宋禎彥，黃亞琦#，王也彤，鄧 嘉，甄達(dá)貴，譚年花，成紹武*

1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208

2. 靖州苗族侗族自治縣質(zhì)量計量檢驗檢測中心，湖南 懷化 418400

衰老是以生物機能的下降和適應(yīng)性、抵抗力的減退為特征的退行性生理過程，其中氧化應(yīng)激損傷與衰老密切相關(guān)[1]。正常情況下機體維持著“氧化-抗氧化”之間的動態(tài)平衡，但這種平衡可隨著年齡增長被打破，伴隨年齡增長的是自由基過剩和（或）抗氧化劑的缺失，進(jìn)而導(dǎo)致生物膜結(jié)構(gòu)被破壞、細(xì)胞器功能出現(xiàn)障礙，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子物質(zhì)出現(xiàn)損傷[2]。在機體衰老的有氧代謝中，自由基增加或抗氧化劑缺失使得細(xì)胞毒性增加和機體抗氧化能力下降，這種變化將造成生物膜、氨基酸鏈及DNA 分子結(jié)構(gòu)的不可逆損害，誘發(fā)機體衰老相關(guān)退行性疾病的產(chǎn)生，加速衰老進(jìn)程[3]。

秀麗隱桿線蟲是研究機體衰老基本機制的絕佳模型，因其具有壽命短、細(xì)胞模式簡單、繁殖迅速、后代數(shù)多、行為反應(yīng)模式穩(wěn)定、結(jié)果靈敏可靠等特點，可表現(xiàn)出具有一系列類似于哺乳動物的衰老特征[4]。線蟲中高達(dá)60%～80%的基因與人類基因組具有同源性，為人類遺傳分析提供了有利條件。其中BZIP 結(jié)構(gòu)域蛋白1（protein skinhead-1，skn-1）與哺乳動物的核因子E2 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）蛋白在功能上具有一致性，可在體內(nèi)發(fā)揮相似的抗氧化應(yīng)激作用[5]。

Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）/Nrf2 通路是體內(nèi)氧化還原平衡的細(xì)胞防御機制和重要調(diào)控途徑[6]。Keap1 是Nrf2 的主要負(fù)調(diào)節(jié)因子，生理狀態(tài)下可介導(dǎo)Nrf2 的泛素化及降解。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，Keap1通過氧化還原反應(yīng)被修飾，構(gòu)象發(fā)生變化，從而與Nrf2 解離。Nrf2 被激活進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與肌肉腱膜纖維肉瘤（musculoaponeurotic fibrosarcoma，MAF）結(jié)合為異質(zhì)二聚體后，啟動抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response elements，ARE），增加細(xì)胞對于氧化應(yīng)激的抵抗力，并減少細(xì)胞凋亡以提高存活率，從而恢復(fù)內(nèi)穩(wěn)態(tài)。已有研究證明，Nrf2 活性水平與物種壽命之間存在正向相關(guān)，且會隨著年齡的增長而逐漸降低[7-8]。

為實現(xiàn)健康老齡化，衰老醫(yī)學(xué)將目標(biāo)投向衰老相關(guān)疾病的早期干預(yù)和預(yù)防，其中干細(xì)胞移植、促進(jìn)抗衰老因子表達(dá)、中醫(yī)治療、針灸、膳食補充劑等最新治療方法的研究，為衰老相關(guān)疾病的治療提供了新的方向[9]。中醫(yī)藥因其宏觀辯證，用藥精當(dāng)，不良反應(yīng)較少，逐漸得到國際認(rèn)可，在抗衰老研究與治療中發(fā)揮越來越重要的作用。常用藥食兩用傳統(tǒng)中藥茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.) Wolf 的干燥菌核。茯苓性味甘、平、淡，歸心、肺、脾、腎經(jīng)，具有利水滲濕、和胃健脾、寧心安神的功效。茯苓自古為延年益壽佳品，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中謂其“久服安魂養(yǎng)神，不饑延年?！爆F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，茯苓具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫功能、保肝健脾、鎮(zhèn)靜安神、利水消腫、抗炎抑菌、抗衰老、抗突變等多方面的藥理作用[10-11]。目前，從茯苓中已成功分離提取出茯苓多糖、三萜類、甾醇類、揮發(fā)油類、蛋白質(zhì)等成分，其中茯苓多糖作為茯苓的主要生物活性成分之一，具有抗氧化、抗衰老、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抑菌、保肝及抗癌等生物學(xué)功能[12-14]。茯苓作為當(dāng)歸芍藥散的主要成分之一，已被證明對衰老相關(guān)疾病阿爾茨海默癥具有較好的療效[12-13]。因此茯苓的主要成分茯苓多糖將在延緩衰老和預(yù)防衰老方面的表現(xiàn)出巨大的潛力。本研究基于科學(xué)理論支持和相關(guān)研究基礎(chǔ)，構(gòu)建線蟲模型，揭示茯苓多糖通過調(diào)控skn-1 信號通路延緩衰老的分子機制，進(jìn)一步證明中藥在延緩衰老中的價值，并為藥食同源理念提供新依據(jù)。

