李 欠，尹轉(zhuǎn)霖，丁小琴，姜 侃

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，省部共建干旱生境作物學(xué)國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730070

獨活A(yù)ngelicaePubescentisRadix是我國重要的傳統(tǒng)中藥材，有很高的藥用價值。而獨活揮發(fā)油作為獨活的主要藥理成分，具有抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛、理氣、抗菌、抗腫瘤等作用[1-2]。現(xiàn)階段對獨活揮發(fā)油的高效提取與質(zhì)量控制缺少系統(tǒng)的研究。目前，提取揮發(fā)油的傳統(tǒng)方法有：水蒸氣蒸餾法（steam distillation，SD）、溶劑提取法、索氏提取法、機械萃取法等[3]。傳統(tǒng)的提取工藝有萃取時間長、效率低、耗能大，部分方法采用有毒溶劑等弊端。微波輔助提取技術(shù)作為一種新的提取方法，具有能量傳遞快、提取效率高、耗時短、耗能低、綠色環(huán)保等優(yōu)勢，在揮發(fā)油提取方面具有較好的應(yīng)用前景[4-7]。另一方面，低共熔溶劑（deep eutectic solvents，DESs）作為一種環(huán)境友好型溶劑，被廣泛用于提取中藥活性成分領(lǐng)域，具有提取效率高的優(yōu)點[8-13]，目前其在揮發(fā)油的提取方面應(yīng)用較少，具有非常廣闊的前景。

中藥質(zhì)量評價方法可以分為化學(xué)評價、生物評價和化學(xué)-生物相結(jié)合的評價方法[14]。在已有質(zhì)量評價方法的基礎(chǔ)上，劉昌孝院士[15]于2016 年提出利用中藥質(zhì)量標(biāo)志物（quality markers，Q-Marker）評價中藥質(zhì)量的方法，該方法能夠更加全面客觀的評價中藥質(zhì)量，為中藥質(zhì)量控制提供了新的思路。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠揭示中藥成分與相關(guān)靶點相互作用的機制，系統(tǒng)地、全面地展示了疾病與靶點蛋白、靶點蛋白與藥物以及藥物與藥物之間的相互聯(lián)系[16-17]，能夠預(yù)測潛在生物機制下的有效成分或組分，鑒定Q-Marker。

分子對接技術(shù)可以在理論上研究藥物小分子與靶點蛋白的作用，進一步預(yù)測小分子的生物活性。將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法與成分分析方法相結(jié)合，能夠快速、準(zhǔn)確地找到Q-Marker，并利用分子對接的方法，確認(rèn)了主要活性物質(zhì)的作用靶點[18-20]，為中藥Q-Marker 預(yù)測提供理論基礎(chǔ)，具有良好的應(yīng)用前景。本研究采用DESs 輔助微波水蒸氣蒸餾法（DESs assisted microwave steam distillation，DES-A- MSD）提取獨活揮發(fā)油，并與SD 法和微波輔助水蒸氣蒸餾法（microwave assisted steam distillation，MASD）2 種提取方法進行對比，確定獨活揮發(fā)油的最佳提取工藝。利用氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）分析不同提取方法得到的獨活揮發(fā)油的化學(xué)成分的差異，根據(jù)揮發(fā)油化學(xué)成分，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接預(yù)測獨活揮發(fā)油Q-Marker，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

XH-MC-1 型實驗室微波合成反應(yīng)儀，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；INNOTEG-Science One MR1 型磁力攪拌器，德祥科技有限公司；HX203T 型電子天平，1.0 mg，慈溪市天東衡器廠；WK-1000 型小型高速粉碎機，山東精誠醫(yī)藥裝備制造有限公司；Agilent 7890B-7000D 型三重四極桿氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；PTHW 型電熱套，鄭州科豐儀器設(shè)備有限公司。

1.2 材料

獨活藥材采自湖北省宜昌市五峰土家族自治縣，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)陳垣教授鑒定并確認(rèn)，為傘形科當(dāng)歸屬植物重齒毛當(dāng)歸AngelicapubescensMaxim. f.biserrataShan et Yuan 的干燥根。將獨活藥材清洗干燥后粉碎成粉末，過40 目篩，于4 ℃下儲存。正己烷為色譜純，氯化膽堿、尿素、甘油、乙二醇、乳酸、葡萄糖、檸檬酸、1,3-丁二醇為分析純，均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 DES 的制備

