刁 卓，胡 沖 ，楊青山，張亞中 , *

1. 安徽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，安徽 合肥 230031

2. 安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽 合肥 230051

3. 國家藥監(jiān)局中藥質(zhì)量研究與評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230051

4. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012

黃精PolygonatiRhizoma為百合科植物滇黃精PolygonatumkingianumColl. et Hemsl.、黃精P.sibiricumRed.或多花黃精P.cyrtonemaHua 的干燥根莖[1]。具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎的功效[2]。用于脾胃氣虛、體倦乏力、胃陰不足等癥[3]。黃精作為安徽省特色道地中藥材，其使用歷史至今已逾兩千年，是著名的食療補(bǔ)益中藥[4]，其被視為傳統(tǒng)的中藥材，是融藥用、食用、觀賞為一體具有很高經(jīng)濟(jì)價值的植物[5]。主要含有黃精多糖、甾體皂苷類、木脂素類等成分，具有抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫、降血糖、抗菌和延緩衰老等作用[6]，其中多糖為黃精的主要藥效成分[7-9]。

黃精生品刺激性強(qiáng)，需蒸曬后方可入藥，且諸多本草學(xué)著作所記載的黃精炮制方法基本都是以“九蒸九曬”為主[10-12]。然而黃精在蒸曬過程中不僅外觀性狀發(fā)生了改變，其糖類成分也發(fā)生了明顯的改變[13-15]。雖然已經(jīng)有研究表明炮制對黃精多糖中單糖組成、相對分子質(zhì)量、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性的影響[16-17]，但基于糖類圖譜對于黃精炮制品多糖影響的綜合研究仍是必要的，這是一種有效的多糖分析方法，也是藥理活性研究的基礎(chǔ)。

為尋找不同蒸曬次數(shù)黃精多糖結(jié)構(gòu)特征變化規(guī)律，探討黃精炮制品多糖的變化，本實(shí)驗(yàn)建立了不同蒸曬次數(shù)的黃精炮制品多糖的高效薄層色譜（high thin-layer chromatography，HPTLC）、親水作用色譜-高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測器（hydrophilic interaction liquid chromatography-high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector，HILIC-HPLC-ELSD）和超高效液相色譜-四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（ultra high pressure liquid chromatography-quadrupole time of flight tandem mass spectrometry，UHPLC-QTOF/MS）多元指紋圖譜的方法，以果糖苷酶為特異性糖苷酶，所得酶解產(chǎn)物經(jīng)色譜分析，后采用相似度以及偏最小二乘-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）的分析方法，對不同蒸曬次數(shù)黃精多糖的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行差異性研究，以期闡釋不同蒸曬次數(shù)黃精炮制品的科學(xué)內(nèi)涵，為其質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Acquity UPLCTM型超高效液相色譜儀、Xevo G2 Q-Tof 質(zhì)譜儀，美國Waters 公司；U3000 型高效液相色譜儀，配備Allech ELSD 6000 型蒸發(fā)光散射檢測器，美國Dionex 公司；Elmasonic S 30（H）型超聲波清洗器，德國Elma 公司；ML204 型萬分之一電子天平、XP26 型百萬分之一電子天平，瑞士Mettler Toledo 公司；FD240 型電熱恒溫干燥箱，德國Binder 公司；XMTD205 型水浴鍋，常州國宇儀器制造有限公司；JW-3021HR 型高速冷凍離心機(jī)，安徽省嘉文儀器裝備有限公司；CAMAG-ATS4 型全自動點(diǎn)樣儀、Amga-7LC-Visualizer TLC 型數(shù)碼相機(jī)成像，瑞士Camag 公司；LGJ-10S 型真空冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；Millipore Simplicity-185 型超純水儀，美國Millipore 公司。

