張 潔 ，張巧鈴 ，盧鳳來(lái)，宋靜茹，劉宏偉，蔣小華*

1. 沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016

2. 廣西植物功能物質(zhì)與資源持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所，廣西 桂林 541006

羅漢果Siraitiagrosuenorii(Swingle) C. Jeffrey ex A. M. Lu et Z. Y. Zhang 為葫蘆科羅漢果屬藤本植物，主要分布于我國(guó)西南地區(qū)，其果實(shí)為廣西的道地藥材。羅漢果始載于《嶺南采藥錄》，1987 年被國(guó)家衛(wèi)生部列為首批藥食同源中藥材，其果實(shí)為常用的藥用部位，具有止咳化痰、潤(rùn)腸通便等功效。羅漢果塊根肥大，味苦、性微寒[1]，民間用于治頑癬、癰腫、瘡癤等，具有葫蘆烷型四環(huán)三萜、多糖等活性成分[2-3]。然而，有關(guān)羅漢果根的化學(xué)成分及藥理活性研究明顯不足，導(dǎo)致其未得到充分利用，每年有大量的根被丟棄，造成極大的資源浪費(fèi)。

現(xiàn)代研究表明多種植物多糖具有雙向調(diào)節(jié)的免疫作用，一定濃度范圍的多糖可以增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫和特異性免疫[4]。巨噬細(xì)胞是機(jī)體非特異性免疫的重要組成部分，在炎癥反應(yīng)和宿主防御中發(fā)揮著重要作用。已有報(bào)道表明羅漢果的果實(shí)多糖具有抗氧化、保護(hù)糖尿病腎病小鼠、增強(qiáng)免疫功能等作用[3,5-6]，而對(duì)根多糖的研究較少。本課題組前期通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)羅漢果根粗多糖可以增加小鼠胸腺器官指數(shù)，推測(cè)其具有免疫調(diào)節(jié)的潛力[3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)提取與分離純化，從羅漢果根中獲得均一多糖并進(jìn)行了初步的結(jié)構(gòu)分析，同時(shí)采用巨噬細(xì)胞研究其免疫調(diào)節(jié)活性，為羅漢果根多糖的開(kāi)發(fā)利用提供了新的研究思路與技術(shù)儲(chǔ)備。

1 材料

1.1 主要材料與試劑

羅漢果根采自廣西壯族自治區(qū)桂林市永?？h，經(jīng)盧鳳來(lái)副研究員鑒定為葫蘆科羅漢果屬植物羅漢果S.grosvenorii(Swingle) C. Jeffrey 的塊根。對(duì)照品D-無(wú)水葡萄糖（批號(hào)MUST-22030214，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%）、D-甘露糖（批號(hào)MUST-23012802，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%）、D-核糖（批號(hào)MUST-23021307，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98% ）、D- 葡萄糖醛酸（ 批號(hào)MUST-23021309，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、L-鼠李糖（批號(hào)MUST-22061104，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%）、D-半乳糖醛酸（批號(hào)MUST-23021308，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、D-半乳糖（批號(hào)MUST-22061105，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、DL-阿拉伯糖（批號(hào)MUST-22022819，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%），購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)品右旋糖酐系列D0（批號(hào)140637-201203）、D1（批號(hào)140638-201203）、D2（批號(hào)140639-201203）、D3 （ 批號(hào) 140640-201203 ）、 D4 （ 批號(hào)140641-201203）、 D5（批號(hào)140642-201203）、D6（批號(hào)140643-201203）、D7（批號(hào)140644-201203）、D8 （ 批號(hào) 140645-201203 ）、 D2000 （ 批號(hào)140646-201203），相對(duì)分子質(zhì)量（Mw）分別為180、2 500、4 600、7 100、1.0×104、2.14×104、4.11×104、8.44×104、1.338×105、2.0×106，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；CCK-8 檢測(cè)試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測(cè)試劑盒和白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）檢測(cè)試劑盒（Ela bscience 公司）；一氧化氮（NO）檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），HPD100 大孔吸附樹(shù)脂（賽譜銳思（北京）科技有限公司）；DEAE-52 纖維素（上海源葉生物科技有限公司）；Sephadex LH-20 凝膠（美國(guó)GE 公司）；MD55 透析袋 [賽譜銳思（北京）科技有限公司]；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Waters 515 型液相色譜儀（配置Waters 2410 示差檢測(cè)器，Waters 公司）；LC-2030C 型液相色譜儀（日本島津公司）；Nicolet 傅里葉紅外光譜儀（美國(guó)Therom Fisher 公司）；Brucker Avance500MHz 超導(dǎo)核磁共振波譜儀（德國(guó)Brucker公司）；ALPHA1-2LD PLU 冷凍干燥機(jī)（北京博勱行儀器有限公司）；SP-756P 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)Spectrum 公司）；Zeiss EVO18 型掃描電子顯微鏡（德國(guó)Zeiss公司）；Spark 酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司）；BSP-150型生化培養(yǎng)箱（上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Forma 公司）；Dmi1 倒置相差顯微鏡（美國(guó)徠卡公司）。