本研究采用加熱攪拌法，以氯化膽堿、尿素、甘油、乙二醇、乳酸、葡萄糖、檸檬酸、1,3-丁二醇為原材料制備DES。按照表1 將氫鍵供體（H-bond donor，HBDs）和氫鍵受體（H-bond acceptor，HBAs）以一定的物質(zhì)的量比和/或水混合在圓底燒瓶中，使用磁力攪拌器將其加熱攪拌，直至形成均勻、透明、穩(wěn)定的液體。

表1 不同DESs 的制備Table 1 Preparation of different DESs

2.2 獨活揮發(fā)油不同提取方法的比較

為了獲得一種高效、綠色、低耗能的提取工藝采用SD 法和MASD 法提取獨活揮發(fā)油，并與DESA-MSD 法進行比較。SD 法是將混合物加熱至沸騰狀態(tài)后保持5 h；MASD 法用蒸餾水作為溶劑進行微波萃取。具體實驗參數(shù)如下。①SD 法條件：料液比1∶5，蒸餾時間5 h；②MASD 法條件：料液比1∶5，微波功率400 W，溫度100 ℃，蒸餾時間60 min；③DES-A-MSD 法條件：料液比（獨活粉末-DESs）1∶3，預(yù)處理后再加一定量蒸餾水，微波功率400 W，溫度100 ℃，蒸餾時間60 min。

SD 法、MASD 法與DES-A-MSD 法的揮發(fā)油得率分別為0.28%、0.36%和0.50%。DES-A-MSD法提取率最高，大約是傳統(tǒng)提取工藝SD 法的2 倍，且此法顯著縮短了提取時間。微波技術(shù)會加熱獨活細胞內(nèi)部的水分，使細胞壁破裂，加速了細胞內(nèi)揮發(fā)性成分的溶出，DESs 相比于水具有更好的溶解性和穿透力，能夠增大獨活在溶劑中的溶解度，使細胞內(nèi)成分不斷的擴散出來，進而提高獨活揮發(fā)油得率[21-22]。因此，DES-A-MSD 法的獨活揮發(fā)油得率高，且提取時間短，更利于獨活揮發(fā)油的提取。

2.3 最佳DESs 的篩選

DESs 由不同的天然化合物混合制備而成，其中氫鍵受體和氫鍵供體的不同組合會影響DESs 的理化性質(zhì)。通過尿素、甘油、乙二醇、乳酸、葡萄糖、檸檬酸、1,3-丁二醇與氯化膽堿的混合，制備出7 種DESs。其中一些DESs 需加入一定量的水以降低其黏度。精確稱取100 g 獨活粉末，使用磁力攪拌器，將稱好的獨活粉末與制備好的DESs，按照1∶3 的料液比進行混合攪拌，后轉(zhuǎn)入微波反應(yīng)器中，在微波功率600 W、溫度80 ℃的條件下反應(yīng)10 min，對混合物進行微波輻射預(yù)處理，然后加入200 mL 蒸餾水，磁力攪拌將其混勻，后將所有樣品溶液轉(zhuǎn)移至三頸燒瓶內(nèi)并放入微波反應(yīng)器中，如圖1 所示。將燒瓶與V 型提取器和回流冷凝管相連，實現(xiàn)獨活揮發(fā)油的收集和凝結(jié)水的回流。先設(shè)置微波功率600 W、溫度為103 ℃、反應(yīng)時間為5 min，讓混合物的溫度迅速升高，使其接近沸點，最后在微波功率400 W、溫度100 ℃的條件下持續(xù)蒸餾60 min。每次提取均有3 次重復(fù)。將收集的揮發(fā)油脫水處理，低溫（4 ℃）保存。揮發(fā)油得率計算公式如下。結(jié)果表明，不同的DESs 均可以提取出一定量獨活揮發(fā)油，但是得率有較大差異。其中，DES-4（氯化膽堿-乳酸）所提取的揮發(fā)油得率最高，得率達0.5%；DES-2（氯化膽堿-甘油）和DES-6（氯化膽堿-檸檬酸）所提取的揮發(fā)油得率次之，DES-5（氯化膽堿-葡萄糖）所提取的揮發(fā)油得率最低。這可能是由于有機酸類成分能夠更好吸收微波輻射，并促進獨活細胞大量釋放揮發(fā)性成分，進而提高揮發(fā)油得率[23]。最終考慮到揮發(fā)油得率，選擇DES-4 用于后續(xù)優(yōu)化實驗。