1.2 材料與試劑

硅膠G 板高效薄層板，批號1.05729，德國默克公司；對照品果糖（批號111504-201703，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%）、蔗糖（批號111507-202105，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%）、葡萄糖（批號110833-201908，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%），中國食品藥品檢定研究院；三氯甲烷（批號10006818）、醋酸乙酯（批號20210514）、冰醋酸（批號20211104）、正丁醇（批號20211026）、異丙醇（批號20171121）、苯胺（批號T20110218）、二苯胺（批號F20100728）、丙酮（批號T20110218）、乙醇（批號20211026）、氨水（批號20201225）、甲酸銨（批號91C2008AP）均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈（批號F22M7D201，色譜級）、乙腈（批號219087，質(zhì)譜級），美國Fisher Scientific公司；甲酸，批號C12122684，質(zhì)譜級，上海麥克林生化科技有限公司；磷酸，批號1849251，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；α-淀粉酶（批號S11GS160659）、果糖苷酶（批號J21M11K10978），上海源葉生物科技有限公司；黃酒，酒精度10% vol；總糖15.1～40.0 g/L，安徽海神黃酒集團(tuán)有限公司。

黃精采自安徽省池州市青陽縣，經(jīng)安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院張亞中教授鑒定，為百合科黃精屬植物多花黃精P.cyrtonemaHua 的干燥根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 不同蒸曬次數(shù)樣品的制備

選用個頭均勻的干黃精藥材（P0），除去雜質(zhì)，洗凈，切厚片，加20%黃酒（海神黃酒），置于帶蓋容器內(nèi)，不時翻動，使藥材能夠均勻吸收黃酒，待黃酒完全被藥材吸收（黃酒用量依據(jù)《中國藥典》2020 年版“酒黃精”項(xiàng)下“每100 kg 黃精，用黃酒20 kg”[2]）。再將藥材均勻擺放在有孔的托盤上，置于蒸鍋內(nèi)，首次蒸制藥材透心（約4 h），然后夜露1 晚，在45 ℃烘至表面不粘手為止（約4 h），再置于蒸鍋內(nèi)蒸2 h，依次進(jìn)行，如此反復(fù)蒸制共13 次。在炮制過程中，每蒸曬1 次進(jìn)行取樣，編號P1～P13，備用。記錄外觀火候，如圖1 所示。

圖1 不同蒸曬次數(shù)黃精性狀鑒別Fig. 1 Character identification of Polygonati Rhizoma with different steaming and drying times

2.2 黃精炮制品多糖的提取

將炮制后的黃精樣品置于烘箱中烘干至恒定質(zhì)量，并粉碎過三號篩。粉末于85%乙醇中浸泡24 h。濾過并離心，收集沉淀并烘干，加入15 倍的蒸餾水在80 ℃條件下超聲提取2 次，每次2 h，離心，上清液合并，濃縮至10 mL 左右。在濃縮液中加入多糖溶液體積2% α-淀粉酶，在60 ℃水浴下酶解4 h，反應(yīng)完成后，沸水浴滅酶10 min，除去淀粉。取上清液加相當(dāng)于其體積1/4 的Sevage 試劑，劇烈震搖，離心，重復(fù)以上操作直到無白色絮狀物產(chǎn)生為止。所得上清液加入無水乙醇（慢加快攪）至乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，置4 ℃冰箱中放置24 h，離心，倒去上清液。沉淀加95%乙醇洗滌2 次，每次10 mL，離心，得沉淀物，加熱水使沉淀溶解，冷凍干燥，得黃精粗多糖凍干粉。

2.3 供試品溶液的制備

取黃精炮制品多糖溶液（10 mg 多糖溶于4 mL純化水）0.6 mL 若干份，加入100 U/mL 果糖苷酶溶液，隨后將混合液置于40 ℃保溫16 h；反應(yīng)結(jié)束后，將混合液置于80 ℃加熱20 min，終止酶解；4 500 r/min 離心15 min 除去變性酶，上清液經(jīng)冷凍干燥（24 h）后即得酶水解產(chǎn)物。取酶水解產(chǎn)物，用60%乙醇1 mL 溶解制得供試品溶液后，作TLC 分析。取10 mg 黃精多糖，加20 mL 水制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 黃精多糖溶液，取5 mL 黃精多糖溶液與5 mL 100 U/mL 果糖苷酶溶液混合。

混合物在振蕩器中水解（55 ℃，200 r/min，3 h），并在80 ℃下加熱20 min 以使酶變性。4 500 r/min 離心（離心半徑8.56 cm）15 min，取上清液，干燥，溶解在2 mL 乙腈-水（1∶1）溶液后待HILICHPLC-ELSD 以及UHPLC-QTOF/MS 分析。