1 材料

1.1 線蟲

所有線蟲品系和菌株均購自美國隱桿線蟲遺傳中心（Caenorhabditis Genetics Center，CGC），包括野生型N2、CB1370［daf-2（e1370）］、DA116［eat-2（ad1116）］、EU1［skn-1（zu67）］、LD1（ldIs7［skn-1b/c:GFP＋rol-6（su1006）］）和埃希氏大腸桿菌OP50（Escherichiacoli）。

1.2 藥品與試劑

靖州茯苓（批號2022081201）由靖州苗族侗族自治縣質(zhì)量計量檢驗檢測中心提供并經(jīng)甄達(dá)貴副高級工程師鑒定為多孔菌科真菌茯苓P.cocos(Schw.)Wolf 的干燥菌核；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（批號PHR1000）購自美國 Sigma-Aldrich 公司；百草枯（批號M106760）購自上海阿拉丁公司；鹽酸左旋咪唑（批號L8230）購自北京索萊寶科技有限公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒（批號S0033S）購自碧云天生物工程有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號0521751）購自蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司；快速抗體染料法定量 PCR 預(yù)混液（批號MQ10401S）購自莫納生物科技有限公司。

1.3 儀器

Medifuge?小型臺式離心機（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；Cytation3 多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；T100TM型qRT-PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）；Axio Vert.A1 倒置熒光顯微鏡（德國Zeiss 公司）。

2 方法

2.1 茯苓多糖的提取和鑒定

參考李曉潔等[15]的研究方法，挑選色澤均勻、無霉斑的茯苓塊于50 ℃烘箱中烘干，經(jīng)粉碎機粉碎后過50 目篩得茯苓粉，封存，備用。取1 g 茯苓粉，按照不同料液比1∶50（g∶mL），加入0.6 mol/L的NaOH 溶液，在恒溫水浴鍋中進(jìn)行浸提1.0 h，浸提后的溶液用0.5 mol/L 的HCl 中和，8 000 r/min 離心10 min，取沉淀。將沉淀放入透析袋中，在水中透析7 d，透析完畢后，離心出盡可能多的水，最后通過真空冷凍干燥得到茯苓多糖。使用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，采用酶標(biāo)儀于490 nm 最大吸收波長處測定吸光度（A）值，繪制多糖濃度（x）與A值（y）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制0.1 mg/mL 茯苓多糖溶液，測定茯苓多糖含量[16]。

2.2 線蟲與大腸桿菌OP50 培養(yǎng)條件

在所有實驗中，用堿性次氯酸鹽處理受精的雌雄同體[17]，使線蟲同步。將實驗線蟲保存在含有大腸桿菌OP50 的線蟲生長培養(yǎng)基（NGM）板上培養(yǎng)，溫度為20 ℃。

2.3 毒理實驗

將同期化L4 期野生型N2 線蟲轉(zhuǎn)移到含有不同質(zhì)量濃度（10、20、40、80、160、320、640、1 280 μg/mL）的茯苓多糖和空白含菌培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。培養(yǎng)48、72 h 后觀察線蟲存活情況。以鉑絲輕碰觸秀麗線蟲后10 s 無反應(yīng)判斷線蟲死亡。意外死亡、逃逸（爬壁干燥死亡）、囊袋蟲、內(nèi)部孵育[18]線蟲，剔除判斷。

