宋 瑋，張鐘藝，王 楷，沈 濤

成都中醫(yī)藥大學，四川 成都 610075

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是動脈內膜的脂質、血液成分沉積，平滑肌細胞及膠原纖維增生，伴有壞死及鈣化等不同程度病變的慢性進行性病理過程[1]。流行病學研究顯示，在我國有超過3.3 億的心血管病患者，且導致的死亡人數(shù)占全球死亡人數(shù)的1/3，而AS 就是導致心血管疾病的最主要原因[2]。目前治療AS 的藥物主要針對脂質代謝和血小板活化途徑，如他汀類和阿司匹林等[3]，治療效果有限，并能引發(fā)細胞損傷、肝腎損傷及肌病等不良反應[4]。腸道菌群與AS 之間有密切聯(lián)系，調節(jié)腸道菌群穩(wěn)態(tài)已成為防治AS 新靶點。研究表明，氧化三甲胺（trimethylamine oxide，TMAO）作為腸道菌群衍生的代謝產物，是炎癥調控的關鍵因子，可增加炎癥因子釋放或激活相關炎癥通路，促進泡沫細胞在血管內沉積[5]。TMAO 升高會導致大量活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的生成，過量的 ROS 誘導硫氧還蛋白相互作用蛋白（thioredoxin interacting protein，TXNIP）從硫氧還蛋白（thioredoxin，TRX）中解離。TXNIP 降低TRX的ROS 清除能力并與核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白（NOD like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3）結合，介導NLRP3 炎癥小體與凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated specklike protein，ASC）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3 前體（pro-cystein-asparate protease-3，pro-Caspase-3）的組裝。隨后Caspase-1 的自切割和激活反過來導致白細胞介素-1β 前體（pro-interleukin-1β，pro-IL-1β）和pro-IL-18 加工成其成熟形式，然后誘導其他促炎基因的表達，引發(fā)氧化應激和炎癥反應，促進AS 形成[6]。

中醫(yī)學認為，中焦氣機升降失司，脾不散津，津液代謝紊亂，聚濕生痰，日久生瘀，痰瘀互結阻于脈道，導致AS 發(fā)生[7]。因此，升清降濁、恢復中焦升降功能，是調控血脂、防治AS 的關鍵。茱萸丸出自《太平圣惠方》，方中黃連、吳茱萸等比配伍，黃連味苦而性寒，吳茱萸味辛苦而性熱，二者苦辛相合，具有苦辛化濁的功效[8]。課題組前期研究證實，黃連、吳茱萸配伍可顯著調控高脂模型動物血脂，且1∶1 調血脂效果最佳[9]，同時可通過巨噬細胞極化、影響脂代謝相關基因發(fā)揮抗炎效應[10-11]。為進一步探討茱萸丸防治AS 的作用機制，本研究以TMAO 介導的ROS/TXNIP/NLRP3 信號通路為切入點，探討其減輕內皮細胞損傷的機制，為臨床治療AS 提供新思路。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠13 只，同品系的低密度脂蛋白受體敲除（low density lipoprotein receptor knockout，LDLR-/-）小鼠53 只，體質量（22±2）g，6 周齡，購自成都達碩實驗動物有限公司，動物合格證號SCXK（川）2020-034。動物飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學動物中心清潔級動物房，使用許可證編號SYXK（川）2019-049，溫度22～25 ℃，相對濕度50%～70%，12 h 明暗循環(huán)，自由飲水進食。喂養(yǎng)小鼠的基礎飼料及高脂飼料均購自江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司，合格證號SCXK（蘇）2020-0018。高脂飼料由78.85%基礎飼料、21%脂肪、0.15%膽固醇構成，所有飼料均經(jīng)60Coγ 射線輻照滅菌處理。動物實驗通過成都中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會審查（倫理編號2021DL-001）。

1.2 藥材

茱萸丸由黃連5 g、吳茱萸5 g 組成。黃連（批號190901）、吳茱萸（批號191001）由成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制劑室提供，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學鑒定教研室嚴鑄云教授分別鑒定為毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch.的干燥根莖、蕓香科植物吳茱萸Evodiarutaecarpa(Juss.) Benth.的干燥成熟果實，符合《中國藥典》2020 年版要求。

1.3 藥品與試劑

阿托伐他汀鈣片（批號H20051408）購自沈陽輝瑞制藥有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測定試劑盒（批號分別為A111-1-1、A110-1-1、A113-1-1、A112-1-1）購自南京建成生物科技有限公司；蘇木素-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色、油紅染液、RIPA 裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、4%多聚甲醛（批號分別為G1004、G1016、G2002、BL521A、G1101-500ML）購自武漢塞維爾生物科技有限公司；Masson 染色液（批號20200831）購自北京索萊寶科技有限公司；IL-18、IL-1β ELISA 試劑盒（批號分別為MM-0182M1、MM-01563M1）購自江蘇酶免實業(yè)有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、ROS 試劑盒（批號分別為1013M、2086R）購自上海碧云天生物技術有限公司；甲酸（批號20191010）購自美國ROE 公司；乙腈（批號WXD0233V）購自德國默克公司；甲酸胺（批號20190815）購自美國Sigma 公司；戊巴比妥鈉（批號11715）購自美國Merck 公司；ROS 檢測試劑盒（批號C1300）購自北京普利萊基因公司；TXNIP 抗體、NLRP3 抗體、DAPI、羊抗兔IgG 二抗（批號分別為ab188865、ab65596、ab66217、ab182981）購自英國Abcam 公司；總RNA 提取試劑盒（批號R220901）購自成都福際生物技術有限公司；iScriptTMcDNA 合成試劑盒、 Sso AdvancedTMUniversal SYBR?Green Supermix（批號分別為221010-A4、221010-A5）購自成都蓉為基因生物科技有限公司。

