牛成琳，殷洪梅, ，宋明明 ，周 茆 ，丁 涵，徐殿紅，陳 婭 ，王振中, ，肖 偉,

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023

2. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001

3. 中藥制藥過程控制與智能制造技術(shù)全國重點實驗室，江蘇 連云港 222001

經(jīng)典名方一貫煎收錄于《古代經(jīng)典名方關(guān)鍵信息表（7 首方劑）》[1]，出自《續(xù)名醫(yī)類案》（清·魏之琇）[2]，方由生地黃、當(dāng)歸、北沙參、麥冬、枸杞子、川楝子6 味中藥組成，有滋陰疏肝之效，臨床上多用于治療肝病、胃病、慢性便秘、婦科疾病及抑郁癥等[3-6]。為了更好地應(yīng)用于臨床，將經(jīng)典方劑轉(zhuǎn)換為便捷、使用依從性強的劑型，從而解決湯劑帶來的弊端。在國家發(fā)布諸多經(jīng)方相關(guān)的鼓勵性政策大環(huán)境下，開展經(jīng)方一貫煎制劑的工藝研究，對于確?，F(xiàn)代化制劑在臨床上使用安全、有效具有重要意義。

基于質(zhì)量源于設(shè)計原則，在工業(yè)化生產(chǎn)中對關(guān)鍵工藝參數(shù)（critical process parameters，CPPs）進行逐步優(yōu)化，以基準樣品為切入點，達到經(jīng)典名方復(fù)方制劑關(guān)鍵質(zhì)量屬性（critical quality attributes，CQAs）與其基本一致[7-8]。為確保經(jīng)方制劑質(zhì)量，需對藥材、飲片、基準樣品及制劑等多個環(huán)節(jié)實行全過程質(zhì)量監(jiān)控，從物理、化學(xué)等多方面綜合考慮，把控經(jīng)方研究過程中的CQAs，加強專屬性鑒別和多成分、整體質(zhì)量的控制[9]，根據(jù)一貫煎化學(xué)成分及臨床應(yīng)用研究，結(jié)合各藥材藥典質(zhì)控成分，選取地黃苷D、毛蕊花糖苷、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、甜菜堿、對香豆酸為含量測定的指標(biāo)成分，本實驗實行多個質(zhì)量評價指標(biāo)，從定性和定量2 個維度綜合把控提取工藝。考慮到工業(yè)化生產(chǎn)的可行性，生產(chǎn)設(shè)備與工藝條件的適配度，基于經(jīng)典名方制劑與物質(zhì)基準的質(zhì)量控制指標(biāo)應(yīng)基本一致原則，采用基準樣品關(guān)聯(lián)度評價樣品與基準樣品的質(zhì)量一致性。根據(jù)經(jīng)方的君臣佐使、用藥量等多方面綜合確定評價指標(biāo)的主觀權(quán)重系數(shù)，將1～9 標(biāo)度法與e0/4～e8/4標(biāo)度法相結(jié)合，綜合考量2 種標(biāo)度法的優(yōu)缺點，增強權(quán)重值的信度，熵權(quán)法確定評價指標(biāo)的客觀權(quán)重系數(shù)[10]。

改進主觀評價層次分析法（analytic hierarchy process，AHP）-熵權(quán)法確定組合權(quán)重，構(gòu)建以組合權(quán)重評估，將定性指標(biāo)與定量指標(biāo)相結(jié)合的可靠提取工藝優(yōu)選體系，結(jié)合Box-Behnken 設(shè)計-響應(yīng)面法進行模型預(yù)測[11]，以期得到合理、穩(wěn)定、可行的最優(yōu)提取工藝，并為后續(xù)制劑制備和質(zhì)量控制研究提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

全自動分體式多功能煎藥壺（多用煲），潮州市潮安區(qū)金石鎮(zhèn)中雄家用電器廠；JY20002 型電子分析天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；Mettler Toledo XP6 型百萬分之一電子分析天平、Mettler Toledo AL204 型萬分之一電子分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；ACS-D 型三峰牌電子秤，上海乾峰電子儀器有限公司；HWS26 型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DZTW 型電子調(diào)溫電熱套，上海本亭儀器有限公司；KB-500DB 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Agilent 1200 型高效液相色譜儀，美國Agilent 公司；Milli-Q 型超純水儀，美國密理博公司。