2.4 壽命實驗

將L4 期N2 線蟲轉(zhuǎn)移到含（10、20、40 μg/mL）茯苓多糖組和空白組的含菌培養(yǎng)皿中，每組50 只。為了確保藥物在整個實驗過程中不失效，每天將線蟲轉(zhuǎn)至新的培養(yǎng)皿，并使用鉑金絲輕輕刺激，記錄存活線蟲數(shù)量，持續(xù)到最后1 條線蟲死亡[19]。

2.5 抗逆性實驗

為檢測對百草枯的抗性，將L4 期N2 線蟲分組同上，每組50 只，處理3 天后進(jìn)行氧化應(yīng)激處理，則將其移至含有10 mmol/L 百草枯的培養(yǎng)皿，此時記為第0 天，每12 小時記錄線蟲存活數(shù)量及死亡數(shù)量，直至最后1 條線蟲死亡[20]。為評價對紫外和高溫的抗性，將L4 期N2 線蟲分組同“2.4”項，每組40 只。將各組線蟲分別轉(zhuǎn)移至未加OP50 的NGM培養(yǎng)皿中，紫外應(yīng)激處理是置于超凈臺中開蓋紫外燈光照射2 h，高溫應(yīng)激處理則將其置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中開蓋靜置2 h，然后將線蟲分別轉(zhuǎn)入對應(yīng)濃度的含菌培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，每天記錄存活線蟲的數(shù)量，持續(xù)到最后1 條線蟲死亡[19]。

2.6 脂褐素分析

將L4 期N2 線蟲分別轉(zhuǎn)移到含（10、20 μg/mL）茯苓多糖各1 組，40 μg/mL 茯苓多糖和空白組各2組的含菌培養(yǎng)皿中，每組20 只，處理7 d 后將1 組空白組和1 組40 μg/mL 茯苓多糖組的線蟲挑到含10 mmol/L 百草枯的培養(yǎng)皿中，其余組不變，12 h后，將線蟲挑至含2%瓊脂糖凝膠的載玻片上，用10μL 濃度為10 mmol/L 的鹽酸左旋咪唑溶液麻醉后，壓片。在倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，Image-Pro Plus 軟件定量分析熒光強度[20]。

2.7 生理機能實驗

2.7.1 吞咽頻率測定 將L4 期N2 線蟲分組同“2.4”項，每組50 只，此時記為第0 天。分別在給藥培養(yǎng)后的第3、6、9、12 天，每組選取生長狀態(tài)良好且狀態(tài)相近的5 條線蟲移至無OP50 的NGM培養(yǎng)皿中，適應(yīng)1 min 后，觀察并記錄30 s 內(nèi)單條線蟲吞咽泵完成跳動的次數(shù)。線蟲攝取食物主要通過吞咽泵完成，當(dāng)其吞咽泵分別向上和向下各進(jìn)行1 次跳動，即為完成1 次跳動[21]。

2.7.2 蟲體擺動頻率測定 每組選取生長狀態(tài)良好且狀態(tài)相近的5 條線蟲觀察并記錄蟲體擺動狀況，向載玻片上滴加M9 溶液10 μL，每次隨機挑取1 只線蟲置于M9 溶液中，使其在M9 溶液中適應(yīng)1 min，然后記錄線蟲蟲體30 s 內(nèi)擺動的次數(shù)，將其頭部和尾部擺動到同一側(cè)的線蟲運動被計為1 次擺動[22]。

2.7.3 生殖測定 將L4 期N2 線蟲分組同“2.4”項，每組5 條。每板1 條，為方便統(tǒng)計產(chǎn)卵數(shù)量，采用直徑35 mm 培養(yǎng)皿。每天同一時間將成蟲轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基繼續(xù)產(chǎn)卵，連續(xù)轉(zhuǎn)4 d（產(chǎn)卵高峰期）。所有含有蟲卵的培養(yǎng)皿置于20 ℃培養(yǎng)箱中，待發(fā)育至幼蟲期即培養(yǎng)2 d 后計數(shù)各組子代的數(shù)目[21]。

2.8 突變體線蟲應(yīng)激與壽命實驗

選取同期化L4 期daf-2、eat-2、skn-1 3 種突變體線蟲和N2 野生型線蟲轉(zhuǎn)移到含有40 μg/mL 茯苓多糖的藥物組和空白組的含菌培養(yǎng)皿中，每組50 條，按照“2.5”項下方法進(jìn)行抗氧化應(yīng)激實驗[22]。選取L4 期skn-1 突變體線蟲和L4 期N2 線蟲分組同上，每組50 條，按照“2.4”項下方法進(jìn)行壽命實驗。

