S1），加入專用培養(yǎng)基配制成2 mg/mL（含0.1%DMSO）的樣品母液，過0.22 μm 微孔濾膜，備用。

2.5.3 牛蒡子-甘草對(duì)RAW264.7 細(xì)胞活性的影響取處于對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×105～2.0×105個(gè)/mL，每孔200 μL 接種于96 孔板中（空白組為200 μL 完全培養(yǎng)基），37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，棄去孔中原培養(yǎng)液，空白組與正常組加入200 μL 完全培養(yǎng)基，給藥組分別加入含2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 mg/mL 牛蒡子-甘草藥對(duì)95%乙醇總提物的完全培養(yǎng)基，每組5 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h 后，各孔加5 mg/mL MTT 溶液20 μL，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去各孔上清液，加入150 μL DMSO，振蕩混勻15～20 min，待各孔中紫色結(jié)晶完全溶解，于570 nm 處測定吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝(A給藥－A空白)/(A正常－A空白)

采用GraphPad Prism 9 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果見表6。當(dāng)牛蒡子-甘草藥對(duì)95%乙醇總提物質(zhì)量濃度高于1.0 mg/mL 時(shí)，細(xì)胞存活率低于90%；當(dāng)牛蒡子-甘草藥對(duì)95%乙醇總提物質(zhì)量濃度為0.2～0.8 mg/mL 時(shí)，細(xì)胞存活率大于90%且隨質(zhì)量濃度變化趨勢小，可以為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。

表6 牛蒡子-甘草藥對(duì)95%乙醇總提物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞活力的影響 (±s, n = 5)Table 6 Effect of Arctii Fructus-Glycyrrhizae Radix et Rhizoma drug pair on 95% alcohol total extract on RAW264.7 cell viability (±s, n = 5)

表6 牛蒡子-甘草藥對(duì)95%乙醇總提物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞活力的影響 (±s, n = 5)Table 6 Effect of Arctii Fructus-Glycyrrhizae Radix et Rhizoma drug pair on 95% alcohol total extract on RAW264.7 cell viability (±s, n = 5)

與空白組比較：##P＜0.01；與對(duì)照組比較：**P＜0.01。##P ＜ 0.01 vs blank group; **P ＜ 0.01 vs control group.

組別 質(zhì)量濃度/(mg·mL-1) 細(xì)胞存活率/%空白 — 0.00±0.75正常 — 100.00±3.78##牛蒡子-甘草藥對(duì) 0.2 119.74±1.40**95%乙醇總提物 0.4 119.84±2.96**0.6 117.00±2.65**0.8 117.35±3.25**1.0 103.88±4.65 1.2 35.26±3.53**1.4 12.88±0.65**1.6 12.84±1.07**1.8 12.17±1.29**2.0 112.50±1.38**

2.5.4 不同質(zhì)量濃度牛蒡子-甘草藥對(duì)95%乙醇總提物對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞分泌NO 的影響 取處于對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×105～2.0×105個(gè)/mL，每孔200 μL接種于96 孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，棄去孔中原培養(yǎng)液，正常組加入200 μL 專用培養(yǎng)基，模型組加入200 μL 含脂多糖（1 μg/mL）專用培養(yǎng)基，給藥組分別加入200 μL 0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 mg/mL 牛蒡子-甘草藥對(duì)95%乙醇總提物含脂多糖（1 μg/mL）專用培養(yǎng)基，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按相關(guān)試劑盒說明書操作，檢測細(xì)胞分泌NO 水平。采用GraphPad Prism 9 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。

由表7 可知，與正常組比較，模型組NO 含量明顯上升（P＜0.01）；與模型組比較，牛蒡子-甘草藥對(duì)95%乙醇總提物干預(yù)后在質(zhì)量濃度0.2～0.8 mg/mL 內(nèi)NO 含量降低（P＜0.01），并呈劑量相關(guān)性。為盡可能準(zhǔn)確篩選牛蒡子-甘草藥對(duì)抗炎活性有效成分群，設(shè)定給藥質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL 進(jìn)行后續(xù)18 批牛蒡子-甘草藥對(duì)95%乙醇總提物抗炎譜效相關(guān)性研究。