1.2 試藥

生地黃飲片，批號YP220815，產(chǎn)地河南，購自大連大仁堂藥業(yè)有限公司；當(dāng)歸飲片（批號YP220408，產(chǎn)地甘肅甘南藏族自治州卓尼縣）、川楝子（批號Y2204016，產(chǎn)地四川省成都市麗春鎮(zhèn)）、北沙參（批號Y220423，產(chǎn)地內(nèi)蒙古良西）、枸杞子（批號Y2204005，產(chǎn)地甘肅靖遠縣），均購自江蘇三和興中藥研究有限公司；麥冬，批號Y220403，產(chǎn)地四川省三臺縣，購自河北荷花池藥業(yè)有限公司。

對照品地黃苷D（批號112063-202103，質(zhì)量分數(shù)94.2%）、阿魏酸（批號110773-201915，質(zhì)量分數(shù)99.4%）、甜菜堿（批號110894-202105，質(zhì)量分數(shù)98.5%），對香豆酸（批號112037-202102，質(zhì)量分數(shù)99.7%）、毛蕊花糖苷（批號111530-201914，質(zhì)量分數(shù)95.2%），中國食品藥品檢定研究院；對照品洋川芎內(nèi)酯I（批號13176，質(zhì)量分數(shù)98%），上海詩丹德生物技術(shù)有限公司。乙腈、甲醇，色譜級，北京邁瑞達科技有限公司；超純水，自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 一貫煎提取液的制備

稱取生地黃、枸杞子各67.14 g，北沙參、麥冬、當(dāng)歸各33.6 g，川楝子44.76 g，共279.84 g，置于5 L 圓底燒瓶中，加入一定倍量純化水浸泡30 min，加熱回流提取，以200 目濾布立即濾過，即得。

參照課題組前期一貫煎物質(zhì)基準制備工藝研究，根據(jù)醫(yī)療機構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范將全方至于煎藥壺用水煎煮2 次即得基準樣品[12]。

2.2 地黃苷D 含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 取地黃苷D 對照品適量，精密稱定，用25%甲醇充分溶解，配成質(zhì)量濃度為491.72 μg/mL 的地黃苷D 對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 移取一貫煎提取液于2 mL 離心管內(nèi)，12 000 r/min 離心5 min，取上清液過0.45 μm 微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.2.3 色譜條件[13]色譜柱為Waters HSS T3 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液（5∶95）；體積流量1 mL/min；檢測波長為203 nm；柱溫30 ℃；進樣體積10 μL；色譜圖見圖1。

圖1 地黃苷D 對照品 (A) 和一貫煎基準樣品 (B) 的HPLC 圖Fig. 1 HPLC of rehmannioside D reference substances (A)and Yiguanjian benchmark samples (B)

2.2.4 線性關(guān)系考察 取“2.2.1”項下地黃苷D 對照品溶液逐級稀釋，按“2.2.3”項下色譜條件測定不同質(zhì)量濃度下地黃苷D 的色譜峰峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進行線性回歸，得回歸方程：地黃苷DY＝12.161 1X－3.570 1，R2＝1.000 0，線性范圍7.38～73.76 μg/mL。

2.2.5 精密度考察 按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，測定地黃苷D 的峰面積，計算其峰面積的RSD 值為0.99%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性考察 取供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件分別在制備后0、2、4、6、8、12、24 h進樣測定，測定地黃苷D 的峰面積，計算RSD 值為1.31%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗 精密稱定6 份樣品，按照“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件進行測定，計算地黃苷D 的含量RSD 值為0.75%，表明試驗方法重復(fù)性較好。

2.2.8 加樣回收率考察 取已知含量的樣品精密稱定，置具塞錐形瓶中，平行9 份，每3 份1 組，分別精密加入與樣品中相應(yīng)成分含量相等的對照品儲備液1、2、3 mL，按“2.2.2”項方法操作得到加標(biāo)溶液，按“2.2.3”項下色譜條件測定，計算地黃苷D 的平均加樣回收率為103.90%，RSD 值為2.52%，表明該方法準確度良好。