2.9 線蟲skn-1 綠色熒光蛋白的細(xì)胞定位檢測

選取L4 期skn-1b/c:GFP 線蟲轉(zhuǎn)入2 組含有40 μg/mL 茯苓多糖的藥物組和2 組空白組的含菌培養(yǎng)基中，每組50 條，處理7 d 后將1 組空白組和1 組40 μg/mL 茯苓多糖的藥物組轉(zhuǎn)至含10 mmol/L 百草枯的培養(yǎng)基培養(yǎng)，其余組不變，處理12 h 后，每組各取40 條線蟲將線蟲挑至含2%瓊脂糖凝膠的載玻片，用10 μL 濃度為10 mmol/L 的鹽酸左旋咪唑溶液麻醉后，壓片。在倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。計取skn-1 綠色熒光蛋白全部和部分進(jìn)入腸道細(xì)胞核以及未進(jìn)入腸道細(xì)胞核的線蟲的數(shù)目，并拍照保存。高表達(dá)表示在線蟲的從頭到尾大部分腸道細(xì)胞核中都能觀察到強烈的skn-1b/c:GFP 信號；中表達(dá)表示在線蟲的頭和尾部的腸道細(xì)胞核中能觀察到skn-1b/c:GFP 信號或者在所有腸核中都觀察到微弱的skn-1b/c:GFP 信號；低表達(dá)表示在線蟲的頭部至尾部幾乎檢測不到skn-1b/c:GFP 信號，用Image-Pro Plus 軟件處理圖像并進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析[23]。

2.10 qRT-PCR 實驗

將L4 期N2 線蟲分組及處理同“2.6”項，每組100 只，按照試劑盒說明書提取線蟲RNA，測定濃度后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用SYBR Green 染料法在Realtime qPCR 儀上進(jìn)行擴增，反應(yīng)程序為95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，58 ℃、30 s，40 個循環(huán)。以GAPDH為參比基因，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析?？寡趸蚬入赘孰腟-轉(zhuǎn)移酶4（glutathione S-transferase 4，gst-4）、gst-7、超氧化物歧化酶3（superoxide dismutase-3，sod-3）、熱休克蛋白16.2（heat shock protein Hsp-16.2，hsp16.2）引物序列（表1）參照Wang 等[23]的研究。同時選取L4 期skn-1 突變體線蟲分組及處理同“2.9”項，采用上述同樣處理后檢測各基因的表達(dá)水平。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.11 ROS 水平檢測

將L4 期N2 線蟲分組及處理同“2.6”項，每組30 只，用M9 緩沖液收集各組線蟲并清洗后，放入含有200 μL PBS 緩沖液的EP 管中，在冰上超聲破碎后，4 ℃、12 000 r/min 離心，取上清，移入黑色96 孔板中每個孔中（每組平行3 孔，每孔加入50μL 上清液），再加入50 μL 提前稀釋好的100 μmol/L H2DCF-DA 熒光探針，設(shè)置不加線蟲和DCFH-DA溶液的空白組，只加線蟲不加DCFH-DA 溶液的對照組，將加樣后的96 孔黑板室溫避光孵育30 min，酶標(biāo)儀檢測熒光，每5 分鐘讀1 次數(shù)，讀60 min，激發(fā)光為485 nm，發(fā)射光為528 nm，測定熒光強度，從而確定ROS 水平[19]。同時選取L4 期skn-1突變體線蟲分組及處理同“2.9”項，采用上述同樣處理后檢測ROS 水平。

2.12 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果采用Prism GraphPad 8統(tǒng)計軟件分析，生存曲線實驗結(jié)果采用Log-Rank 檢驗進(jìn)行分析，其余實驗采用方差分析進(jìn)行兩組間比較。

3 結(jié)果

3.1 茯苓多糖提取物多糖含量和毒性檢測

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y＝3.608 6x＋0.086 8（R2＝0.991 9），葡萄糖質(zhì)量濃度為0.02～0.10 mg/mL，A值與其呈良好線性關(guān)系，提取物中總多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為276.746 mg/g。茯苓多糖對秀麗隱桿線蟲的毒理實驗結(jié)果表明，質(zhì)量濃度在1.28 mg/mL 以下的茯苓多糖對秀麗隱桿線蟲均無毒性作用，40 μg/mL 以上的質(zhì)量濃度茯苓多糖對秀麗隱桿線蟲壽命影響無顯著差異，故選取10、20、40 μg/mL 的茯苓多糖開展后續(xù)實驗（表2）。