1.4 儀器

Cool Safe110-4 型真空凍干機（丹麥Scanlaf 公司）；BS-220 型全自動生化分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子有限公司）；1260 Infinity II 型高效液相色譜儀、6470 Triple Quadruple MS/MS 型質譜儀（美國Agilent 公司）；EG1150C 型包埋機、SM2000R 型石蠟滑動式切片機（德國Leica 公司）；VO-53 型真空干燥機（上海泰坦科技股份有限公司）；Revos 型脫水機（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；Filter Max F3 型酶標儀（美國Molecular Devices 公司）；NovoCyte 2060R 型NovoCyteTM流式細胞儀（杭州艾森生物有限公司)；Allegra X-15R 型醫(yī)用離心機（美國Beckman Coulter 公司）；Miseq 型測序儀（美國Illumina 公司）；ECLIPSE C1 型正置熒光顯微鏡（日本尼康公司）；KZ-IH-F 型高速低溫組織研磨儀（武漢塞維爾生物科技有限公司）；HT-300 型垂直電泳槽及組件（合肥雨澤生物科技有限公司）；ChemiScope 6100 型化學發(fā)光成像系統(tǒng)、ChemiScope Analysis 型圖像采集軟件（上海勤翔科學儀器有限公司）。

2 方法

2.1 茱萸丸的制備

稱取50 g 黃連、50 g 吳茱萸后，加入10 倍量水浸泡1 h，然后煎煮40 min 濾過，濾渣加入9 倍量水繼續(xù)煎煮30 min，合并2 次濾液后放入真空凍干機中制作凍干粉。最終100 g 茱萸丸獲得17.21 g凍干粉，即每克凍干粉中含5.81 g 藥材，保存于4 ℃?zhèn)溆?。采用高效液相色譜儀對茱萸丸中小檗堿、黃連堿、吳茱萸堿和吳茱萸次堿4 種主要生物堿進行檢測[12]，結果顯示，茱萸丸中含有36.8 mg/g 小檗堿、14.9 mg/g 黃連堿、0.78 mg/g 吳茱萸堿和0.33 mg/g 吳茱萸次堿。

2.2 造模、分組與給藥

經(jīng)過適應性喂養(yǎng)后，13 只C57BL/6J 小鼠作為對照組，繼續(xù)以基礎飼料喂養(yǎng)。53 只同品系的LDLR-/-小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)造模，每天2 次投喂（8: 00、16: 00 時各1 次），自由飲水及活動12周，構建AS 模型[13]。造模周期12 周，然后在對照組及造模組中各隨機選取3 只小鼠進行主動脈根部油紅染色判斷造型是否成功，主動脈斑塊形成可判定為AS 造模成功[14]。造模成功后，將50 只LDLR-/-小鼠按體質量隨機分為模型組及茱萸丸低、中、高劑量（130.54、261.08、522.16 mg/kg，分別相當于臨床劑量的0.5、1、2 倍[15]）組和阿托伐他?。?0.40 mg/kg）組，每組10 只。各給藥組ig 相應藥物，對照組和模型組ig 等體積無菌蒸餾水，1 次/d，連續(xù)給藥12 周。

2.3 血脂水平測定

末次給藥后12 h 禁食不禁水，摘眼球取血。室溫靜置2 h，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，收集上層血清。按照試劑盒說明書操作，采用全自動生化分析儀檢測各組小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C 水平。

2.4 主動脈HE、Masson 染色

將采集完血清標本的小鼠脫脊椎處死，剪開胸骨，暴露心臟，1 mL 注射器穿刺左心室注入；磷酸鹽緩沖液沖洗主動脈后完整分離，在冰上剪段，用4%多聚甲醛固定、最佳切削溫度（optimum cutting temperature，OCT）包埋劑處理，制成厚度為5 μm的石蠟切片，進行常規(guī)HE、Masson 染色，光學顯微鏡下觀察主動脈病理變化并拍照保存。

HE 染色陽性面積比＝斑塊面積/管腔面積

Masson 染色陽性面積＝藍色區(qū)域面積/橫截面總面積

2.5 主動脈油紅O 染色

將冰凍切片晾干，置于異丙醇浸泡5 min，油紅O 染液孵育10 min，分化后用蘇木素復染2 min，沖洗，少許甘油封片，顯微鏡下觀察和攝片，采用Image pro plus 6.0 軟件分析。

油紅染色陽性區(qū)域面積比＝紅色區(qū)域面積/橫截面總面積

2.6 ELISA 檢測血清中IL-18、IL-1β、ROS 水平和SOD 活性

按照試劑盒說明書檢測血清中IL-18、IL-1β、ROS 水平和SOD 活性。

2.7 UHPLC-MS/MS 檢測血漿三甲胺（trimethylamine，TMA）、TMAO 的含量

用含有乙二胺四乙酸（ ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）的采集管采集血液后，立即輕輕顛倒混勻，4 ℃、3 000 r/min 離心10 min，取上清液即血漿。精確吸取50 μL 血漿，加到150 μL甲醇中，渦旋1 min，13 000 r/min 離心10 min（離心半徑3 cm），取上清液進樣，用于UHPLC-MS/MS分析。通過X Bridge BEH Amide 色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.5 μm）色譜柱對目標化合物進行色譜分離，流動相A 為10 mmol/L 甲酸銨（pH 3.5），流動相B 為乙腈（pH 3.5）。氣體溫度350 ℃；氣體體積流量9 L/min；霧化器壓力2.758×105kPa；鞘氣加熱器300 ℃；鞘氣體積流量11 L/min；毛細管3 500 V。