2.4 對照品溶液的制備

取果糖、蔗糖、葡萄糖約10 mg，精密稱定，轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，加水定容至刻度，分別配制成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL 的對照品溶液。

2.5 色譜條件

2.5.1 HPTLC 色譜條件 采用高效薄層色譜板（默克公司），展開劑為正丁醇-異丙醇-水-醋酸（7∶5∶2∶1），展開至95 mm，取出吹干，用苯胺-二苯胺顯色劑進(jìn)行顯色，顯色后放置于加熱板上105 ℃加熱10 min，在日光燈下觀察。

2.5.2 HILIC-HPLC-ELSD 色譜條件 U3000 型高效液相色譜儀（配備Allech ELSD 6000 蒸發(fā)光散射檢測器），色譜柱為Hypersil Gold? Pei HILIC HPLC（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水；洗脫程序：0～25 min，85%～65%乙腈；25～35 min，65%～50%乙腈；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.5.3 液質(zhì)聯(lián)用分析條件

（1）色譜條件：Acquity UPLCTM超高效液相色譜儀，色譜柱為Waters Cortecs HILIC 色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；流動相為乙腈-8 mmol/L 甲酸銨水溶液（pH 9.8），洗脫程序：0～10 min，12%乙腈；10～18 min，12%～20%乙腈；18～22 min，20%～25%乙腈；22～27 min，25%～30%乙腈；柱溫55 ℃；體積流量0.30 mL/min；進(jìn)樣體積2 μL。

（2）質(zhì)譜條件：Xevo G2 Q-Tof 質(zhì)譜儀，電噴霧電離（ESI-）；毛細(xì)管電壓為3 kV，錐孔電壓為30 V；離子源溫度為120 ℃，脫溶劑氣溫度為350 ℃；脫溶劑氣流量為500 L/h；碰撞氣體為氬氣；碰撞電壓20～50 V；掃描時間為0.2 s；質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 500，采用Leucine enkephalin 對采集過程進(jìn)行實(shí)時校準(zhǔn)。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 精密度試驗(yàn) 取P0 供試品1 份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，并記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積（以果糖的出峰時間和峰面積為參照，其他各峰出峰時間和峰面積與其的比值，下同），測得其共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于3.0%，表明該儀器系統(tǒng)精密度良好，符合指紋圖譜要求。

2.6.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取P0 供試品6 份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，測得各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于3.0%，同一樣品每次提取之間的結(jié)果比較一致，表明該提取方法重復(fù)性良好，符合指紋圖譜要求。

2.6.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份P0 供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，測得其共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)較穩(wěn)定，化學(xué)成分及含量不會發(fā)生改變，符合指紋圖譜要求。

2.7 數(shù)據(jù)處理與分析

采用ChemPattern 化學(xué)指紋和代謝組學(xué)系統(tǒng)解決方案軟件1.0 版掃描HPTLC 色譜圖上各條帶光密度值，生成電子掃描特征圖譜，隨后采用相似性評價系統(tǒng)創(chuàng)建各電子掃描特征圖譜共有模式圖譜，并計算各特征圖譜與共有模式圖譜之間的相關(guān)系數(shù)。采用SIMCA 13 統(tǒng)計軟件進(jìn)行PLS-DA。每個色譜峰對鑒別結(jié)果的影響由變量重要性投影（variable importance projection，VIP）值確定。