表7 牛蒡子-甘草藥對(duì)95%乙醇總提物對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞分泌NO 的影響 (±s, n = 3)Table 7 Effect of Arctii Fructus-Glycyrrhizae Radix et Rhizoma drug pair on secretion of NO from lipopolysaccharide-induced RAW264. 7 cells (±s, n = 3)

表7 牛蒡子-甘草藥對(duì)95%乙醇總提物對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞分泌NO 的影響 (±s, n = 3)Table 7 Effect of Arctii Fructus-Glycyrrhizae Radix et Rhizoma drug pair on secretion of NO from lipopolysaccharide-induced RAW264. 7 cells (±s, n = 3)

與正常組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01，表8 同。##P ＜ 0.01 vs normal group; **P ＜ 0.01 vs model group, same as Table 8.

組別 質(zhì)量濃度/(mg·mL-1) NO/(μmol·L-1)正常 — 5.17±0.13模型 — 11.53±0.27##牛蒡子-甘草藥對(duì) 0.1 11.13±0.23 95%乙醇總提物 0.2 10.11±0.28**0.3 9.20±0.13**0.4 8.34±0.14**0.5 7.93±0.16**0.6 7.72±0.15**0.7 7.46±0.13**0.8 7.38±0.07**

2.5.5 體外抗炎實(shí)驗(yàn) 按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，得到18 批牛蒡子-甘草藥對(duì)95%乙醇總提物，按照相關(guān)試劑盒說明書操作，檢測細(xì)胞NO 水平。結(jié)果見表8，與正常組比較，模型組NO 分泌量升高（P＜0.01）；與模型組比較，18 批樣品均能不同程度降低RAW264.7 炎性細(xì)胞的NO 分泌量。

表8 18 批牛蒡子-甘草藥對(duì)95%乙醇總提物對(duì)NO 分泌量的影響 (±s, n = 3)Table 8 Effect of 18 batches of Arctii Fructus-Glycyrrhizae Radix et Rhizoma drug pair on 95% total alcohol extract on NO secretion (±s, n = 3)

表8 18 批牛蒡子-甘草藥對(duì)95%乙醇總提物對(duì)NO 分泌量的影響 (±s, n = 3)Table 8 Effect of 18 batches of Arctii Fructus-Glycyrrhizae Radix et Rhizoma drug pair on 95% total alcohol extract on NO secretion (±s, n = 3)

編號(hào) NO/(μmol·L-1) 編號(hào) NO/(μmol·L-1)正常 5.82±0.09 S9 6.22±0.08**模型 9.54±0.07## S10 6.75±0.06**S1 6.71±0.04** S11 6.33±0.07**S2 5.64±0.03** S12 7.98±0.21**S3 6.98±0.22** S13 5.82±0.04**S4 6.97±0.14** S14 6.66±0.11**S5 6.63±0.09** S15 7.00±0.04**S6 6.47±0.04** S16 6.17±0.07**S7 6.06±0.16** S17 5.62±0.07**S8 6.15±0.12** S18 5.71±0.02**

2.6 灰色關(guān)聯(lián)度分析（gray correlation analysis，GCA）

GCA 能夠表征各因素間的關(guān)聯(lián)程度，通過計(jì)算關(guān)聯(lián)度，然后根據(jù)關(guān)聯(lián)的大小進(jìn)行排序、分析，關(guān)聯(lián)度值越大，說明關(guān)系越密切，對(duì)藥效的“貢獻(xiàn)”越大。主要包括定義參考序列和比較序列、處理參考數(shù)列和比較數(shù)列數(shù)據(jù)、計(jì)算參考數(shù)列和比較數(shù)列的絕對(duì)差值、計(jì)算灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)和灰色關(guān)聯(lián)度[22]。