圖1 微波提取揮發(fā)油裝置示意圖Fig. 1 Diagram of microwave extraction unit for volatile oil

Y＝V/W

Y是揮發(fā)油得率，V是揮發(fā)油的體積，W是獨活粉末的質(zhì)量

2.4 揮發(fā)油成分GC-MS 分析

采用SH-Rxi-5 MS 色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），對揮發(fā)油進行GC-MS 分析。程序初始溫度為50 ℃，保持3 min，后以4 ℃/min 升溫，溫度升至250 ℃，保持1 min。進樣口溫度為250 ℃，體積流量為1 mL/min，氦氣為載氣。離子源溫度設(shè)置為200 ℃，掃描范圍m/z33～500，質(zhì)譜采集3.5～54 min。分別使用數(shù)據(jù)庫（NIST14）比對和峰面積歸一化法對檢測到的化合物進行定性和定量分析。

GC-MS 分析結(jié)果（表2）表明，SD 法得到揮發(fā)油成分占總峰面積的83.52%，MASD 法占97.92%，DES-A-MSD 法占80.6%。由此可見，DES-A-MSD法的揮發(fā)油得率最高，但是純度較低；而MASD 法提取的揮發(fā)油得率中等，純度最高。微波提取法加熱時間短，會降低揮發(fā)油熱降解，所以MASD 法提取出來的揮發(fā)油純度較高。SD 法加熱時間長，提取效率低，會導(dǎo)致熱降解，所以揮發(fā)油純度較低。另一方面，由于DESs 的溶解能力強，可能與部分非目標(biāo)成分有較好的親和力，導(dǎo)致一些非揮發(fā)性成分被萃取出來，雖然提高了得油率，但是降低了揮發(fā)油純度[24-25]。以上3 種方法得到的獨活揮發(fā)油中主要活性成分有β-瑟林烯、α-蛇床烯、紅沒藥醇、蛇床子素、2-羥基環(huán)十五酮。

表2 獨活揮發(fā)油的主要成分Table 2 Main components of volatile oils from Angelica Pubescens Radix

2.5 單因素試驗考察不同因素對揮發(fā)油得率的影響

根據(jù)單因素試驗來探究HBA 與HBD 不同物質(zhì)的量、微波功率和DESs 含水量對獨活揮發(fā)油得率的影響。每個試驗均有3 次重復(fù)。

2.5.1 HBA 與HBD 不同物質(zhì)的量比對獨活揮發(fā)油得率的影響 當(dāng)合成DESs 時，氫鍵受體（HBA）和氫鍵供體（HBD）的物質(zhì)的量比會影響DESs 的極性、黏度和表面張力[26]。保證其他實驗條件不變，本實驗考察了HBA 與HBD 不同物質(zhì)的量比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5）合成的DESs 對獨活揮發(fā)油提取的影響，獨活揮發(fā)油得率分別為0.42%、0.50%、0.45%、0.38%、0.30%，當(dāng)物質(zhì)的量比從1∶1 減小到1∶2 時，揮發(fā)油得率不斷上升，且當(dāng)物質(zhì)的量比為1∶2 時，揮發(fā)油得率達到最大值，最利于獨活揮發(fā)油的提取，但當(dāng)物質(zhì)的量比小于1∶2 時，揮發(fā)油得率開始下降，這可能是因為物質(zhì)的量比的不同會影響DESs 的理化性質(zhì)，在物質(zhì)的量比為1∶2 時，DESs 與獨活之間的氫鍵相互作用較強，進而促進了獨活揮發(fā)油的釋放[26]。

2.5.2 不同含水量對獨活揮發(fā)油得率的影響 保證其他實驗條件不變，考察DESs 不同含水量（0、10%、20%、30%、40%）對揮發(fā)油得率的影響。大部分DESs 與傳統(tǒng)有機溶劑相比，黏稠度高，流動性較差，然而添加適量的水會使DESs 分子間的氫鍵逐漸斷裂，可顯著降低DESs 的黏度[27-28]。本研究設(shè)置5 個DESs 含水量梯度，考察DESs 含水量對獨活揮發(fā)油得率的影響，結(jié)果獨活揮發(fā)油得率分別為0.50%、0.53%、0.48%、0.45%、0.42%。發(fā)現(xiàn)DESs的含水量從0 增加到40%時，DESs 的流動性明顯增強，當(dāng)DESs 含水量從10%增加到40%時，揮發(fā)油得率呈下降趨勢，且達到最低值；當(dāng)含水量為10%時，揮發(fā)油得率達到最大值，這表明加入適量的水有利于揮發(fā)油的提取，可提高揮發(fā)油得率，而少量或者過量的水會削弱DESs 的溶解度，進而減弱其與獨活的相互作用，導(dǎo)致?lián)]發(fā)油得率降低。因此，DESs 含水量為10%時，最利于獨活揮發(fā)油的提取。