2.3 甜菜堿含量測定

2.3.1 對照品溶液的制備 取甜菜堿對照品適量，精密稱定，加甲醇充分溶解，配成質(zhì)量濃度為504.8 μg/mL 的甜菜堿對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 按照《中國藥典》2020年版枸杞子項下“供試品溶液制備”方法，取一貫煎提取液約3 g，精密稱定，置10 mL 量瓶中，加入甲醇適量，超聲處理30 min，放冷，用甲醇定容至刻度，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液2 mL，置堿性氧化鋁固相萃取柱（2 g）上，用乙醇60 mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，離心，取上清液，即得供試品溶液。

2.3.3 色譜條件 色譜柱為Waters X bridge BEH Amide 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水（85∶15）；體積流量1 mL/min；檢測波長195 nm；柱溫30 ℃；進樣體積10 μL。色譜圖見圖2。

圖2 甜菜堿對照品 (A) 和一貫煎基準樣品 (B) 的HPLC 圖Fig. 2 HPLC of betaine reference substances (A) and Yiguanjian benchmark samples (B)

2.3.4 線性關(guān)系考察 取“2.3.1”項下對照品溶液逐級稀釋，按“2.3.3”項下色譜條件分別測定不同質(zhì)量濃度下甜菜堿的色譜峰峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進行線性回歸，得回歸方程：甜菜堿Y＝4.536X＋0.802 8，R2＝0.999 9，線性范圍10.10～201.90 μg/mL。

2.3.5 精密度考察 按照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，測定甜菜堿的峰面積，計算其峰面積的RSD 值為0.94%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性考察 取供試品溶液，按“2.3.3”項下色譜條件分別在制備后0、2、4、6、8、12、24 h進樣測定，測定甜菜堿的峰面積，計算其RSD 值為0.74%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗 精密稱定6 份樣品，按照“2.3.2”項下方法分別平行制備6 份供試品溶液，按“2.3.3”項下色譜條件進行測定，計算甜菜堿質(zhì)量分數(shù)的RSD 值為1.58%，表明試驗方法重復(fù)性較好。

2.3.8 加樣回收率考察 取已知含量的樣品精密稱定，置具塞錐形瓶中，平行9 份，每3 份1 組，分別精密加入與樣品中相應(yīng)成分含量相等的對照品儲備液1、2、3 mL，按“2.3.2”項下方法操作得到加標(biāo)溶液，按“2.3.3”項下色譜條件測定，計算甜菜堿的平均加樣回收率為97.07%，RSD 值為1.71%，表明該方法準確度良好。

2.4 多成分含量測定

2.4.1 對照品溶液的制備 取對香豆酸、阿魏酸、毛蕊花糖苷、洋川芎內(nèi)酯I 對照品適量，精密稱定，用70%甲醇充分溶解，分別配成質(zhì)量濃度分別為對香豆酸66.10 μg/mL、阿魏酸138.13 μg/mL、毛蕊花糖苷52.26 μg/mL、洋川芎內(nèi)酯I 72.41 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.4.2 供試品溶液的制備 同“2.2.2”項下的制備方法。

2.4.3 色譜條件 色譜柱為Agilent Eclipse XDBC18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫條件為0～15 min，25%～35%甲醇；15～25 min，35%～42%甲醇；體積流量1 mL/min；檢測波長為280 nm；柱溫30 ℃；進樣體積10 μL。色譜圖見圖3。

圖3 混合對照品 (A) 和一貫煎基準樣品 (B) 的HPLC 圖Fig. 3 HPLC of mixed reference substances (A) and Yiguanjian benchmark samples (B)