2 方法

2.1 羅漢果根多糖的分離純化

取500 g 干燥的羅漢果根塊粉碎過(guò)20 目篩，加入10 倍量的95%乙醇溶液回流脫脂（2 h、2 次），殘?jiān)稍锖?，加? 倍量的水于70 ℃水浴中加熱回流提?。? h、2 次）。提取液濾過(guò)后，合并濾液，55 ℃真空濃縮至原體積的1/4，過(guò)AB-8 大孔樹(shù)脂脫色，水洗部分濃縮，加入4 倍體積的95%乙醇溶液進(jìn)行沉淀，4 ℃靜置12 h，4 000 r/min 離心10 min，得到粗多糖LGP。LGP 加水溶解，采用Sevage法[7]脫蛋白，重復(fù)5 次，直至無(wú)明顯蛋白質(zhì)為止。脫蛋白后的LGP 依次用30%、50%、70%、90%乙醇進(jìn)行分級(jí)醇沉，分別得到LGP1～LGP4。將70%醇沉部位LGP3 溶解上DEAE-52 柱（42 cm×2.1 cm），依次用水和0.05、0.1、0.15、0.3、0.5 mol/L氯化鈉梯度洗脫，體積流量為1.0 mL/min，7 min/管收集，采用苯酚-硫酸法檢測(cè)吸光度（A）值，繪制洗脫曲線，根據(jù)洗脫峰收集組分，減壓濃縮，透析（截留相對(duì)分子質(zhì)量3 000）后冷凍干燥得粗多糖LGP3-1～LGP3-6。0.15 mol/L 洗脫組分LGP3-3 經(jīng)Sephadex LH-20 柱（65 cm×1.4 cm）純化，25%乙醇等度洗脫，體積流量為0.5 mL/min。透析后冷凍干燥得羅漢果根多糖LGP-A。

2.2 LGP-A 結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 純度和相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定 采用紫外全波長(zhǎng)掃描的方法檢驗(yàn)多糖的純度。取2.0 mg 干燥樣品溶于純水中，配成0.5 mg/mL 的多糖溶液，以純水作為空白對(duì)照。在190～400 nm 進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。

采用高效凝膠色譜法（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）測(cè)定多糖Mw。取干燥L(fēng)GP-A、D0、D2、D4、D6、D7、D8、D2000等葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，加水溶解，配成1 mg/mL 的溶液，離心，液相分析[8]。HPLC 條件：TSK-gel G5000PWXL色譜柱（7.8 mm×30 cm，10 μm），流動(dòng)相為超純水，柱溫為30 ℃，體積流量為0.5 mL/min；RID 10A型示差檢測(cè)器，進(jìn)樣量為20 μL。以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)（X），Mw對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算LGP-A 的Mw。