2.8 腸道菌群高通量測序

末次給藥后，收集小鼠新鮮糞便。戴一次性無菌手套，左手抓住小鼠，右手輕輕柔按揉小鼠腹部，刺激排便。當有糞便排出時，用一次性鑷子夾取糞便2～3 粒，置于滅菌凍存管，液氮保存。每取1 只小鼠糞便換1 次鑷子，以防交叉感染，影響腸道菌群結果，且夾取糞便放入凍存管中務必迅速，以防空氣中暴露太久，導致感染。小鼠糞便樣本送至武漢邁維生物科技有限公司進行16S rRNA 測序，按試劑盒說明進行操作。

2.8.1 DNA 提取和質檢 使用MoBio PowerSoil DNA Isolation 試劑盒提取基因組DNA，使用納米滴檢驗DNA 質量和濃度。

2.8.2 目標片段PCR 擴增 使用引物序列為338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和 806R（ 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3' ） 對 16S rRNA 基因V3～V4 可變區(qū)進行PCR 擴增。

2.8.3 PCR 產物電泳檢測和純化 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增目的條帶大小，使用磁珠法進行自動化純化。

2.8.4 Illumina Miseq 測序 將PCR 產物回收純化，利用NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq 試劑盒進行建庫，使用Illumina Miseq PE300 平臺進行測序。

2.8.5 操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）分析 使用UPARSE 軟件根據(jù)97%的相似度對序列進行OTU 聚類并剔除嵌合體，利用RDP classifie 對每條序列進行物種分類注釋。使用Mothur 對α 多樣性進行分析，結果以Chao1 指數(shù)、Ace 指數(shù)、observed species 指數(shù)表示。

2.9 熒光探針法檢測主動脈組織ROS 水平

取各組主動脈組織，按照ROS 試劑盒說明書操作，激發(fā)和發(fā)射波長分別為490、525 nm，測定ROS吸光度（A）值，根據(jù)樣品和對照相對熒光單位（relative fluorescence unit，RFU）的差值計算ROS含量。

2.10 免疫熒光雙標檢測主動脈組織TXNIP 和NLRP3 蛋白表達

石蠟組織切片經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復、標記及封閉，滴加TXNIP 抗體（1∶50），4 ℃孵育過夜；磷酸緩沖液浸洗3 次，滴加熒光二抗（1∶100，滴加CY3-TSA），濕盒中37 ℃孵育1 h，PBST 浸洗3 次，血清室溫封閉30 min，吸掉封閉液，滴加稀釋的NLRP3 抗體（1∶50），4 ℃孵育避光過夜，PBST 浸洗3 次，滴加熒光二抗（1∶100，F(xiàn)ITCTSA），濕盒中37 ℃孵育1 h，PBST 浸洗3 次，滴加DAPI 避光孵育5 min 復染細胞核，PBST 浸洗4次去處多余的DAPI，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄，采用Image pro plus 6.0 軟件進行分析。

2.11 Western blotting 檢測主動脈組織TXNIP 和NLRP3 蛋白表達

每組取3 只小鼠主動脈組織進行蛋白提取，使用BCA 測定各組總蛋白濃度，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF 膜，分別加入TXNIP（1∶1 000）、NLRP3（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000）一抗，4 ℃搖床孵育過夜；加入二抗（1∶10 000），4 ℃搖床孵育2 h，顯影曝光，使用ImageJ 1.44 軟件對條帶進行分析。

2.12 qRT-PCR 檢測主動脈組織TRX、TXNIP、ASC、NLRP3 和Caspase-1 mRNA 表達

采用總RNA 提取試劑盒提取主動脈組織中總RNA，采用超微量紫外分光光度計測定RNA 濃度。采用iScript? cDNA 合成試劑盒將RNA 逆轉錄為模板cDNA。采用Sso AdvancedTMUniversal SYBR?Green Supermix 試劑盒進行qPCR 反應。反應條件設置為95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40 個循環(huán)，收集熒光信號，結果采用2-ΔΔCt計算mRNA 的相對表達量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.13 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 24.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，先進行正態(tài)分析和方差齊性檢驗，若二者均符合，組間比較采用單因素方差（Oneway ANOVA）分析；若不符合正態(tài)分布或方差齊性檢驗，采用非參數(shù)秩和檢驗，相關性采用Pearson 相關性分析。

3 結果

3.1 茱萸丸對AS 小鼠血清TG、TC、LDL-C 和HDL-C 水平的影響

如表2 所示，與對照組比較，模型組小鼠血清TG、TC、LDL-C 水平顯著升高（P＜0.01），HDLC 水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠血清TG、TC、LDL-C 水平顯著降低（P＜0.05、0.01），HDL-C 水平顯著升高（P＜0.01）。

教師設情境置2：假如在等待“120”過程中，你發(fā)現(xiàn)暈倒的女生又被刮傷出血了，該怎么辦？閱讀教材76頁第二段。如何根據(jù)出血狀況，判斷出血類型？請閱讀教材86頁。

表2 茱萸丸對AS 小鼠血清TG、TC、LDL-C 和HDL-C 水平的影響 (±s, n = 10)Table 2 Effect of Zhuyu Pills on TG, TC, LDL-C and HDL-C levels in serum of AS mice (±s, n = 10)

表2 茱萸丸對AS 小鼠血清TG、TC、LDL-C 和HDL-C 水平的影響 (±s, n = 10)Table 2 Effect of Zhuyu Pills on TG, TC, LDL-C and HDL-C levels in serum of AS mice (±s, n = 10)

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下表同。#P ＜ 0.05 ##P ＜ 0.01 ###P ＜ 0.001 vs control group; *P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 ***P ＜ 0.001 vs model group, same as below tables.