表2 茯苓多糖對秀麗隱桿線蟲的毒性作用Table 2 Toxic effect of Poria cocos polysaccharides on C.elegans

3.2 茯苓多糖延長秀麗隱桿線蟲的壽命并提高抗衰老能力

壽命的長短是衡量線蟲衰老最重要的指標(biāo)。茯苓多糖對線蟲壽命的影響見圖1-A，在正常的實驗條件下，N2 線蟲的平均壽命為（11.420±0.635）d，在給予10、20、40 μg/mL 茯苓多糖后，平均壽命分別增加到（12.130±0.469）、（13.261±0.475）、（14.247±0.719）d。與N2 組比較，10、20、40 μg/mL茯苓多糖組的壽命分別增加 6.21%、16.12%、24.75%，壽命以茯苓多糖劑量相關(guān)性的方式增加，說明茯苓多糖具有延長成年線蟲壽命的效應(yīng)。蠕蟲的壽命與其在各種應(yīng)激源下的存活率呈正相關(guān)[24]。在紫外應(yīng)激條件下線蟲壽命如圖1-B 所示，與N2組比較，20、40 μg/mL 茯苓多糖延長了線蟲生存時間。在35 ℃熱休克條件下線蟲壽命如圖1-C 所示，N2 組平均生存時間為（4.570±0.528）d，而40 μg/mL茯苓多糖延長線蟲生存時間到（5.416±0.532）d，綜上，提示茯苓多糖能增加對紫外照射的耐受性和提高線蟲的耐熱性。

圖1 茯苓多糖延長秀麗隱桿線蟲的壽命并提高抗衰老能力 (±s, n = 50)Fig. 1 P. cocos polysaccharides extends lifespan of C. elegans and enhances anti-aging abilities (±s, n = 50)

線蟲的進(jìn)食是通過頭部后端的吞咽泵跳動完成的，咽泵速在整個發(fā)育幼蟲期逐漸增加，在L4 期達(dá)到峰值，然后在衰老期間逐漸降低[22]。茯苓多糖能夠顯著提高野生型N2 成蟲給藥后第3、6、9、12 天的吞咽次數(shù)（P＜0.05、0.01、0.001，圖1-D）。觀察M9 液體中線蟲在一定時間內(nèi)的彎曲次數(shù)，可評價線蟲衰老進(jìn)程[22]。茯苓多糖給藥培養(yǎng)后的第3、6、9、12 天線蟲彎曲次數(shù)均高于N2 組（P＜0.05、0.01、0.001，圖1-E）。線蟲的產(chǎn)卵數(shù)量是反映線蟲生理能力強弱的一個重要指標(biāo)[20]。各質(zhì)量濃度的茯苓多糖均對線蟲的產(chǎn)卵數(shù)量無顯著影響（圖1-F），說明藥物質(zhì)量濃度并不影響線蟲正常繁殖。綜上，提示茯苓多糖能夠延緩野生型N2 線蟲的衰老進(jìn)程，增強抗衰老能力，其中40 μg/mL 茯苓多糖干預(yù)后效果最顯著。

3.3 茯苓多糖降低秀麗隱桿線蟲脂褐素和ROS 的含量，促進(jìn)抗氧化基因表達(dá)

隨著機體的老化，細(xì)胞的新陳代謝被破壞，產(chǎn)生大量自由基，可能與不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致脂褐素的產(chǎn)生[25]。如圖2-A、B 所示，與N2 組比較，20、40 μg/mL 茯苓多糖組線蟲體內(nèi)的脂褐素?zé)晒鈴姸蕊@著降低（P＜0.001），提示茯苓多糖能減輕衰老過程中的脂褐素生成。在正常衰老過程中會不斷產(chǎn)生ROS，ROS 具有很強的氧化能力，因此ROS被認(rèn)為是引起衰老的主要原因[26]。本實驗采用H2DCF-DA 熒光探針法檢測茯苓多糖對線蟲內(nèi)源性ROS 水平的影響。如圖2-D 所示，與N2 組比較，40 μg/mL 茯苓多糖處理后N2 線蟲內(nèi)源性ROS水平顯著降低（P＜0.01），而較低的ROS 水平可能與提高抗氧化應(yīng)激能力和延長壽命相關(guān)。在生理條件下，采用qRT-PCR 檢測N2 線蟲中抗氧化基因gst-4、gst-7、sod-3和hsp-16.2的mRNA 表達(dá)。如圖2-C 所示，與N2 組比較，40 μg/mL 茯苓多糖干預(yù)后gst-4、gst-7表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。gst-4的轉(zhuǎn)錄激活通常被用來考察skn-1 活性[27]。