2.2.2 單糖組成分析 采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）-柱前衍生HPLC 測(cè)定單糖組成。取多糖樣品1.25 mg，加1.25 mL 2 mol/L 的三氟乙酸溶解，搖勻，封口，110 ℃水解3 h，冷卻后加2 mL甲醇，減壓蒸干，重復(fù)5 次以除去多余的三氟乙酸。取多糖樣品和單糖對(duì)照品200 μL，加0.5 mol/L 的PMP-甲醇溶液200 μL 和0.3 mol/L 的NaOH 溶液200 μL，于70 ℃烘箱中避光反應(yīng)100 min 進(jìn)行衍生化。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，加0.3 mol/L 鹽酸溶液250 μL，混勻，加三氯甲烷萃取5 次，棄下層，除去過(guò)量的PMP，在10 000 r/min 離心，上清液放入4 ℃保存，待HPLC 檢測(cè)[9]。

混合單糖對(duì)照品溶液制備：分別吸取已衍生化的1 mg/mL 的單糖對(duì)照品溶液各10 μL，混合均勻，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

HPLC 條件：ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.2）15∶85；柱溫為30 ℃，體積流量為0.8 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

2.2.3 FT-IR 分析 稱取干燥L(fēng)GP-A 樣品1.5 mg，干燥溴化鉀150 mg，于真空干燥器干燥過(guò)夜。在紅外燈下混合，研磨均勻，壓片，在4 000～400 cm-1進(jìn)行紅外掃描。

2.2.4 NMR 分析 取樣品LGP-A 約25 mg 溶于0.5 mL D2O 中，用Bruker AVANCE III 500 MHz 超導(dǎo)核磁共振儀測(cè)定 1D-NMR（1H- 和13C-NMR）和2D-NMR（HSQC、1H-1H COSY 及HMBC），通過(guò)HSQC 對(duì)C-H 進(jìn)行歸屬，1H-1H COSY 連接單糖骨架，HMBC 確定糖的連接方式。

2.2.5 剛果紅實(shí)驗(yàn) 取干燥樣品，加水配成0.5 mg/mL 的多糖溶液，與200 μmol/L 的剛果紅溶液混合均勻。加入適量體積1.0 mol/L 的NaOH 溶液使其最終濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L。室溫避光反應(yīng)10 min，使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，以NaOH 濃度為橫坐標(biāo)（X），最大吸收波長(zhǎng)為縱坐標(biāo)（Y）繪制折線圖[10]。

2.2.6 掃描電子顯微鏡（ scanning electron microscope，SEM）分析 稱取1.5 mg 干燥樣品，使用熱場(chǎng)發(fā)射SEM 來(lái)分析LGP-A 的微觀形態(tài)。

2.3 LGP-A 對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 免疫作用的影響

2.3.1 RAW264.7 細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn) 采用CCK-8 法檢測(cè)多糖對(duì)細(xì)胞增殖的影響，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將其調(diào)整為1×105個(gè)/mL 接種于96 孔板中，在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)24 h。給藥組每孔加入不同質(zhì)量濃度的多糖溶液（0.625、1.25、2.5、5.0 μg/mL）、陽(yáng)性對(duì)照組加入1.0 μg/mL 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）溶液、對(duì)照組（具有細(xì)胞）和背景組（無(wú)細(xì)胞）加入相同體積的完全培養(yǎng)基，每組3 個(gè)復(fù)孔，給藥后培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL CCK-8 溶液，在37 ℃孵育45 min，酶標(biāo)儀450 nm 下檢測(cè)A值。按下述公式計(jì)算細(xì)胞增殖率。

細(xì)胞增殖率＝(A給藥－A0)/(A1－A0)

A給藥為給藥組平均A值；A0為背景組平均A值；A1為對(duì)照組平均A值

2.3.2 RAW264.7 細(xì)胞吞噬能力 采用中性紅實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RAW264.7 細(xì)胞吞噬能力，具體方法參考文獻(xiàn)報(bào)道[11]，略有改動(dòng)。

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將其調(diào)整為1×105個(gè)/mL 接種于96 孔板中，在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)24 h。給藥組每孔加入相同體積不同濃度的多糖溶液（0.625、1.25、2.5、5 μg/mL）、陽(yáng)性對(duì)照組加入1.0 μg/mL LPS 溶液、對(duì)照組加入相同體積的完全培養(yǎng)基，每組3 個(gè)復(fù)孔，給藥后培養(yǎng)24 h。棄上清液，磷酸緩沖液（PBS）清洗2 次，每孔加0.05%中性紅溶液100 μL 培養(yǎng)1 h，棄上清液，PBS清洗2 次，加細(xì)胞裂解液（冰醋酸-無(wú)水乙醇1∶1）100 μL 室溫放置1 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)540 nm 下A值。吞噬率采用以下公式進(jìn)行計(jì)算。