組別 劑量/(mg·kg-1) TG/(mmol·L-1) TC/(mmol·L-1) LDL-C/(mmol·L-1) HDL-C/(mmol·L-1)對照 — 1.32±0.11 3.20±0.35 2.21±0.08 1.77±0.06模型 — 5.52±0.15## 9.31±0.24## 8.86±0.30## 0.14±0.03##茱萸丸 75.85 5.28±0.18* 8.65±0.15** 8.53±0.27* 0.25±0.09**151.69 4.46±0.25** 6.46±0.19** 6.42±0.34** 0.45±0.05**303.38 3.54±0.19** 5.55±0.22** 5.44±0.15** 0.72±0.06**阿托伐他汀 10.40 4.77±0.11** 7.19±0.26** 7.06±0.23** 0.38±0.07**

3.2 茱萸丸對AS 小鼠主動脈病理變化的影響

如圖1 所示，對照組小鼠主動脈可見血管壁各個層次排列整齊，結構清晰，少見皺褶及空泡，幾乎無紅染及膠原著色。與對照組比較，模型組主動脈內膜大面積增厚，脂質斑塊增多沉積，結構模糊化并形成明顯的泡沫細胞，大量褶皺及空泡，大片紅染形成，部分區(qū)域形成特征性AS 斑塊，斑塊有較大范圍的膠原蛋白沉積。與模型組比較，各給藥組主動脈斑塊及血管壁泡沫細胞均呈現(xiàn)不同程度的改善，膠原纖維增加減少，隨著茱萸丸劑量的增加，上述病變程度隨之減輕。

圖1 茱萸丸對AS 小鼠主動脈病理變化的影響Fig. 1 Effect of Zhuyu Pills on pathological changes of aorta in AS mice

3.3 茱萸丸對AS 小鼠血清中IL-1β、IL-18、ROS、水平和SOD 活性的影響

如表3 所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中IL-1β、IL-18、ROS 水平均顯著升高（P＜0.01），SOD 活性顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組IL-1β、IL-18、ROS 水平降低（P＜0.01），SOD 活性顯著升高（P＜0.05、0.01）。

表3 茱萸丸對AS 小鼠血清中IL-1β、IL-18、ROS 水平和SOD 活性的影響 (±s, n = 10)Table 3 Effect of Zhuyu Pills on IL-1β, IL-18, ROS levels and SOD activity in serum of AS mice (±s, n = 10)

表3 茱萸丸對AS 小鼠血清中IL-1β、IL-18、ROS 水平和SOD 活性的影響 (±s, n = 10)Table 3 Effect of Zhuyu Pills on IL-1β, IL-18, ROS levels and SOD activity in serum of AS mice (±s, n = 10)

組別 劑量/(mg·kg-1) IL-1β/(ng·L-1) IL-18/(ng·L-1) ROS/(U·mL-1) SOD/(U·mL-1)對照 — 13.88±1.45 5.26±1.55 49.69±6.05 66.83±7.21模型 — 56.34±4.27## 34.83±2.12## 99.06±9.64## 40.19±5.06##茱萸丸 75.85 38.28±2.79** 23.04±3.11** 72.38±6.23** 44.21±5.52*151.69 31.53±3.39** 18.35±2.48** 65.68±6.54** 52.43±4.10**303.38 25.03±3.02** 12.43±2.27** 60.42±5.47** 60.55±3.28**阿托伐他汀 10.40 35.26±1.93** 20.06±1.32** 67.17±4.48** 45.36±2.59**

3.4 茱萸丸對AS 小鼠血漿TMA、TMAO 水平的影響

如表4 所示，與對照組比較，模型組小鼠血漿TMA、TMAO 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組血漿TMA、TMAO 水平顯著降低（P＜0.01）。

表4 茱萸丸對AS 小鼠血漿TMA、TMAO 水平的影響(±s, n = 6)Table 4 Effect of Zhuyu Pills on plasma TMA and TMAO levels in AS mice (±s, n = 6)

表4 茱萸丸對AS 小鼠血漿TMA、TMAO 水平的影響(±s, n = 6)Table 4 Effect of Zhuyu Pills on plasma TMA and TMAO levels in AS mice (±s, n = 6)

組別 劑量/(mg·kg-1) TMA/(ng·mL-1) TMAO/(ng·mL-1)對照 — 421.63±16.03 225.35±5.51模型 — 583.04±21.56## 532.18±12.29##茱萸丸 75.85 492.17±10.23** 343.28±14.35**151.69 455.02±11.28** 315.16±12.45**303.38 433.26±13.11** 255.46±11.37**阿托伐他汀 10.40 469.23±18.08** 326.43±23.08**