2.6.1 原始數(shù)據(jù)的無量綱化處理 為消除因變量與各變量之間單位不同的影響，用均值化法對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行無量綱化處理[23]。將牛蒡子-甘草藥對(duì)抗炎作用的藥效指標(biāo)作為母序列，牛蒡子-甘草藥對(duì)95%乙醇總提物的共有峰峰面積作為子序列，變換的母序列記為Y(k)（k為18 批樣品編號(hào)）、子序列記為Xf(k)（f為峰號(hào)）。

2.6.2 序列和子序列絕對(duì)差序列及關(guān)聯(lián)度的計(jì)算根據(jù)公式計(jì)算母序列與子序列的絕對(duì)差序列[Δf(k)]和關(guān)聯(lián)度[Af(k)]。當(dāng)關(guān)聯(lián)度大于0.8 時(shí)，表明子序列與母序列關(guān)聯(lián)密切，當(dāng)關(guān)聯(lián)度0.6～0.8 時(shí)，表明兩者關(guān)聯(lián)度一般[24]。

ρ為分辨系數(shù)，取值為0.5

18 批樣品對(duì)RAW264.7 細(xì)胞NO 分泌量的影響與其指紋圖譜38 個(gè)共有峰的關(guān)聯(lián)度見表9，結(jié)果顯示，除F34、F36 外，其余色譜峰的灰色關(guān)聯(lián)度均大于0.8，進(jìn)一步說明牛蒡子-甘草藥對(duì)抗炎活性是多種成分共同作用的結(jié)果。各共有峰所代表的化學(xué)成分對(duì)其抗炎活性的影響程度有所不同，與RAW264.7 細(xì)胞NO 分泌量有較大關(guān)聯(lián)性的色譜峰貢獻(xiàn)大小順序?yàn)镕5（甘草苷）＞F17（甘草酸）＞F1＞F3＞F4＞F9＞F11（異甘草苷）＞F13（牛蒡子苷）＞F19＞F23＞F21（牛蒡苷元）＞F14。

表9 18 批牛蒡子-甘草藥對(duì)共有峰峰面積與抗炎藥效的關(guān)聯(lián)度Table 9 Correlation between peak areas of shared peaks and anti-inflammatory efficacy of 18 batches of Arctii Fructus-Glycyrrhizae Radix et Rhizoma drug pair

2.7 指紋圖譜與抗炎藥效的偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）分析

PLSR 分析是一種模型擬合度好和預(yù)測能力強(qiáng)的數(shù)據(jù)處理方法，集聚類分析、PCA、多元線性回歸（multiple linear regression，MLR）優(yōu)勢為一體，且具有無須剔除樣本、預(yù)測精度高、計(jì)算量小，易于定性解釋等特點(diǎn)，已普遍應(yīng)用于中藥譜效學(xué)[25]。利用SIMCA14.1 軟件，將18 批牛蒡子-甘草藥對(duì)38個(gè)共有峰的峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，結(jié)果作為自變量（X），RAW264.7 細(xì)胞NO 分泌量作為因變量（Y），進(jìn)行PLSR 分析，結(jié)果見圖6，結(jié)果表明所標(biāo)示的共有峰中F1、F3、F5、F6、F9、F15、F17、F18、F20～F23、F25、F26、F28、F29、F33～F37 與RAW264.7 細(xì)胞NO 分泌量呈負(fù)相關(guān)，與牛蒡子-甘草藥對(duì)抗炎藥效呈正相關(guān)。