吞噬率＝A給藥/A對(duì)照

2.3.3 RAW264.7 細(xì)胞NO、TNF-α、IL-6 分泌量 采用Griess 法檢測(cè)LGP-A 對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞NO 分泌量的影響。細(xì)胞培養(yǎng)與給藥方法按“2.3.1”項(xiàng)下進(jìn)行，給藥后培養(yǎng)24 h。取上清液按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)540 nm 下A值。

采用ELISA 法檢測(cè)LGP-A 對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6 分泌量的影響。細(xì)胞培養(yǎng)、給藥方法同上。按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm下A值。

3 結(jié)果與分析

3.1 LGP-A 分離純化

羅漢果根干燥粉末經(jīng)95%乙醇脫脂，70 ℃熱水提取醇沉、脫蛋白后，濃縮，干燥得羅漢果根粗多糖LGP，得率為1.3%（基于羅漢果根原料質(zhì)量計(jì)算）。經(jīng)不同的乙醇進(jìn)行分級(jí)醇沉，分別得到LGP1～LGP4。將70%醇沉部位LGP3 上DEAE-52纖維離子交換柱，分別用0.05、0.1、0.15、0.2 和0.5 mol/L 氯化鈉洗脫，采用苯酚-硫酸法檢測(cè)A值并繪制吸收曲線（圖1-A），得LGP3-1～LGP3-6。分析后發(fā)現(xiàn)0.15 mol/L 氯化鈉洗脫部位（LGP3-3）分離度較高，選擇該部位繼續(xù)純化。經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜進(jìn)一步純化，得到1 個(gè)均一的羅漢果根多糖LGP-A，得率為0.13%（基于粗多糖質(zhì)量計(jì)算）。

圖1 LGP3 的DEAE-52 纖維素 (A) 與Sephadex LH-20(B) 柱色譜純化洗脫曲線Fig. 1 Column chromatography purification elution curves of LGP3 by DEAE-52 (A) and Sephadex LH-20 (B)

3.2 LGP-A 結(jié)構(gòu)表征

3.2.1 純度和相對(duì)分子質(zhì)量分析 核酸和蛋白質(zhì)在紫外光譜中的特征吸收峰分別是260、280 nm，因此通過(guò)紫外掃描的方法可以確定多糖中蛋白質(zhì)、核酸和肽類等雜質(zhì)的含量。如圖2-A 可看出LGP-A在230 nm 處存在最大吸收，在260～280 nm 未出現(xiàn)明顯吸收峰，表明其不含蛋白質(zhì)、核酸等雜質(zhì)。LGP-A 經(jīng)HPGPC 法鑒定純度，結(jié)果顯示有一對(duì)稱性良好的單一色譜峰，保留時(shí)間為10.386 min（圖2-B），說(shuō)明多糖Mw分布均一。以已測(cè)定Mw的葡聚糖對(duì)照品保留時(shí)間為橫坐標(biāo)（Х），lgMw為縱坐標(biāo)（Y），得葡聚糖對(duì)照品回歸方程為Y＝-0.223 9Х＋8.588 3（R2＝0.978 4），計(jì)算LGP-A 的Mw為1.83×106。

圖2 LGP-A 紫外全波長(zhǎng)掃描 (A) 及Mw 分布 (B)Fig. 2 UV full wavelength scanning analysis (A )and molecular weight determination of LGP-A (B)

3.2.2 單糖組成分析 單糖組成分析是多糖的結(jié)構(gòu)表征及生物活性研究必不可少的部分，對(duì)于功能性多糖的質(zhì)量控制也具有一定的意義。LGP-A 單糖組成分析結(jié)果見(jiàn)圖3，通過(guò)與單糖混合對(duì)照品進(jìn)行比較，推測(cè)出LGP-A 主要由半乳糖、阿拉伯糖組成，其百分比為51.23∶44.68，此外還含有微量甘露糖、葡萄糖醛酸等單糖。結(jié)果表明，LGP-A 是一種阿拉伯半乳聚糖。