3.5 各組小鼠腸道菌群比較

3.5.1 Alpha 多樣性分析 如表5 所示，與對照組比較，模型組Chao1、Ace 以及observed species 指數(shù)均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組Chao1、Ace 以及observed species 指數(shù)均顯著升高（P＜0.01）。

表5 各組小鼠腸道菌群Alpha 多樣性指數(shù)比較 (±s, n = 6)Table 5 Comparison of intestinal flora Alpha diversity index of mice in each group (±s, n = 6)

表5 各組小鼠腸道菌群Alpha 多樣性指數(shù)比較 (±s, n = 6)Table 5 Comparison of intestinal flora Alpha diversity index of mice in each group (±s, n = 6)

組別 劑量/(mg·kg-1) Chao1 指數(shù) Ace 指數(shù) observed species 指數(shù)對照 — 774.55±12.98 501.83±21.28 800.10±22.84模型 — 339.67±14.19## 333.17±22.69## 372.17±11.61##茱萸丸 75.85 432.50±16.21** 428.83±10.57** 490.00±17.81**151.69 559.50±12.05** 457.83±12.30** 627.33±18.06**303.38 673.17±11.44** 470.00±13.92** 742.83±12.49**阿托伐他汀 10.40 525.00±16.20** 432.50±18.89** 568.83±15.94**

3.5.2 門水平菌群豐度及差異 門水平上各組小鼠菌群優(yōu)勢種類差異不大，主要由厚壁菌門、擬桿菌門等構成。如表6 所示，與對照組比較，模型組擬桿菌門菌群豐度明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組擬桿菌門菌群豐度顯著上升（P＜0.05、0.01），茱萸丸中、高劑量組厚壁菌門菌群豐度顯著下降（P＜0.05）。

表6 各組小鼠腸道菌群門水平前5 位的物種平均相對豐度比較 (±s, n = 6)Table 6 Comparison of average relative abundance of top 5 species at level of intestinal microflora in each group(±s, n = 6)

表6 各組小鼠腸道菌群門水平前5 位的物種平均相對豐度比較 (±s, n = 6)Table 6 Comparison of average relative abundance of top 5 species at level of intestinal microflora in each group(±s, n = 6)

組別 劑量/(mg·kg-1) 相對豐度/%厚壁菌門 擬桿菌門 變形菌門 放線菌門 疣微菌門對照 — 73.99±4.46 9.59±0.44 2.39±0.25 1.43±0.11 2.63±0.06模型 — 83.10±6.78 6.70±0.19## 2.46±0.83 1.46±0.04 2.52±0.07茱萸丸 75.85 79.08±6.06 7.30±0.44* 2.55±0.73 1.59±0.07 2.60±0.11 151.69 70.81±9.66* 8.31±0.08** 2.57±0.21 1.45±0.12 2.64±0.05 303.38 68.51±2.55* 8.95±0.28** 2.57±0.96 1.56±0.21 2.55±0.04阿托伐他汀 10.40 73.76±7.87 7.53±0.17* 2.50±0.51 1.53±0.09 2.60±0.08

3.5.3 屬水平菌群豐度及差異 如表7 所示，與對照組比較，模型組糞桿菌屬、布勞特氏屬、乳桿菌屬菌群豐度顯著下降（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組布勞特氏屬、乳桿菌屬菌群豐度顯著升高（P＜0.01），茱萸丸中、高劑量組糞桿菌屬豐度顯著升高（P＜0.01）。

表7 各組小鼠腸道菌群屬水平前5 位的物種平均相對豐度比較 (±s, n = 6)Table 7 Comparison of average relative abundance of top 5 species in level of intestinal flora of mice in each group(±s, n = 6)

表7 各組小鼠腸道菌群屬水平前5 位的物種平均相對豐度比較 (±s, n = 6)Table 7 Comparison of average relative abundance of top 5 species in level of intestinal flora of mice in each group(±s, n = 6)

組別 劑量/(mg·kg-1) 相對豐度/%杜氏牙形石屬 圣埃里立支桿菌屬 糞桿菌屬 布勞特氏屬 乳桿菌屬對照 — 11.45±0.13 14.39±1.27 8.49±0.44 6.68±0.31 6.32±0.36模型 — 11.51±0.18 14.54±0.96 4.65±0.91## 2.81±0.54## 4.31±0.27##茱萸丸 75.85 11.22±0.21 14.37±0.47 5.64±1.03 5.55±0.34** 5.72±0.66**151.69 12.07±0.71 13.62±2.37 6.65±0.23** 5.99±0.65** 6.12±0.62**303.38 10.93±0.82 15.60±0.27 7.72±0.66** 6.36±0.50** 6.40±0.55**阿托伐他汀 10.40 11.24±0.20 14.45±0.13 5.74±0.17 5.54±0.23** 6.10±0.30**

3.6 各組小鼠腸道菌群與TMA、TMAO 的關聯(lián)分析結果

如表8 所示，布勞特氏屬、乳桿菌屬、糞桿菌屬與TMA、TMAO 呈負相關（P＜0.05）。

表8 小鼠腸道菌群與TMA、TMAO 的關聯(lián)分析結果Table 8 Analysis results of association between intestinal flora and TMA and TMAO in mice

3.7 茱萸丸對AS 小鼠主動脈ROS 水平的影響

表9 茱萸丸對AS 小鼠主動脈ROS 水平的影響 (±s, n = 6)Table 9 Effect of Zhuyu Pills on ROS level in aorta of AS mice (±s, n = 6)