圖2 茯苓多糖降低秀麗隱桿線蟲脂褐素和ROS 的含量，促進(jìn)抗氧化基因表達(dá) (±s, n = 50)Fig. 2 P. cocos polysaccharides reduces lipofuscin and ROS levels, promotes expression of antioxidant genes in C. elegans(±s, n = 50)

3.4 茯苓多糖誘導(dǎo)秀麗隱桿線蟲抗氧化應(yīng)激，減少損傷

利用百草枯建立氧化損傷模型，該模型會誘導(dǎo)線蟲產(chǎn)生大量的ROS，ROS 是一種高活性氧分子，可誘導(dǎo)遺傳毒性和生理損傷，破壞抗逆性的先天機制，可能導(dǎo)致DNA 損傷、基因表達(dá)改變、細(xì)胞信號紊亂、脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡，最終導(dǎo)致細(xì)胞衰老和死亡[28]。如圖3-A 所示，與模型組比較，20、40 μg/mL 茯苓多糖在氧化應(yīng)激條件下能延長線蟲壽命，提高其抗氧化應(yīng)激能力。在氧化應(yīng)激條件下測定脂褐素，與模型組比較，40 μg/mL 茯苓多糖在氧化應(yīng)激條件下能顯著降低線蟲體內(nèi)脂褐素?zé)晒鈴姸龋≒＜0.001，圖3-B、C）。同時在氧化應(yīng)激條件下，與模型組比較，40 μg/mL 茯苓多糖組線蟲體內(nèi)抗氧化相關(guān)基因gst-4、gst-7表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01、0.001，圖3-D）。ROS 的生成與氧化損傷密切相關(guān)，如圖3-E 所示，與模型組比較，在氧化應(yīng)激條件下40 μg/mL 茯苓多糖處理的N2 線蟲體內(nèi)ROS 水平顯著降低（P＜0.01）。綜上提示，茯苓多糖能延長線蟲在氧化應(yīng)激狀態(tài)下的壽命，具有抗氧化活性，茯苓多糖能減少線蟲氧化應(yīng)激狀態(tài)下ROS的產(chǎn)生，調(diào)控抗氧化基因抑制內(nèi)源性ROS 產(chǎn)生可能與茯苓多糖的抗氧化活性相關(guān)。

圖3 茯苓多糖誘導(dǎo)秀麗隱桿線蟲抗氧化應(yīng)激并減少損傷 (±s, n = 40)Fig. 3 P. cocos polysaccharides induces antioxidant stress in C. elegans and reduce damage (±s, n = 40)

3.5 茯苓多糖誘導(dǎo)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)的氧化應(yīng)激抗性需要skn-1

利用與衰老相關(guān)的胰島素信號通路daf-2 突變體線蟲、飲食限制信號通路eat-2 和skn-1 轉(zhuǎn)錄因子skn-1 突變體線蟲，探究茯苓多糖在體內(nèi)的抗氧化作用途徑[23]。如圖4 所示，40 μg/mL 茯苓多糖可以延長氧化應(yīng)激下胰島素樣受體β 亞基（insulin-like receptor subunit beta，daf-2）和神經(jīng)元乙酰膽堿受體亞基eat-2（neuronal acetylcholine receptor subunit eat-2，eat-2）突變體線蟲的壽命，但不能延長skn-1 突變體線蟲的壽命。而在生理情況下40 μg/mL 茯苓多糖能延長N2 線蟲壽命，但不能延長skn-1 突變體線蟲的壽命，提示茯苓多糖延長線蟲壽命與調(diào)控skn-1 信號通路抗氧化有關(guān)，而非daf-2 和eat-2 途徑介導(dǎo)。