2.4.4 線性關(guān)系考察 取“2.4.1”項下對照品溶液逐級稀釋，按“2.4.3”項下色譜條件分別測定不同質(zhì)量濃度下對香豆酸、阿魏酸、毛蕊花糖苷和洋川芎內(nèi)酯I 的色譜峰峰面積，以對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），分別對對香豆酸、阿魏酸、毛蕊花糖苷和洋川芎內(nèi)酯I 質(zhì)量濃度進行線性回歸，得回歸方程分別為對香豆酸Y＝45 858.0X＋5 889.8，R2＝0.999 8，線性范圍0.52～33.05 μg/mL；阿魏酸Y＝28 238.0X＋3 896.7，R2＝0.999 8，線性范圍1.08～69.06 μg/mL；毛蕊花糖苷Y＝9 715.4X－2 483.3，R2＝0.999 9，線性范圍0.41～26.13 μg/mL；洋川芎內(nèi)酯IY＝38 500.0X－1 716.0，R2＝0.999 8，線性范圍0.57～36.21 μg/mL。

2.4.5 精密度考察 按照“2.4.2”項方法制備供試品溶液，按“2.4.3”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，分別測定對香豆酸、阿魏酸、毛蕊花糖苷、洋川芎內(nèi)酯I 的峰面積，計算其RSD 值分別為0.52%、1.21%、2.30%、1.95%，表明儀器精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性考察 取供試品溶液，按“2.4.3”項下色譜條件分別在制備后0、2、4、6、8、12、18、24 h 進樣測定，分別測定對香豆酸、阿魏酸、毛蕊花糖苷、洋川芎內(nèi)酯I 的峰面積，計算其RSD 值分別為1.15%、2.02%、2.47%、1.98%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.7 重復(fù)性考察 精密稱定6 份樣品，按照“2.4.2”項方法，分別平行制備6 份供試品溶液，按“2.4.3”項下色譜條件進行測定，分別計算對香豆酸、阿魏酸、毛蕊花糖苷、洋川芎內(nèi)酯I 質(zhì)量分數(shù)的RSD值分別為1.47%、1.65%、2.10%、0.72%，結(jié)果表明該試驗方法重復(fù)性較好。

2.4.8 加樣回收率考察 取已知含量的樣品精密稱定，置具塞錐形瓶中，平行9 份，每3 份1 組，分別精密加入與樣品中相應(yīng)成分含量相等的對照品儲備液1、2、3 mL，按“2.4.2”項方法操作得到加標(biāo)溶液，按“2.4.3”項色譜條件測定，分別計算對香豆酸、阿魏酸、毛蕊花糖苷、洋川芎內(nèi)酯I 的平均加樣回收率為90.63%、105.74%、97.78%、92.81%，RSD 值分別為2.48%、2.90%、2.66%、2.36%，表明該方法準確度良好。

2.5 出膏率的測定

取105 ℃烘干至恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿，記錄質(zhì)量（m1）；精密稱取提取液20 g 于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，移入烘箱，105 ℃干燥5 h，取出放干燥器，放冷后稱定質(zhì)量，再次放入烘箱內(nèi)105 ℃干燥1 h，取出稱重，至恒定質(zhì)量，記錄質(zhì)量（m2）。固含量和出膏率計算公式如下。

固含率＝(m2－m1)/20 （1）

出膏率＝固含率×提取液總量/飲片投料質(zhì)量（2）

2.6 指紋圖譜的建立

2.6.1 供試品溶液的制備 同“2.2.2”項下的制備方法。

2.6.2 色譜條件 色譜柱為Waters HSS T3 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；體積流量1 mL/min；檢測波長為280 nm；柱溫30 ℃；進樣體積10 μL；流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫條件為0～12 min，0～2%乙腈；12～25 min，2%～8%乙腈；25～35 min，8%～11%乙腈；35～50 min，11%～22%乙腈；50～60 min，22%～40%乙腈；60～70 min，40%～90%乙腈；70～80 min，90%乙腈。

2.6.3 精密度考察 按照“2.6.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.6.2”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，分別計算指紋圖譜相似度，相似度＞0.942，表明儀器精密度良好。

2.6.4 穩(wěn)定性考察 取供試品溶液，按“2.6.2”項下色譜條件分別在制備后0、4、8、12、16、20、24 h 進樣測定，分別計算指紋圖譜相似度，相似度＞0.935，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.5 重復(fù)性考察 精密稱定6 份樣品，按照“2.6.1”項方法分別平行制備6 份供試品溶液，按“2.6.2”項下色譜條件進行測定，分別計算指紋圖譜相似度，相似度＞0.942，表明試驗方法重復(fù)性較好。