2.8 黃精炮制品HPTLC 指紋圖譜的建立

針對不同蒸曬次數(shù)的黃精炮制品使用專業(yè)軟件ChemPattern 化學(xué)指紋圖譜和代謝組學(xué)系統(tǒng)解決方案軟件（1.0 版）展開分析，發(fā)現(xiàn)隨著蒸曬次數(shù)的改變色譜峰發(fā)生了變化，這一發(fā)現(xiàn)也證實(shí)了日光下薄層色譜圖肉眼觀察所得出的結(jié)果。根據(jù)對照品比對可知，黃精生品（P0）薄層色譜中比移值0.42 處棕色斑點(diǎn)為果糖，由圖2 顯示，隨著蒸曬次數(shù)的變化，果糖斑點(diǎn)逐漸變淡，直至六蒸六曬（P6）時無法檢出。同時利用軟件將斑點(diǎn)信號轉(zhuǎn)化為色譜峰信號，如圖3 所示，黃精生品（P0）～至五蒸五曬（P5）時為7 個共有峰，而六蒸六曬（P6）之后比移值在0.42 處的色譜峰（果糖）同樣無法檢出。此外，六蒸六曬（P6）～十一蒸十一曬（P11）的樣品相較于黃精生品（P0）～五蒸五曬（P5）的樣品在比移值為0.09 處的色譜峰也有所減少，但十二蒸十二曬（P12）之后該比移值處的色譜峰又再次檢出。根據(jù)前處理可知，本實(shí)驗(yàn)是通過糖苷酶水解黃精多糖得到其特異性寡糖片段，故而隨著色譜峰的變化說明黃精炮制過程中糖類成分發(fā)生了變化。

圖2 黃精生品和炮制品的薄層鑒別圖Fig. 2 Thin layer identification of raw and processed Polygonati Rhizoma

圖3 黃精炮制品HPTLC 指紋圖譜Fig. 3 HPTLC fingerprint of processed Polygonati Rhizoma

采用ChemPattern 化學(xué)指紋和代謝組學(xué)系統(tǒng)解決方案軟件1.0 版中相似性評價系統(tǒng)對黃精炮制品進(jìn)行相似度評價，指定炮制0 次的生黃精（P0）指紋圖譜為參照圖譜。結(jié)果P0～P13 的相似度分別為1.000、0.995、0.959、0.998、0.955、0.745、0.619、0.588、0.512、0.515、0.516、0.518、0.518、0.518，相似度在0.512～0.998，結(jié)果表明，不同蒸曬次數(shù)的黃精炮制品較為分散。其中從六蒸六曬（P6）之后相似度低于0.620。表明不同蒸曬次數(shù)的黃精炮制品具有不同的HPTLC 指紋圖譜，由此可以推斷出各炮制品多糖之間結(jié)構(gòu)特征存在差異。

2.9 黃精炮制品多糖的HILIC-HPLC-ELSD 分析

將所得的14 批黃精炮制品指紋圖譜依次導(dǎo)入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件（2012 版）。以樣品P0 作為參照圖譜，時間窗寬度設(shè)為0.1 min，采用中位數(shù)法，利用多點(diǎn)校正法進(jìn)行峰匹配，生成對照圖譜（R），14 批黃精炮制品色譜圖與對照圖譜的疊加圖譜如圖4 所示，將黃精炮制品多糖水解產(chǎn)物指紋圖譜中共有峰的保留時間與單糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間比對，發(fā)現(xiàn)峰1、2、4 分別為果糖、葡萄糖和蔗糖。

圖4 果糖苷酶水解下黃精炮制品HPLC 指紋圖譜Fig. 4 HPLC fingerprint of processed Polygonati Rhizoma by hydrolysis of fructosidase

指定炮制0 次的生黃精（P0）指紋圖譜為參照圖譜，將蔗糖峰定為參照峰（峰4），結(jié)果表明，果糖苷酶酶解下的不同炮制規(guī)格的黃精樣品中色譜峰存在差異，果糖（峰1）峰面積呈逐漸減小的趨勢至六蒸六曬（P6）時果糖無法檢出，故除峰1 外樣品共有峰為16 個峰。樣品共有指紋峰相對保留時間及相對峰面積分析結(jié)果表明，不同樣品16 個共有峰相對保留時間的RSD 值均小于3%，說明不同炮制規(guī)格的樣品存在共有峰且各共有峰的保留時間穩(wěn)定，同時證明了采用酶解法成功得到了聚合度較高的特異性寡糖片段。

除蔗糖（峰4）其余共有峰相對峰面積的RSD值相差較大，說明不同蒸曬次數(shù)的黃精炮制品，隨著蒸曬次數(shù)的增加結(jié)構(gòu)特征發(fā)生改變。綜上所述，黃精不同炮制程度樣品之間存在著明顯的差異，黃精生品基線平穩(wěn)，黃精炮制品基線隨著蒸曬次數(shù)的增加出現(xiàn)波動。從樣品HPLC 指紋圖譜（圖4）中可以看出，黃精不同炮制程度樣品在0～7 min 峰形和峰位有明顯的區(qū)別，根據(jù)對照品比對可知是果糖隨著炮制次數(shù)的增加在發(fā)生改變。