2.5.3 不同微波功率對獨活揮發(fā)油得率的影響 微波作為一種介質(zhì)加熱模式，可以快速升溫，促進分子的振動，進而加速植物細胞纖維素的溶解[29-30]，微波功率是影響揮發(fā)油得率至關(guān)重要的因素之一。保證其他實驗條件不變，考察不同微波功率（300、400、500、600、700 W）對獨活揮發(fā)油得率的影響。結(jié)果獨活揮發(fā)油得率分別為0.43%、0.50%、0.52%、0.46%、0.35%，當(dāng)微波功率從300 W 增加到500 W時，揮發(fā)油得率不斷上升且達到最大值，但當(dāng)微波功率超過500 W 時，揮發(fā)油得率開始呈下降趨勢。這可能是因為隨著微波輻射的增強，會激發(fā)DESs與獨活細胞的相互作用，但當(dāng)微波功率超過500 W時，較高的微波能量會使獨活細胞突然破裂，大量的混合物涌出，導(dǎo)致較多揮發(fā)性成分難以收集。綜上，微波功率為500 W 時最利于獨活揮發(fā)油的提取。

2.5.4 獨活揮發(fā)油的最佳提取工藝 通過單因素試驗對獨活揮發(fā)油的提取工藝進行優(yōu)化，結(jié)果表明，最佳提取工藝為HBA 和HBD 的物質(zhì)的量比為1∶2，微波功率為500 W，DESs 含水量為10%，對此提取條件驗證后，獨活揮發(fā)油提取率為0.54%。與傳統(tǒng)的提取方法相比，DES-A-MSD 法具有綠色、環(huán)保、低能耗、高產(chǎn)能等優(yōu)點，這為天然產(chǎn)物中揮發(fā)油等活性成分的提取提供了新思路。

2.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

選擇共有成分作為Q-Marker 的候選化合物，并通過TCMSP 和Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫來確定這些候選化合物的靶標(biāo)，然后利用UniProt 數(shù)據(jù)庫獲得了與候選化合物有關(guān)的基因信息。將化合物與靶點導(dǎo)入到Cytoscape 3.2.1 軟件中，從而創(chuàng)建每個化合物與靶點作用的網(wǎng)絡(luò)圖。利用STRING 數(shù)據(jù)庫，成功地建立了蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。結(jié)合DAVID數(shù)據(jù)庫，進行基因本體（gene ontology，GO）功能富集，并對京都基因和基因組大百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）的通路進行富集分析[31-33]。

2.6.1 Q-Marker 候選成分的選擇 基于獨活揮發(fā)油GC-MS 分析的結(jié)果，將不同提取方法下?lián)]發(fā)油相對含量較高的主要共有成分作為候選成分，結(jié)果見表3。

表3 揮發(fā)油質(zhì)量標(biāo)志物候選成分Table 3 Candidate ingredients of Q-Marker for volatile oils

2.6.2 候選化合物的靶點預(yù)測 查找候選化合物作用靶點和靶點基因名，物種選定為“Human”，以可能性大于0 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到相應(yīng)的預(yù)測靶點。其中2-羥基環(huán)十五酮預(yù)測到了100 個靶標(biāo)，紅沒藥醇預(yù)測到了100 個靶標(biāo)，α-蛇床烯預(yù)測到了99 個靶標(biāo)，β-瑟林烯預(yù)測到了23 個靶標(biāo)，蛇床子素預(yù)測到了100 個靶標(biāo)。將所有靶點取并集、篩去重復(fù)值后得到268 個靶點。圖2 為成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖（V 形和圓形節(jié)點分別表示化合物和對應(yīng)的靶點，節(jié)點大小表示度值大?。?；從圖中可知，α-蛇床烯、紅沒藥醇、蛇床子素、2-羥基環(huán)十五酮對應(yīng)的靶點更多，影響更大。