表9 茱萸丸對AS 小鼠主動脈ROS 水平的影響 (±s, n = 6)Table 9 Effect of Zhuyu Pills on ROS level in aorta of AS mice (±s, n = 6)

組別 劑量/(mg·kg-1) ROS/(RFU·mg-1)對照 — 1 683.03±192.03模型 — 4 579.42±266.73##茱萸丸 75.85 4 322.37±189.45*151.69 3 145.01±191.68**303.38 2 846.36±173.31**阿托伐他汀 10.40 3 962.49±208.23**

3.8 茱萸丸對AS 小鼠主動脈組織TXNIP 和NLRP3 蛋白表達的影響

如圖2、表10 和圖3、表11 所示，與對照組比較，模型組小鼠主動脈組織TXNIP、NLRP3 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組TXNIP、NLRP3 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01）。

圖2 茱萸丸對AS 小鼠主動脈組織TXNIP、NLRP3 表達的影響Fig. 2 Effect of Zhuyu Pills on TXNIP and NLRP3 of aorta tissue in AS mice

圖3 各組小鼠主動脈組織中TXNIP、NLRP3 的蛋白表達Fig. 3 TXNIP and NLRP3 protein expressions in aortic tissue of mice in each group

表10 茱萸丸對AS 小鼠主動脈組織中TXNIP、NLRP3表達熒光面積的影響 (±s, n = 6)Table 10 Effect of Zhuyu Pills on TXNIP and NLRP3 fluorescence area on aortic tissue in AS mice (±s, n = 6)

表10 茱萸丸對AS 小鼠主動脈組織中TXNIP、NLRP3表達熒光面積的影響 (±s, n = 6)Table 10 Effect of Zhuyu Pills on TXNIP and NLRP3 fluorescence area on aortic tissue in AS mice (±s, n = 6)

組別 劑量/(mg·kg-1) TXNIP NLRP3對照 — 0.55±0.12 0.30±0.07模型 — 1.82±0.38## 1.64±0.12##茱萸丸 75.85 1.24±0.40** 1.08±0.20**151.69 0.87±0.25** 0.62±0.06**303.38 0.72±0.16** 0.53±0.12**阿托伐他汀 10.40 0.93±0.09** 0.71±0.08 **

表11 茱萸丸對AS 小鼠主動脈組織TXNIP、NLRP3 蛋白表達的影響 (±s, n = 3)Table 11 Effect of Zhuyu Pills on protein expressions of TXNIP and NLRP3 in aortic tissue of AS mice (±s, n = 3)

表11 茱萸丸對AS 小鼠主動脈組織TXNIP、NLRP3 蛋白表達的影響 (±s, n = 3)Table 11 Effect of Zhuyu Pills on protein expressions of TXNIP and NLRP3 in aortic tissue of AS mice (±s, n = 3)

組別 劑量/(mg·kg-1) TXNIP /GAPDH NLRP3/GAPDH對照 — 0.48±0.10 0.44±0.06模型 — 1.52±0.24## 1.31±0.16##茱萸丸 75.85 1.26±0.13** 1.12±0.08**151.69 0.94±0.18** 0.88±0.11**303.38 0.76±0.09** 0.75±0.13**阿托伐他汀 10.40 1.09±0.08** 1.04±0.05**

3.9 茱萸丸對AS 小鼠主動脈組織TRX、TXNIP、ASC、NLRP3 和Caspase-1 mRNA 的影響

如表12 所示，與對照組比較，模型組小鼠主動脈組織TRX、TXNIP、ASC、NLRP3、Caspase-1mRNA表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組TRX、TXNIP、ASC、NLRP3、Caspase-1mRNA表達水平明顯降低（P＜0.01）。

表12 茱萸丸對各組小鼠主動脈組織中TRX、TXNIP、ASC、NLRP3、Caspase-1 mRNA 表達水平的影響 (±s, n = 4)Table 12 Effects of Zhuyu Pills on mRNA levels of TRX, TXNIP, ASC, NLRP3 and Caspase-1 on aortic tissue in each group of mice (±s, n = 4)

表12 茱萸丸對各組小鼠主動脈組織中TRX、TXNIP、ASC、NLRP3、Caspase-1 mRNA 表達水平的影響 (±s, n = 4)Table 12 Effects of Zhuyu Pills on mRNA levels of TRX, TXNIP, ASC, NLRP3 and Caspase-1 on aortic tissue in each group of mice (±s, n = 4)

組別 劑量/(mg·kg-1) mRNA 相對表達量TRX TXNIP ASC NLRP3 Caspase-1對照 — 0.42±0.10 0.31±0.06 0.28±0.08 0.26±0.05 0.35±0.02模型 — 1.63±0.05## 1.12±0.15## 0.92±0.02## 1.16±0.13## 1.03±0.07##茱萸丸 75.85 1.24±0.14** 0.90±0.20** 0.66±0.07** 0.98±0.07** 0.89±0.04**151.69 0.96±0.07** 0.63±0.10** 0.47±0.06** 0.71±0.05** 0.67±0.05**303.38 0.74±0.06** 0.55±0.11** 0.45±0.06** 0.59±0.10** 0.56±0.05**阿托伐他汀 10.40 1.16±0.12** 0.85±0.28** 0.59±0.03** 0.87±0.06** 0.81±0.10**