2.10 黃精炮制品多糖的UHPLC-QTOF/MS 定性鑒定

取黃精供試品溶液，按“2.5.3”項(xiàng)下色譜條件對黃精炮制品中的低聚糖成分進(jìn)行定性分析，得到負(fù)離子模式下黃精質(zhì)譜總離子流圖，見圖5。結(jié)果表明，黃精炮制品多糖化學(xué)成分在負(fù)離子模式下具有較好的響應(yīng)，因此，本實(shí)驗(yàn)采用負(fù)離子模式進(jìn)行質(zhì)譜分析。在負(fù)離子模式下，準(zhǔn)分子離子峰一般為[M－H]-，根據(jù)tR、準(zhǔn)分子離子質(zhì)荷比、一級及二級MS 裂解信息，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[18-22]，共鑒定了7個低聚糖類成分，分別是蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖和蔗果八糖，見表2 和圖6。

表2 黃精低聚糖成分的UHPLC-Q-TOF/MS 鑒定Table 2 UHPLC-Q-TOF/MS identification of Polygonati Rhizoma oligosaccharides

圖5 黃精多糖酶水解產(chǎn)物在負(fù)離子模式下的總離子流圖Fig. 5 Total ion flow diagram of Polygonati Rhizoma polysaccharide enzymatic hydrolysate in negative ion mode

圖6 黃精多糖酶水解產(chǎn)物中寡糖的二級質(zhì)譜圖Fig. 6 MS/MS spectrum of oligosaccharides in Polygonati Rhizoma polysaccharide enzymatic hydrolysate

2.11 PLS-DA

使用專業(yè)軟件ChemPattern 軟件（1.0 版）將上述HPTLC 指紋圖譜的數(shù)據(jù)繼續(xù)采用多元統(tǒng)計分析模塊中的PLS-DA 進(jìn)行分析，該模型中，RY2和Q2的值大于0.5，且RY2和Q2的值越趨近于1，說明該P(yáng)LS-DA 模型的預(yù)測能力越好。分析結(jié)果如圖7 所示，把黃精生品（P0）～五蒸五曬（P5）分為1 一組，六蒸六曬（P6）～十一蒸十一曬（P11）分為第2 組，十二蒸十二曬（P12）、十三蒸十三曬（P13）分為第3 組。

圖7 黃精炮制品偏最小二乘判別分析圖Fig. 7 PLS-DA chart of processed Polygonati Rhizoma

采用黃精炮制品多糖的HILIC-HPLC-ELSD 分析結(jié)合VIP 法，篩選出了具有統(tǒng)計學(xué)意義的7 個差異標(biāo)志物（VIP＞1）見圖8，其影響程度依次為峰17＞峰15＞峰1＞峰7＞峰10＞峰3＞峰5。結(jié)合不同炮制程度樣品共有指紋峰相對峰面積結(jié)果可知，7 個差異標(biāo)志成分峰17、15、1、7、10、3、5 所占比例均小于生品，說明在炮制過程中黃精多糖發(fā)生了水解反應(yīng)，導(dǎo)致隨著蒸曬次數(shù)的增加黃精多糖中的結(jié)構(gòu)特征發(fā)生了變化。另外，從六蒸六曬（P6）～十三蒸十三曬（P13）除峰1（果糖）無法檢出外，峰17、15、7、10、3、5 這7 個色譜峰代表的成分呈先降低后增高的趨勢，具體體現(xiàn)為在六蒸六曬（P6）～十一蒸十一曬（P11）時逐漸降低，而十二蒸十二曬（P12）之后有所回升，這一發(fā)現(xiàn)與薄層指紋圖譜所得到的結(jié)果相吻合，提示經(jīng)過六蒸六曬（P6）與十二蒸十二曬（P12）后黃精化學(xué)成分發(fā)生變化。

圖8 果糖苷酶水解下黃精炮制品PLS-DA 分析結(jié)果VIP 圖Fig. 8 VIP chart of PLS-DA analysis of processed Polygonati Rhizoma under fructosidase hydrolysis