2.6.6 指紋圖譜分析 按照“2.6.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.6.2”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖4。導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）》中進行數(shù)據(jù)分析，以基準樣品色譜圖S 為參照譜圖，選擇特征明顯、重復(fù)性好、穩(wěn)定性好的7 個色譜峰為共有峰，經(jīng)多點校正后進行相似度計算。

圖4 一貫煎樣品的HPLC 指紋圖譜Fig. 4 HPLC fingerprints of Yiguanjian samples

2.7 單因素考察

2.7.1 加水量 取全方飲片置于5 L 圓底燒瓶中，分別以料液比為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16 加純化水浸泡30 min 后加熱回流提取1 h，測定地黃苷D、甜菜堿、對香豆酸、阿魏酸、毛蕊花糖苷、洋川芎內(nèi)酯I 含量。由表1 可知，地黃苷D、對香豆酸、阿魏酸、毛蕊花糖苷、洋川芎內(nèi)酯I 成分含量及出膏率隨加水量增加呈上升趨勢，在12 倍量后趨于平緩，甜菜堿含量隨加水倍量增加呈上升趨勢，超過14 倍量后下降，故選取10、12、14 倍量3 個水平進行響應(yīng)面試驗。

表1 加水量對一貫煎提取工藝的影響Table 1 Effects of water addition on extraction process of Yiguanjian

2.7.2 提取時間 取全方飲片置于5 L 圓底燒瓶中，加入8 倍量純化水浸泡30 min，分別加熱回流提取30、50、70、90 min 后測定各個指標(biāo)。由表2可知，地黃苷D、阿魏酸、毛蕊花糖苷、洋川芎內(nèi)酯I 含量隨著提取時間的延長呈上升-平緩-下降趨勢，甜菜堿、對香豆酸含量及出膏率隨提取時間增加呈上升趨勢，在70 min 后趨于平緩，故選取50、70、90 min 3 個水平進行響應(yīng)面試驗。

表2 提取時間對一貫煎提取工藝的影響Table 2 Effects of extraction time on extraction process of Yiguanjian

2.8 響應(yīng)面試驗設(shè)計

2.8.1 CQAs 和CPPs 的確定 基于以上分析，以處方指標(biāo)成分甜菜堿含量、地黃苷D 含量、阿魏酸含量、出膏率、指紋圖譜相似度、對香豆酸含量、毛蕊花糖苷含量、洋川芎內(nèi)酯I 含量為CQAs[14]，加水量（X1）、提取時間（X2）和提取次數(shù)（X3）作為CPPs，依據(jù)經(jīng)驗將提取次數(shù)設(shè)計為1、2、3 次3 個水平進行響應(yīng)面試驗。前期基準物質(zhì)研究中表明浸泡時間對指標(biāo)成分無顯著性差異，考慮生產(chǎn)中時間成本將浸泡時間定為30 min。

2.8.2 Box-Behnken 試驗設(shè)計及結(jié)果 利用Design-Expert 13 軟件安排3 因素3 水平的17 次試驗（中心點選擇重復(fù)5 次）。根據(jù)Box-Benhnken 試驗設(shè)計方案進行實驗，結(jié)果見表3。

表3 提取工藝響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Response surface test design and results of extraction process

2.9 化學(xué)計量學(xué)研究

2.9.1 層次聚類分析（hierachical cluster analysis，HCA） 采用SPSS 26.0 軟件，以各成分含量為變量，以平方歐氏距離為測度進行分析，結(jié)果見圖5。由此可知，當(dāng)歐氏距離為15 時，響應(yīng)面試驗設(shè)計所得溶液聚為2 類，提取液S1～S3、S5 為一類，其余為另一類；當(dāng)歐氏距離為10 時，17 種溶液聚為3類，提取液S1～S3、S5 為第1 類，提取液S4、S8、S13～S17 為第2 類，提取液S6、S7、S9～S12 為第3 類。