4 討論

AS 病在血脈，根在臟腑，脾失健運，水津不布，精化為濁，導致膏脂運化輸布障礙，濕濁內生，輸于血脈，成為“濁脂”，壅積脈道，浸淫脈絡，著而不去，脈絡與痰瘀相搏，結聚成塊，正如《證治匯補》所言“脾虛不運清濁，停滯津液而為痰生”[16]。國醫(yī)大師阮士怡[17]將AS 斑塊與積病概念結合，創(chuàng)新性提出“脈中積”概念，該病名不僅體現(xiàn)出沉積于血脈的發(fā)病位置，還概括了“脾胃壅遏，濁伏于脈”的病理機制，兼具中醫(yī)特色。脾胃為水谷精微轉運之樞紐，氣虛于內，周流不暢，則陳氣、血濁蓄積，濁邪沉積于脈壁，形成有形、固定不移之斑塊，發(fā)為AS。治脾之劑以升運為要，調胃之力以降泄為先，脾胃并理，自當兩法并取，故選擇辛味藥能開能通，苦味藥可降可泄，辛苦相合，升降同施，藉以助脾散精，導濁下行，清除脈壁濁邪，從而脈道通暢，無斑塊閉阻之礙。茱萸丸由黃連、吳茱萸組成，二者一辛一苦、一升一降，是辛開苦降的代表組合。該治法將辛熱與苦寒2 種藥性相反的藥物置于一方之中，彼此相互為用又互相佐制，是一種具有雙向調節(jié)功能的典型中醫(yī)特色的用藥方法[18]?！端貑枴ぶ琳嬉笳摗分杏涊d：“陽明之復，治以辛溫，佐以苦甘，以苦泄之，以苦下之”，揭示了辛與苦2 類不同性質的藥物具有協(xié)同作用，可以合理配伍。清代葉天士將辛開苦降法作為一個治則提出，其在《臨證指南醫(yī)案》中提出“辛以開之，苦以降之”的論點，認為辛苦合用則“苦能驅熱除濕，辛能開氣宣濁”[19]。總之，茱萸丸通過辛開苦降治法健中助運，調暢氣機，導濁下行，充分發(fā)揮“氣行-津行-脂行”之效，以此防治AS。

LDLR-/-小鼠是AS 研究的經(jīng)典動物模型，可在自然膳食的情況下形成嚴重的高脂血癥，并自發(fā)形成纖維斑塊和復合斑塊，動脈受損嚴重程度方面有類人的特征，且雄性高于雌性，故本實驗選用雄性LDLR-/-小鼠[20]。研究表明，LDLR-/-小鼠以高脂飼料飲食飼養(yǎng)，12 周左右即可于小鼠主動脈弓部發(fā)現(xiàn)廣泛的AS 斑塊[21]。阿托伐他汀鈣是一種強效的降膽固醇藥物，具有抑制炎癥細胞和炎癥介質釋放、抑制血栓形成、保持斑塊穩(wěn)定等作用，因此選用阿托伐他汀作為陽性對照藥物[22]。血脂水平與AS 病變程度密切相關，因脂質異常會造成血液黏度上升，其可附著于血小板與紅細胞表面，增加細胞間黏附性，而紅細胞聚集性增加，則導致血流緩慢，引起主動脈根部脂質積聚，炎性細胞匯聚，從而誘發(fā)炎癥的發(fā)生，加速AS的形成。本研究結果顯示，不同劑量的茱萸丸均能不同程度地降低AS 模型小鼠血清中TC、TG、LDL-C含量，升高HDL-C 含量，并有效減少脂質堆積。本研究組織病理學結果也佐證了此結論，茱萸丸干預后，可有效減輕模型小鼠主動脈的粥樣斑塊沉積，并增加斑塊的結構韌性，降低易損性，增加膠原防止彈性纖維進一步被破壞，保護中膜結構，且與藥物劑量成正相關關系，以高劑量茱萸丸的總體效果最好。脂質代謝功能的下降可誘導機體氧化和抗氧化能力失衡，SOD 活性下降，ROS 含量增高，導致血管內皮下間隙的脂質和脂蛋白被氧化形成低密度脂蛋白，并影響血管壁正常結構及功能而加快AS 發(fā)展[23]。本研究結果顯示，茱萸丸干預后小鼠血清ROS 水平顯著降低，SOD 活性顯著升高，提示茱萸丸可減輕氧化應激損傷而抑制LDLR-/-小鼠AS 進展。