圖6 回歸系數(shù)圖Fig. 6 Regression coefficient graph

基于PLSR 分析變量的選擇方法進(jìn)行變量重要性投影（variable importance projection，VIP）分析。VIP 值反映了自變量對(duì)因變量的解釋能力，值越大（VIP＞1），解釋能力越強(qiáng)[26]。18 批牛蒡子-甘草藥對(duì)指紋圖譜的38 個(gè)共有峰與RAW264.7 細(xì)胞NO分泌量的VIP 圖見圖7，由VIP 圖可知，牛蒡子-甘草藥對(duì)38 個(gè)共有峰中17 個(gè)特征峰（VIP＞1）與其抗炎作用顯著相關(guān)且F21（VIP＞1.5）貢獻(xiàn)較大，牛蒡苷元（F21）是引起18 批牛蒡子-甘草藥對(duì)抗炎藥效產(chǎn)生差異的最主要變量。

圖7 VIP 分析Fig. 7 VIP analysis

3 討論

中藥復(fù)方應(yīng)在傳統(tǒng)配伍理論和臨床應(yīng)用基礎(chǔ)上開展繼承創(chuàng)新的現(xiàn)代開發(fā)研究，闡釋藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制是推動(dòng)中藥復(fù)方現(xiàn)代化創(chuàng)新開發(fā)研究的科學(xué)需求。藥對(duì)是中藥配伍組方的基本單位之一，在中醫(yī)臨證方劑配伍中起到相輔相成的作用[1]。

本研究以色譜峰信息量最大化、方法穩(wěn)定為宗旨優(yōu)化了提取條件；對(duì)流動(dòng)相配比、柱溫、體積流量和波長等進(jìn)行篩選，以色譜峰分離度和峰面積為考察目標(biāo)確定了最佳色譜條件，且依據(jù)課題組前期文獻(xiàn)信息挖掘及“生信分析-網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)-分子對(duì)接”的相關(guān)研究確定牛蒡子和甘草藥材具有抗炎活性研究基礎(chǔ)的有效成分作為對(duì)照品。牛蒡子-甘草藥對(duì)指紋圖譜共標(biāo)定38 個(gè)共有峰，經(jīng)混合對(duì)照品溶液指認(rèn)出13 個(gè)共有峰，18 批樣品相似度均＞0.7，表明所建立的指紋圖譜方法可用于藥對(duì)的整體質(zhì)量評(píng)價(jià)。聚類分析結(jié)果顯示，當(dāng)平方歐式距離為10 時(shí)，18 批樣品被分為3 類；PCA 得到5 個(gè)主成分，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為92.272%，能夠充分體現(xiàn)牛蒡子-甘草藥對(duì)活性成分的基本信息，選擇6 個(gè)主成分繪制主成分得分圖，樣品總體可聚為2 類（S4 與S13 為離群樣品），與聚類分析結(jié)果基本一致，樣品間產(chǎn)生差異可能與采收季節(jié)、產(chǎn)地加工和炮制等相關(guān)。進(jìn)一步根據(jù)各主成分值及貢獻(xiàn)率分別計(jì)算18 批樣品綜合得分，來評(píng)價(jià)收集到的18 批牛蒡子-甘草藥對(duì)質(zhì)量，綜合得分的排名越高說明藥材的質(zhì)量越好，結(jié)果顯示樣品S7 質(zhì)量最佳。