圖2 成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 2 Component-target network

2.6.3 PPI 分析 PPI 是細胞發(fā)揮功能的基礎(chǔ)，具有調(diào)節(jié)機體生理病理狀態(tài)的重要作用[34-35]。使用STRING 數(shù)據(jù)庫對268 個與候選成分相關(guān)靶點進行深入分析，設(shè)定了蛋白交互參數(shù)的評分值超過0.9。將結(jié)果以tsv 格式的文件導(dǎo)入到Cytoscape 3.2.1 中，從而構(gòu)建了PPI 網(wǎng)絡(luò)（選取degree 大于中位數(shù)且大于14 的節(jié)點制作PPI 網(wǎng)絡(luò)圖），結(jié)果見圖3。選取網(wǎng)絡(luò)中度值（degree）前5 的靶點腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、半胱天冬酶3（caspase 3，CASP3）和過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARG）作為關(guān)鍵靶點。

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 3 PPI network

2.6.4 GO 與KEGG 富集分析 GO，即基因和蛋白質(zhì)功能的注釋體系，涵蓋了3 個獨立的本體類別：分子功能（molecular function，MF）、細胞組成（cellular component，CC）以及生物過程（biological process，BP），GO 提升了對基因功能進行預(yù)測的準(zhǔn)確度。KEGG 將基因、酶、化合物以及代謝和信號通路網(wǎng)絡(luò)整合在一起，是一個綜合性數(shù)據(jù)庫[36]。通過DAVID 數(shù)據(jù)庫，對268 個關(guān)鍵目標(biāo)靶點執(zhí)行了GO 功能的富集分析，共獲得858 個條目，其中BP 570 個、MF 201 個、CC 87 個，圖4 為P＜0.05 的前5 的GO 富集分析條形圖。生物過程有胞漿鈣離子濃度的正調(diào)控、藥物反應(yīng)、疼痛感知等，分子功能有核受體活性、配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性、鋅離子結(jié)合等，細胞組成為質(zhì)膜的組成部分、胞質(zhì)溶膠等。KEGG 分析獲得126 條通路，圖5 展示了P值小于0.05 的前9 個重要的KEGG 通路富集分析條形圖。這些通路包括了神經(jīng)活性配體與受體之間的交互作用、癌癥途徑和鈦信號等。

圖4 GO 富集分析條形圖Fig. 4 Bar chart of GO enrichment analysis

圖5 KEGG 富集分析條形圖Fig. 5 Bar diagram of KEGG enrichment analysis

2.6.5 成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 圖6 為成分-靶點-通路的網(wǎng)絡(luò)圖。參照連接的度值（degree），分析得出紅沒藥醇（連接度為2）和α-蛇床烯（連接度為4）在網(wǎng)絡(luò)中顯示出較高的連接度。因此，紅沒藥醇和α-蛇床烯可以作為揮發(fā)油的Q-Marker。5 個關(guān)鍵靶點TNF、MAPK3、ESR1、CASP3 和PPARG 的連接度分別是98、73、65、64 和63，連接度較高，表明這5 個靶點的作用尤為重要；9 條通路中癌癥通路的度值是4 為最大值，是最為重要的一條通路。

圖6 成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 6 Network of component-target-pathway

2.6.6 關(guān)鍵靶點的組織分布 運用The Human Protein Atlas 數(shù)據(jù)庫查找TNF、MAPK3、ESR1、CASP3 和PPARG 5 個核心靶點的組織分布數(shù)據(jù)，圖7 展示了運用Cytoscape 3.2.1 軟件構(gòu)建的靶點-組織網(wǎng)絡(luò)圖。結(jié)果顯示，MAPK3 與45 個組織相連接、PPARG 與32 個組織相連接、CASP3 與25 個組織相連接、ESR1 與6 個組織相連接、TNF 與5個組織相連接。度值前8 的組織分別是脾（spleen，4）、肺（lung，4）、骨髓（bone marrow，4）、扁桃體（tonsil，4）、甲狀腺（thyroid gland，3）、闌尾（appendix，3）、乳房（breast，3）和子宮頸（cervix，3）。關(guān)鍵靶點及其分布的組織與文獻所報道的獨活揮發(fā)油抗炎、抗腫瘤、理氣等藥理作用相對應(yīng)。