圖4 茯苓多糖誘導(dǎo)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)的氧化應(yīng)激抗性需要skn-1 (±s, n = 40)Fig. 4 P. cocos polysaccharides require skn-1 for induction of oxidative stress resistance in C. elegans (±s, n = 40)

3.6 茯苓多糖通過skn-1 信號通路誘導(dǎo)氧化應(yīng)激抵抗

skn-1 是哺乳動物抗氧化酶調(diào)節(jié)基因Nrf2 在秀麗隱桿線蟲的同源基因，可促進(jìn)線蟲氧化應(yīng)激抵抗力，幫助延長長壽[29]。為進(jìn)一步檢測skn-1 活性，檢測了skn-1b/c:GFP 線蟲中skn-1 的核定位情況，結(jié)果顯示40 μg/mL 茯苓多糖明顯促進(jìn)了skn-1 的入核（P＜0.05，圖5-A、B）；在氧化應(yīng)激條件下，40 μg/mL 茯苓多糖也能促進(jìn)skn-1 的入核（P＜0.05，圖5-C），提示skn-1 的入核激活下游轉(zhuǎn)錄發(fā)揮抗氧化作用。skn-1/Nrf2 信號通路在秀麗隱桿線蟲衰老過程中起著至關(guān)重要的作用[30]。為了確定茯苓多糖是否通過這一機制發(fā)揮作用，分析了skn-1 突變體線蟲中g(shù)st-4、gst-7、sod-3和hsp16.2的mRNA 表達(dá)。結(jié)果顯示，在skn-1 突變體線蟲中，40 μg/mL茯苓多糖干預(yù)后skn-1 轉(zhuǎn)錄因子下游的抗氧化基因gst-4、gst-7、sod-3和hsp16.2的表達(dá)水平均無明顯差異（圖5-D），而在氧化應(yīng)激條件下茯苓多糖對skn-1 轉(zhuǎn)錄因子下游的抗氧化基因gst-4、gst-7、sod-3和hsp16.2的表達(dá)也均無明顯影響（圖5-E），說明茯苓多糖的抗氧化活性可能與調(diào)控skn-1 轉(zhuǎn)錄因子及其下游的抗氧化基因gst-4、gst-7有關(guān)。進(jìn)一步提示茯苓多糖可能通過skn-1 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游抗氧化基因gst-4和gst-7來延長N2 線蟲壽命。為研究ROS 的減少是否與skn-1/Nrf2 信號通路有關(guān)，使用skn-1 突變體線蟲進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)40 μg/mL 茯苓多糖處理后內(nèi)源性ROS 水平?jīng)]有顯著性（圖5-F），說明茯苓多糖降低線蟲內(nèi)源性ROS 水平可能是由skn-1 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的。而在氧化應(yīng)激條件下，40 μg/mL 茯苓多糖處理SKN-1 突變體線蟲后內(nèi)源性ROS 水平也沒有顯著性（圖5-G），提示線蟲降低ROS 的產(chǎn)生可能是由skn-1 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的。綜上，茯苓多糖能延長線蟲壽命，其機制可能是通過調(diào)控skn-1 轉(zhuǎn)錄因子提高抗氧化能力從而減少內(nèi)源性ROS 的產(chǎn)生。

圖5 茯苓多糖通過skn-1 信號通路誘導(dǎo)氧化應(yīng)激抵抗 (±s, n = 50)Fig. 5 P. cocos polysaccharides induce oxidative stress resistance via skn-1 signaling pathway (±s, n = 50)

4 討論

中藥多糖發(fā)揮抗氧化作用主要體現(xiàn)在清除自由基和調(diào)控抗氧化酶或氧化酶活性2 方面?，F(xiàn)代研究表明，茯苓多糖是高效的抗氧化劑，可通過破壞反應(yīng)鏈，清除羥自由基、過氧化氫、超氧陰離子、一氧化氮等易誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷的自由基，緩解機體氧化應(yīng)激反應(yīng)，同時茯苓多糖可有效提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽還原酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶的活性，增加谷胱甘肽水平，限制脂質(zhì)過氧化和超氧陰離子的產(chǎn)生，降低氧化損傷，茯苓多糖為茯苓發(fā)揮抗氧化的主要藥效基礎(chǔ)，具有保護(hù)生物膜和延緩衰老的作用[31-32]。本研究發(fā)現(xiàn)，從茯苓中提取的茯苓多糖在秀麗隱桿線蟲中具有顯著的抗衰老活性。茯苓多糖處理后N2 線蟲的脂褐素、吞咽次數(shù)、蟲體擺動次數(shù)和對紫外輻射以及熱應(yīng)激抵抗能力等衰老指標(biāo)顯著提高，壽命顯著延長，體現(xiàn)出顯著的抗衰老作用。