圖5 響應(yīng)面試驗設(shè)計所得溶液HCA 圖Fig. 5 HCA plot for solutions obtained by response surface test design

2.9.2 主成分分析（principal component analysis，PCA） 采用SIMCA 14.1 軟件，以各成分含量為變量進行分析，結(jié)果見圖6。其中主成分1 方差貢獻率達54.6%，前3 個主成分累積貢獻率為89.9%，可將前3 個成分即甜菜堿、阿魏酸、地黃苷D 定為關(guān)鍵主成分；17 批提取液均在置信橢圓內(nèi)，且分布相對集中，說明各批次樣品有較好的質(zhì)量一致性，響應(yīng)面試驗設(shè)計所得溶液聚為3 類，與“2.9.1”項下結(jié)果一致。

圖6 響應(yīng)面試驗設(shè)計所得溶液PCA 得分圖Fig. 6 PCA sore scatter plot for solutions obtained by response surface test design

2.9.3 偏最小二乘-判別分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA） 采用SIMCA 14.1軟件，對各成分含量進行分析，結(jié)果見圖7，可知響應(yīng)面試驗設(shè)計所得溶液聚為3 類，與上述構(gòu)建的模型結(jié)果一致。變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值越大，對模型的貢獻值就越大，以VIP＞1 為標(biāo)準篩選差異組分，可知有2 種成分符合要求，VIP 值由高到低依次為甜菜堿、阿魏酸，主要來源于一貫煎臣藥枸杞子、當(dāng)歸，表明這2 種飲片質(zhì)量對全方制劑質(zhì)量研究的影響較大。

圖7 各成分含量VIP 值Fig. 7 VIP values of various constituent contents

2.10 改進AHP-熵權(quán)-基準樣品關(guān)聯(lián)度[15-16]

2.10.1 改進AHP 計算評價指標(biāo)主觀權(quán)重（W） 方中重用生地黃已達滋陰養(yǎng)血功效，臣藥枸杞子益陰養(yǎng)肝，當(dāng)歸性溫味甘辛，養(yǎng)血活血以調(diào)肝，諸藥合用有滋陰疏肝之效。依據(jù)化學(xué)計量學(xué)分析及君臣佐使原則，將方中藥效成分甜菜堿（A1）、阿魏酸（A2）、地黃苷D（A3）定為評價指標(biāo)[17]，指紋圖譜相似度（A4）作為定性標(biāo)準，可反映提取液間差異性，但指標(biāo)成分含量衡量其質(zhì)量更為重要，通過實驗結(jié)果也可以發(fā)現(xiàn)各個水平的出膏率（A5）及指紋圖譜相似度差異不明顯，故5 個評價指標(biāo)的優(yōu)先順序為甜菜堿＞阿魏酸＞地黃苷D＞指紋圖譜相似度＝出膏率，構(gòu)成優(yōu)先判斷矩陣，結(jié)果見表4、5。表6 為1～9 標(biāo)度法、e0/4～e8/4標(biāo)度法計算出的各指標(biāo)成分權(quán)重及改進后組合權(quán)重（W），見計算公式（3）。

表4 1～9 標(biāo)度下指標(biāo)成對比較的判斷優(yōu)先矩陣Table 4 Decision matrix of paired comparison of indexes on scale 1—9

表5 e0/4～e8/4標(biāo)度下指標(biāo)成對比較的判斷優(yōu)先矩陣Table 5 Decision matrix of paired comparison of indexes on scale e0/4—e8/4

表6 改進AHP 評估指標(biāo)權(quán)重Table 6 Improved AHP evaluation index weight

2.10.2 熵權(quán)法計算評價指標(biāo)客觀權(quán)重（WO）

（1）標(biāo)準化處理試驗中指標(biāo)成分、出膏率、指紋圖譜相似度等指標(biāo)，其數(shù)值越大越好，均為正向指標(biāo)。按公式（4）計算[18]，式中xij為i次試驗中j指標(biāo)試驗值，mi為該組試驗值中的最小值，Mi為該組試驗值中的最大值。