本研究以脂多糖刺激RAW264.7 細(xì)胞制備炎性細(xì)胞模型[27]，以NO 分泌量作為藥效學(xué)指標(biāo)考察18批牛蒡子-甘草藥對(duì)的抗炎活性。首先以細(xì)胞存活率為判定指標(biāo)對(duì)給藥安全劑量進(jìn)行篩選，當(dāng)牛蒡子-甘草藥對(duì)95%乙醇總提物質(zhì)量濃度為0.2～0.8 mg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率均大于100%，進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)后結(jié)果一致，說明牛蒡子-甘草藥對(duì)95%乙醇總提物在0.2～0.8 mg/mL 能夠促進(jìn)細(xì)胞活力，但隨質(zhì)量濃度變化趨勢不明顯，考慮可能與藥物質(zhì)量濃度設(shè)定梯度變化較小和細(xì)胞種板均勻度相關(guān)。在給藥安全劑量范圍內(nèi)設(shè)定梯度質(zhì)量濃度考察牛蒡子-甘草藥對(duì)95%乙醇總提物的抗炎活性，與模型組比較，給藥組NO 分泌量顯著降低，呈劑量相關(guān)性，體外抗炎實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，18 批樣品均能不同程度降低RAW264.7 炎性細(xì)胞的NO 分泌量。值得注意的是，實(shí)驗(yàn)過程中空白組NO 分泌量較高，考慮RAW264.7細(xì)胞對(duì)于培養(yǎng)環(huán)境要求嚴(yán)格，尤其對(duì)于CO2的濃度具有較高的敏感性，在實(shí)驗(yàn)期間不同實(shí)驗(yàn)人員不定期開關(guān)培養(yǎng)箱使其培養(yǎng)環(huán)境無法長時(shí)間穩(wěn)定，導(dǎo)致細(xì)胞活力有所降低，這可能是導(dǎo)致空白組NO 釋放量過高的重要原因。

本研究采用GCA 和PLSR 分析對(duì)牛蒡子-甘草藥對(duì)的抗炎活性進(jìn)行譜效相關(guān)性分析，GCA 結(jié)果表明38 個(gè)共有峰中多個(gè)成分的關(guān)聯(lián)度均大于0.8，色譜峰貢獻(xiàn)大小順序?yàn)镕5（甘草苷）＞F17（甘草酸）＞F1＞F3＞F4＞F9＞F11（異甘草苷）＞F13（牛蒡子苷）＞F19＞F23＞F21（牛蒡苷元）＞F14，說明牛蒡子-甘草藥對(duì)的抗炎活性是通過多成分協(xié)同作用產(chǎn)生的；其中甘草苷、甘草酸、異甘草苷、牛蒡子苷、牛蒡苷元已明確具有較好的抗炎作用，甘草總皂苷（甘草酸等）能夠通過抑制NO、TNF-α、IL-6的炎癥因子的分泌來達(dá)到抗炎作用，牛蒡苷元可以通過抑制Janus 激酶（Janus kinase，JAK）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子（signal transducer and activators of transcription，STAT）信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用[28-29]，牛蒡苷可通過抗炎、解熱等途徑減輕炎癥反應(yīng)[30]。PLSR 分析結(jié)果顯示，牛蒡子-甘草藥對(duì)38 個(gè)共有峰中有17 個(gè)特征峰（VIP＞1）與其抗炎作用顯著相關(guān)，且牛蒡苷元（F21，VIP＞1.5）是引起18 批牛蒡子-甘草藥對(duì)抗炎藥效產(chǎn)生差異的主要變量。牛蒡子-甘草藥對(duì)臨床配伍應(yīng)用中牛蒡子的炮制加工方法分別為炒制品和生品，相關(guān)研究表明，炒制條件的不同使得牛蒡子的抗炎藥效存在差異，高溫炒制使部分牛蒡子苷分解成其抗炎主要活性成分牛蒡苷元[31]。一定程度解釋了可能由于18 批樣品炒制程度不同，導(dǎo)致牛蒡苷元含量差異，使其成為影響牛蒡子-甘草藥對(duì)抗炎藥效產(chǎn)生差異的主要變量。

綜上，本研究建立了牛蒡子-甘草藥對(duì)HPLC 指紋圖譜的研究方法，通過GCA 與PLSR 分析探討了指紋圖譜共有峰與抗炎活性的譜效相關(guān)性，篩選出牛蒡子-甘草藥對(duì)抗炎作用的有效成分群，可為牛蒡子-甘草藥對(duì)的抗炎藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、質(zhì)量評(píng)價(jià)及相關(guān)制劑開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，在未指認(rèn)的化學(xué)成分中也有部分與該藥對(duì)抗炎藥效具有一定關(guān)聯(lián)性，后續(xù)將采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步闡釋研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突