在衰老的支持細(xì)胞中存在著多種改變，如ROS水平升高、炎癥狀態(tài)、DNA 受損、自噬受損、線粒體功能障礙等[33]。其中，氧化應(yīng)激和炎癥是中心環(huán)節(jié)。在本研究中，茯苓多糖處理線蟲后在氧化應(yīng)激條件下的存活時間顯著延長，脂褐素表達(dá)明顯下降，線蟲體內(nèi)ROS 水平顯著降低，說明茯苓多糖可能通過降低ROS 水平來調(diào)控秀麗隱桿線蟲抗衰老。

據(jù)報道，細(xì)胞對氧化應(yīng)激的防御反應(yīng)受到許多轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，包括skn-1 和daf-16[34-35]。茯苓多糖可以延長氧化應(yīng)激條件下daf-2、eat-2 2 種突變體線蟲的壽命，僅skn-1 突變體線蟲壽命未得到改善。結(jié)果表明，胰島素信號傳導(dǎo)（daf-2）、熱量限制（eat-2）與茯苓多糖的抗氧化活性無關(guān)。由外源性氧化劑或環(huán)境條件引起的ROS 生成和清除失衡被稱為氧化應(yīng)激，以秀麗隱桿線蟲死亡為特征。鑒于秀麗隱桿線蟲壽命的延長通常伴隨著抗應(yīng)激能力的增強，本研究進(jìn)行了抗氧化應(yīng)激和解毒基因的qRT-PCR檢測。sod-3 刺激線粒體呼吸體中的蛋白質(zhì)異構(gòu)化、活性和超氧自由基的清除[36]，gst-4 是一種谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，可促進(jìn)II 期解毒過程[37]。其表達(dá)受daf-16 和skn-1 調(diào)控[38]，gst-7 增加谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性，參與谷胱甘肽的制造和代謝，減少ROS 水平，通過解毒氧化應(yīng)激副產(chǎn)物對抗氧化應(yīng)激[39]，hsp16.2是由hsf-1 控制的熱休克蛋白，hsf-1 轉(zhuǎn)錄因子通過控制伴侶型熱休克蛋白的表達(dá)和在熱應(yīng)激下保持蛋白穩(wěn)態(tài)來保護(hù)機體免受熱休克，hsp16.2 的增加降低了谷胱甘肽水平，增強了未折疊蛋白結(jié)合活性，提高了抗熱應(yīng)激能力[40]。在秀麗隱桿線蟲中這些抗氧化基因與skn-1/Nrf2 途徑調(diào)控有關(guān)。已有研究表明，鐵皮石斛水提物通過激活skn-1 轉(zhuǎn)錄因子延長秀麗隱桿線蟲壽命作用及機制研究[41]。本研究結(jié)果表明，茯苓多糖能誘導(dǎo)生理和氧化應(yīng)激條件下skn-1從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的易位，并激活下游抗氧化基因gst-4 和gst-7 的表達(dá)，這可能與延長壽命有關(guān)。但茯苓多糖不能促進(jìn)生理和氧化應(yīng)激情況下skn-1 突變體線蟲下游gst-4 和gst-7 表達(dá)，也不能降低ROS的水平，進(jìn)一步證明茯苓多糖抗衰老的機制與調(diào)控skn-1/Nrf2 經(jīng)典抗氧化途徑有關(guān)。

綜上，茯苓多糖具有延長秀麗隱桿線蟲壽命，增強抗衰老的能力。機制研究表明，茯苓多糖可以促使skn-1 入核，上調(diào)相關(guān)抗氧化基因的表達(dá)，降低線蟲體內(nèi)活性氧自由基水平進(jìn)而增強其抗氧化應(yīng)激能力，延緩衰老速度，提示其很可能是一種有前景的天然抗衰老成分，值得進(jìn)一步研究。然而，在模式生物秀麗線蟲模型下的研究結(jié)果仍然是局限的，需要在哺乳動物和臨床試驗中進(jìn)一步證實茯苓多糖的抗衰老效應(yīng)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突