（2）根據(jù)信息熵的定義，計算各個指標(biāo)的信息熵為E1、E2、…、E5，通過信息熵Ej計算各指標(biāo)的熵權(quán)WO。

基于改進AHP-熵權(quán)法計算組合權(quán)重系數(shù)，按公式（6）計算，結(jié)果見表7。

表7 組合權(quán)重系數(shù)Table 7 Combination weight coefficient

2.10.3 基準樣品關(guān)聯(lián)度 以基準樣品作為提取工藝優(yōu)化的依據(jù)，對制劑進行整體質(zhì)量控制[19]，將響應(yīng)面試驗設(shè)計的17 個樣品與基準樣品進行關(guān)聯(lián)度比較，按公式（7）計算樣品與基準樣品的相對偏差，偏差值越小表明樣品的質(zhì)量屬性越接近于基準樣品，公式（8）計算基準樣品關(guān)聯(lián)度，式中xi,j為第i個評價對象第j個評價指標(biāo)，sj為基準樣品第j個評價指標(biāo)。設(shè)矩陣X＝(xi,j)m×n（i＝1，2，…，m；j＝1，2…，n）為由m個被評估對象，n個評價指標(biāo)構(gòu)成的原始數(shù)據(jù)矩陣。對數(shù)據(jù)進行與基準樣品的相對偏差處理得到R＝(ri,j)m×n，矩陣，對R矩陣進行基準樣品關(guān)聯(lián)度計算處理。

2.10.4 綜合評分 用改進AHP-熵權(quán)法所得組合權(quán)重系數(shù)與基準樣品關(guān)聯(lián)度對結(jié)果進行綜合評分，按公式（9）計算，結(jié)果見表3。

2.11 響應(yīng)面結(jié)果分析及工藝驗證

利用Design-Expert 13 軟件對改進AHP-熵權(quán)-基準樣品關(guān)聯(lián)度綜合評分結(jié)果進行工藝參數(shù)優(yōu)化，得到各個評價指標(biāo)對3 個CPPs 的二次多元試驗?zāi)Ｐ?，其回歸方程Y＝0.955 9＋0.002 5X1＋0.024 1X2＋0.019 1X3－0.054 0X1X3－0.019 2X1X2－0.002 8X2X3－0.055 9X12－0.027 8X22－0.092 6X32。對試驗?zāi)Ｐ瓦M行方差分析，結(jié)果見表8。2 次多元模型P＜0.001，失擬項P＝0.320 7＞0.05，說明該試驗擬合的模型有統(tǒng)計學(xué)意義，其中煎煮時間對綜合評分有顯著性影響，加水量和提取次數(shù)交互作用顯著。該模型的相關(guān)系數(shù)大于0.9，表明其可以用來分析和預(yù)測一貫煎提取工藝參數(shù)，對模型方程進行響應(yīng)面分析，得到等高線圖及響應(yīng)面圖，結(jié)果見圖8。

表8 響應(yīng)面二次多元回歸模型的方差分析Table 8 Variance analysis of response surface quadratic multiple regression model

圖8 各因素對綜合評分的影響Fig. 8 Influence of each factor on comprehensive score

軟件預(yù)測的最佳提取工藝為加12 倍量水，提取時間80 min，提取次數(shù)2 次，理論預(yù)測評分0.963，3 批工藝驗證的平均綜合評分（表9）為0.957 3，RSD 為0.42%，說明預(yù)測的提取工藝與工藝驗證的結(jié)果有良好的相關(guān)性。

表9 工藝驗證試驗結(jié)果Table 9 Results of process verification experiments

3 批次工藝驗證樣品指標(biāo)成分含量轉(zhuǎn)移率等5個定性、定量指標(biāo)RSD 值均小于3%，證實試驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測的提取工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論