3 討論

目前，《中國藥典》2020 年版[2]中黃精項(xiàng)下規(guī)定以黃精多糖的含量作為黃精質(zhì)量評價指標(biāo)。但是研究表明黃精在炮制過程中，發(fā)生了美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生了一定量的酸，在高溫條件下，黃精中多糖發(fā)生水解反應(yīng)，導(dǎo)致了炮制品中多糖的含量降低，單糖的含量增加。本課題組曾在前期研究[23]中發(fā)現(xiàn)隨著蒸曬次數(shù)的增加，黃精雙糖、單糖含量在炮制過程中呈現(xiàn)先增加后遞減的趨勢。在此基礎(chǔ)之上，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對于黃精炮制前后多糖的變化展開研究，相較于特異性差的苯酚硫酸法，首次采用果糖苷酶水解黃精炮制品中多糖的方法對于不同蒸曬次數(shù)的黃精進(jìn)行差異性分析，發(fā)現(xiàn)不同蒸曬次數(shù)的黃精炮制品在結(jié)構(gòu)特征方面存在差異。

采用HPTLC、HILIC-HPLC-ELSD 和UHPLCQTOF/MS 對黃精炮制前后成分進(jìn)行快速識別，并結(jié)合化學(xué)模式識別方法對黃精炮制前后成分進(jìn)行分析，建立了一種靈敏、快速的分析方法。其中HPTLC結(jié)果表明，六蒸六曬（P6）與十二蒸十二曬（P12）為黃精炮制過程中的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，這一發(fā)現(xiàn)提示，黃精不同蒸曬次數(shù)的炮制品藥效可能隨之發(fā)生了改變。HILIC-HPLC-ELSD 分析成功得到了17 組特異性寡糖片段，含果糖、蔗糖、葡萄糖等，但在果糖苷酶水解作用下，黃精炮制品中果糖（峰1）差異明顯至六蒸六曬（P6）時無法檢出，說明黃精多糖在炮制過程中特異性寡糖片段發(fā)生了變化，此外共有峰相對保留時間及相對峰面積分析結(jié)果表明，黃精樣品隨著蒸曬次數(shù)的增加結(jié)構(gòu)特征發(fā)生了改變。后采用UHPLC-QTOF/MS 技術(shù)可進(jìn)一步從黃精炮制品中得到蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖和蔗果八糖。

本研究不同于之前的報道中，多針對九蒸九曬（P9）樣品進(jìn)行差異性比較[24-25]，課題組在九蒸九曬（P9）的基礎(chǔ)上增添至十三蒸十三曬（P13），對于黃精糖類成分的變化趨勢分析更為透徹。結(jié)合PLSDA 將不同蒸曬次數(shù)黃精炮制品分為了3 類，結(jié)果也再次印證了六蒸六曬（P6）和十二蒸十二曬（P12）是黃精炮制過程中的轉(zhuǎn)折，而VIP 值結(jié)果表明，峰17、15、1、7、10、3、5 可以作為黃精蒸制的標(biāo)志物。綜上所述，黃精的蒸制過程不僅使黃精多糖的含量減少，還會使其出現(xiàn)降解、聚集、解聚的現(xiàn)象[26]，后續(xù)可以進(jìn)一步考察黃精炮制品糖類成分變化與藥理藥效之間的關(guān)系，并增大相對分子質(zhì)量掃描范圍，更為全面的解析黃精多糖中存在的化合物。

此外，本研究所建立的方法不需要糖分析中常用的試劑還原、衍生化或柱后加成，首次采用可以分離特異性寡糖片段的酶解法對不同蒸曬次數(shù)的黃精多糖展開研究，得到了更為豐富的糖類成分變化的信息，所建立的指紋圖譜與黃精炮制品多糖的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)特征相關(guān)，未來基于結(jié)構(gòu)特征的多元指紋圖譜以及化學(xué)計量學(xué)分析可成為通過提供更全面的信息來控制多糖質(zhì)量更為有效的策略，對于黃精多糖產(chǎn)品的質(zhì)量控制具有較大的實(shí)用價值，也為其他中草藥多糖的研究提供了新的視角。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突