圖7 靶點-組織網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 7 Network of target-tissue

2.7 分子對接分析

通過Auto Dock Vina進行分子對接后用PyMOL軟件和Discovery Studio 進行可視化分析。

2.7.1 受體與配體結(jié)構(gòu)獲取 根據(jù)成分-靶點-通路中節(jié)點的連接度，選取紅沒藥醇和α-蛇床烯2 個小分子作為配體，選取α-蛇床烯的作用靶點雌激素受體（estrogen receptor 1，ESR1）、過氧化物酶體增生激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARG）、絲裂原活化蛋白激酶3（mitogenactivated protein kinase 3，MAPK3）和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）和紅沒藥醇可作用的靶點ESR1、PPARG 作為受體。從RCSB 數(shù)據(jù)庫下載PDBID 分別為6kn5、5gtn、2zoq 和4y6o 的ESR1、PPARG、MAPK3 和TNF 蛋白[37]。從Pubchem數(shù)據(jù)庫下載小分子紅沒藥醇和α-蛇床烯的3D 結(jié)構(gòu)用來對接。

2.7.2 分子對接與可視化 在PyMOL（4.3.0）軟件中分離原始配體和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，在AutodockTools 中對其進行加氫、檢查電荷等處理，構(gòu)建對接網(wǎng)格盒等。使用Auto Dock Vina 進行分子對接，計算ESR1、PPARG、MAPK3 和TNF 與α-蛇床烯組合，以及ESR1、PPARG 與紅沒藥醇對接組合的得分。QMarker 與靶點蛋白結(jié)合位置見圖8。小分子α-蛇床烯與ESR1、PPARG、MAPK3 和TNF 蛋白之間的結(jié)合能分別為-26.8、-30.1、-31.8、-25.1 kJ/mol。小分子紅沒藥醇與ESR1和PPARG蛋白之間的結(jié)合能分別為-24.3 和-27.6 kJ/mol。如果小分子與蛋白之間的結(jié)合能是負值，且數(shù)值越?。ǎ?20.9 kJ/mol），則表明小分子與靶蛋白之間親和活性越強[38]，因此，6 對對接小分子和蛋白之間均結(jié)合穩(wěn)定。

圖8 分子對接圖Fig. 8 Molecular docking diagram

3 討論

本實驗采用SD 法、MASD 法和DES-A-MSD法提取中藥獨活中的揮發(fā)油，分析其化學(xué)成分的差異。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測分析了揮發(fā)油的 QMarker。結(jié)果表明，DES-A-MSD 法的得油率最高，而MASD 法提取的揮發(fā)油含量最高。MASD 法能夠更加有效的提取揮發(fā)油的Q-Marker，而進一步篩選出更加優(yōu)異的DESs 用于揮發(fā)油的提取，是值得深入研究的課題。

核心靶點TNF、MAPK3、ESR1、CASP3 和PPARG 與獨活揮發(fā)油Q-Marker 神經(jīng)保護、抑制相關(guān)酶活性、抗腫瘤、理氣作用等相關(guān)。TNF 能影響胰島素誘導(dǎo)的機體對葡萄糖的攝取進而控制血糖的迅速升高，還可以在脂肪細胞中誘導(dǎo)GKAP42 蛋白降解進而誘導(dǎo)對胰島素的抵抗，減緩脂代謝生物過程[39]。MAPK3 主要與癌癥和炎癥類疾病有關(guān)，可以顯著降低血管內(nèi)皮細胞的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細胞凋亡[40]。ESR1 對性發(fā)育和生殖功能至關(guān)重要[41]。CASP3 是重要的抑癌基因，具有重要的生物學(xué)功能[42]。PPARG 與PPARA 相似，是結(jié)合降血脂藥物和脂肪酸的受體，一旦被激活，就可控制脂肪酸的過氧化β途徑，是血糖、血脂穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[43]。分子對接分析進一步強化了Q-Marker 與其主要靶點間的緊密結(jié)合能力，理論上確立了Q-Marker 的顯著生物活性。該研究基于獨活揮發(fā)油提取及其成分含量的測定，探討了成分與靶點、靶點與組織的聯(lián)系，并通過分子對接等手段，揭示了獨活揮發(fā)油潛在Q-Marker 的特性。這為獨活揮發(fā)油的高效提取和質(zhì)量控制提供了更全面的參考，也為后期深入研究獨活作用機制提供基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突