經(jīng)典名方工業(yè)化的提取工藝參數(shù)優(yōu)化以與物質(zhì)基準質(zhì)量屬性一致為目標(biāo)[20]，但在實際工業(yè)生產(chǎn)中考慮到設(shè)備適配性，可行性、時間成本等因素很難與物質(zhì)基準的制備工藝一致，現(xiàn)代工藝與傳統(tǒng)工藝產(chǎn)品存在一定差異性[21]，因此遵循古方而又保障藥品質(zhì)量與物質(zhì)基準基本一致至關(guān)重要。在提取工藝方面有文獻報道[22]，加10 倍量水進行煎煮，本研究加水量單因素考察中12 倍量水煎煮所得藥液的各個指標(biāo)明顯均高于10 倍量水。胡鈺熒等[23]用各個指標(biāo)的綜合評分對煎煮工藝進行單因素考察，提取方式為砂鍋煎煮，其煎煮時間參照《醫(yī)療機構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》定為60 min，本實驗結(jié)合單因素考察情況加以優(yōu)化，為適應(yīng)現(xiàn)代化大生產(chǎn)，采用了加熱回流方式提取，響應(yīng)面預(yù)測的提取時間80 min與前期砂鍋煎煮所得的基準樣品質(zhì)量一致，且評價指標(biāo)的綜合評分為最優(yōu)，在遵古而不泥古的原則下，基于現(xiàn)代設(shè)計手段的提取工藝研究也可用于指導(dǎo)一貫煎制劑的逐步放大生產(chǎn)。

本研究基于改進AHP-熵權(quán)-基準樣品關(guān)聯(lián)度的方法建立一貫煎提取工藝評估模型，以指標(biāo)成分地黃苷D、阿魏酸、甜菜堿含量對提取工藝進行評價，能夠快速、準確篩選CPPs，也可應(yīng)用于制劑生產(chǎn)過程中各個環(huán)節(jié)的質(zhì)量評價[24]，精準有效地實現(xiàn)全過程質(zhì)量監(jiān)控，以出膏率評價全方質(zhì)量，指紋圖譜相似度作為定性指標(biāo)，保證制劑持續(xù)生產(chǎn)安全有效。改進AHP 法在較好的標(biāo)度保序性及一致性的同時提高計算精度[25]，綜合評分法將熵權(quán)法客觀賦權(quán)與改進AHP 主觀賦權(quán)相結(jié)合，可用于后期濃縮、干燥工藝考察中CPPs 的確定，更具有科學(xué)合理性。方中重用君藥生地黃已達滋陰養(yǎng)血功效，臣藥枸杞子益陰養(yǎng)肝，當(dāng)歸養(yǎng)血活血以調(diào)肝。常以水煎劑入藥的地黃中2 大類主要的水溶性成分為環(huán)烯醚萜類和苯乙醇類，能夠抑制肝臟促炎因子誘導(dǎo)的肝細胞凋亡，具有肝臟保護作用[26-27]，前期實驗研究發(fā)現(xiàn)地黃飲片中由于梓醇結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性致使含量批間差異性大，無法較好地從源頭把控全方質(zhì)量，毛蕊花糖苷抑制炎癥相關(guān)因子及蛋白表達，具有肝保護作用[28]，地黃苷D 和毛蕊花糖苷含量高且有較強的專屬性。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，枸杞子中甜菜堿能夠刺激肝臟脂肪氧化，改善線粒體功能，抑制肝纖維化，對香豆酸能夠抑制抗氧化活性，防止肝、腎毒性，從而起到保護肝臟的作用[29-32]。當(dāng)歸中主要活性成分阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I 均能夠抑制肝內(nèi)炎癥，抑制活性氧類和脂質(zhì)過氧化形成，減少肝臟脂肪沉積，有一定的肝臟保護作用[33-35]。本研究選取君臣藥味中藥效成分甜菜堿、地黃苷D、香豆酸、阿魏酸、毛蕊花糖苷、洋川芎內(nèi)酯I 作為考察指標(biāo)，后期將展開佐使藥川楝子中川楝素含量測定研究。參照中國藥典甜菜堿采用氨基鍵合硅膠為填充劑的色譜柱進行含量測定，地黃苷D 極性大，采用對強極性化合物強保留型色譜柱可以改善分離度，故本研究采用3 個含量測定方法進行質(zhì)量控制。本研究所得的提取工藝符合現(xiàn)代生產(chǎn)工藝條件，同時與物質(zhì)基準的質(zhì)量基本一致，可為一貫煎現(xiàn)代工藝大生產(chǎn)提供實驗依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突