目前TMA/TMAO 的代謝途徑受到廣泛關注，被認為是AS 的潛在促進劑。TMAO 是膽堿、卵磷脂和肉堿的代謝產物，可由TMA 轉變而來[24]。腸道中的膳食膽堿和左旋肉堿在多種酶的作用下產生TMA，后者在腸道上皮細胞被吸收并輸送到肝臟，在肝臟中被黃素單加氧酶3 進一步氧化，形成TMAO，TMAO 通過誘發(fā)炎癥[25]、促進泡沫細胞形成[26]及調控膽固醇的轉運和代謝[27]進而促進AS 的發(fā)生發(fā)展。Meta 分析結果亦顯示，循環(huán)TMAO 水平越高，心血管事件的發(fā)生率越高[28]。因此，抑制腸道菌群代謝產物TMA，進而減少TMA 向TMAO 的轉化，可能是防治AS 的有效途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，茱萸丸干預能夠顯著降低LDLR-/-小鼠血漿TMA 和TMAO 水平，從而發(fā)揮抗AS 的作用。經(jīng)16S rRNA技術分析腸道菌群的結構、多樣性變化發(fā)現(xiàn)，Alpha多樣性指數(shù)變化提示腸道菌群多樣性可因AS 發(fā)病而降低，因茱萸丸干預而提高。AS 常伴隨厚壁菌門豐度降低以及擬桿菌門豐度上升，并且兩者比值F/B的高低，多用于腸道菌群失調程度的評估[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，門水平上厚壁菌門、擬桿菌門為優(yōu)勢菌群。模型組厚壁菌門相對豐度增加，擬桿菌門相對豐度減少，F(xiàn)/B 值呈現(xiàn)升高趨勢，這表明AS 小鼠腸道菌群門水平物種比例失衡，菌群紊亂態(tài)勢明顯，與文獻所載相似[30]。而茱萸丸干預后小鼠腸道厚壁菌門相對豐度減少，擬桿菌門相對豐度增加，F(xiàn)/B 值出現(xiàn)回調趨勢，腸道紊亂被糾正。屬水平上布勞特氏屬、糞桿菌屬、乳桿菌屬菌群豐度上升。其中布勞特氏菌屬的發(fā)酵產物，如乙酸、丙酸和丁酸等具有優(yōu)良的抗炎、調血脂活性，對AS 具有良好的預防和治療作用。研究表明，糞桿菌屬在AS 患者糞便中富集，提示糞桿菌屬可能為AS 的致病菌之一[31]。乳桿菌屬為腸道內有益菌群，其可激活調節(jié)性T 細胞，抑制輔助性T細胞，影響巨噬細胞亞群比例，進而調節(jié)免疫，抑制AS 相關炎癥[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，布勞特氏菌屬、糞桿菌屬、乳桿菌屬與TMA、TMAO 呈顯著負相關。因此，茱萸丸可能通過提高布勞特氏菌屬、糞桿菌屬以及乳桿菌屬相對豐度，抑制TMA 生成，進而減少TMAO 生成發(fā)揮抗AS 的作用。

細胞焦亡是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型的促炎細胞程序性死亡方式，AS各階段均存在血管壁細胞焦亡，其關鍵步驟是炎癥小體的活化[33]。NLRP3 炎癥小體是一種與慢性低度炎癥反應相關的大分子復合物，主要由NLRP3、ASC 和Caspase-1 組成[34]。其中NLRP3 作為一個蛋白復合體的支架，ASC 是NLRP3和Caspase-1 之間的連接體，并參與Caspase-1 的活化[35]。NLRP3 炎癥小體作為炎癥和氧化應激通路的上游調控因子，是炎癥-免疫的橋梁，參與了機體眾多炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程[36]。正常情況下，NLRP3 處于活性抑制狀態(tài)，當機體受到微生物產物、內源性分子等刺激后，通過ACS 銜接Caspase-1 前體被激活，并介導NLRP3 激活Caspase-1。Caspase-1 作為炎癥的主要介導者，其被激活后募集、激活其他免疫細胞，切割pro-IL-18、pro-IL-1β 等前體，使前體轉化為活性形式的促炎因子IL-1β、IL-18 等，激活下游炎性通路，產生炎癥級聯(lián)反應。因此，抑制NLRP3 炎性小體相關通路，能夠抑制下游炎性通路的級聯(lián)放大，從而改善相關炎癥性疾病的進展及預后。IL-18、IL-1β 均是NLRP3 炎性小體活化后產生的主要促炎分子，在NLRP3 炎性小體通路被激活后表達均增加。本實驗中模型組較對照組NLRP3、ASC、Caspase-1 的蛋白及mRNA 的表達量顯著上升，通路中促炎因子IL-18、IL-1β 水平顯著增加，說明NLRP3 炎癥小體處于激活狀態(tài)。茱萸丸使NLRP3、ASC、Caspase-1 的蛋白及mRNA 表達顯著下降，促炎因子IL-18、IL-1β 水平明顯下降，說明NLRP3 炎癥小體受到抑制。TXNIP 是氧化應激與NLRP3 炎癥小體之間的橋梁，作為激活NLRP3 炎癥小體的物質不可或缺[35]。在ROS 的作用下，TXNIP從細胞核中釋放出來，并與胞質中的TRX1 和線粒體中的TRX2 結合，導致ROS 水平升高。增加ROS可以氧化TRX1，而氧化形式的TRX 不能與TXNIP結合，使TXNIP 成游離狀態(tài)[36]。游離的TXNIP 能直接與NLRP3 結合，從而激活NLRP3 炎癥小體。因此，TXNIP 可以直接結合NLRP3 或通過產生ROS間接激活NLRP3 炎癥小體。本研究結果顯示，茱萸丸能有效降低ROS 水平以及TRX、TXNIP、NLRP3、ASC、Caspase-1 的蛋白和mRNA 表達，提示茱萸丸在改善TMAO 激活的ROS/TXNIP/NLRP3 通路及下游的炎癥方面均有一定的效果。

綜上，茱萸丸可能通過調節(jié)腸道菌群中有益菌和有害菌的相對豐度，糾正菌群紊亂情況，減少TMAO 合成，抑制ROS/TXNIP/NLRP3 信號通路，減輕下游炎癥反應，發(fā)揮抗AS 作用（圖4）。鑒于保護血管內皮在延緩AS 發(fā)展中的重要作用，有必要進一步開展干擾因素較少的體外研究，以進一步說明茱萸丸對TMAO 刺激下血管內皮的保護作用及其機制。

圖4 TMAO 調控ROS/TXNIP/NLRP3 信號通路機制Fig. 4 Mechanism of TMAO on regulating ROS/TXNIP/NLRP3 signaling pathway

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突