圖3 LGP-A 單糖組成成分分析液相色譜圖Fig. 3 Liquid chromatogram of monosaccharide composition analysis of LGP-A

3.2.3 FT-IR 分析 采用FT-IR 光譜測(cè)定了LGP-A在4 000～500 cm-1的紅外吸收光譜，結(jié)果如圖4 所示，在3 302.79、2 929.89 cm-1處分別為O-H 的伸縮振動(dòng)峰[12]和C-H 伸縮振動(dòng)峰[13]，是糖類物質(zhì)的2 個(gè)特征吸收峰；1 645.12 cm-1是羧基的C＝O 非對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，說(shuō)明存在結(jié)合水[14]；1 400～1 200 cm-1是C-H 角變振動(dòng)峰；1 405 cm-1是C-H 面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰；1 075、1 046 cm-1是C-O-C 和C-O-H 伸縮振動(dòng)和環(huán)振動(dòng)峰重疊而成[15-16]，說(shuō)明存在吡喃糖；899 cm-1吸收峰說(shuō)明存在β-糖苷鍵[17]。

圖4 LGP-A 的FT-IR 光譜圖Fig. 4 FT-IR spectrum of LGP-A

3.2.4 NMR 分析 在1H-NMR 譜中，通常α 型糖苷的異頭氫化學(xué)位移大于δ5.0，β 型一般小于δ5.0[18-19]，圖5-a 給出LGP-A 的1H-NMR 信號(hào)，δ4.50～5.39是異頭氫信號(hào)，其余的氫信號(hào)堆積在δ3.00～4.30內(nèi)，相互交叉重疊。由于存在偶合和裂分，從1H-NMR 譜中還不能確定異頭氫的位置，需要借助HSQC 來(lái)確定。在13C-NMR 譜中，糖的異頭碳位于較低場(chǎng)，δ95～110，此范圍內(nèi)有幾個(gè)信號(hào)，表示有幾種單糖組成，但是同一種單糖在多糖中的位置比較接近，幾乎重疊[18,20]，圖5-b 給出LGP-A 的13CNMR，在δ99～110 是異頭碳信號(hào)，δ84～60 為L(zhǎng)GP-A 單糖殘基C2～C6信號(hào)位移的重疊。結(jié)合LGP-A 的HSQC 譜（圖5-d），可以清晰地找到8個(gè)異頭氫和異頭碳的偶合信號(hào)，分別為A：C1-H1(109.3/5.26)、B：C1-H1(108.0/5.39)、C：C1-H1(107.5/5.09)、D：C1-H1(107.2/5.21)、E：C1-H1(103.7/4.69)、F：C1-H1(103.3/4.52)、G：C1-H1(102.8/4.54)、H：C1-H1(99.5/5.01)。結(jié)合單糖組成分析可以初步判斷LGP-A中主要以α糖苷鍵連接的呋喃型阿拉伯糖和β 糖苷鍵連接的吡喃型半乳糖構(gòu)成。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[21-23]δ109.3/5.26、108.0/5.39、107.5/5.09、107.2/5.21 是α-L-Araf的信號(hào)；而δ103.7/4.69、103.3/4.52、102.8/4.54 是β-D-Galp的信號(hào)，δ99.5/5.01 是α-D-Galp的信號(hào)，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 羅漢果根多糖LGP-A 的核磁數(shù)據(jù)Table 1 13C-NMR and 1H-NMR data of LGP-A

圖5 LGP-A 的1H NMR (a)、13C NMR (b)、1H-1H COSY (c)、HSQC (d) 和HMBC(e) 譜Fig. 5 1H-NMR (a), 13C-NMR (b), 1H-1H COSY (c), HSQC (d) and HMBC (e) spectra of LGP-A

以殘基A 為例，1H-1H COSY 譜中顯示的相關(guān)信號(hào)有δH5.26/δH4.23、δH4.23/δH3.97、δH3.97/δH4.14、δH4.14/δH3.83、δH4.14/δH3.73，分別為A 殘基 H1-H2、H2-H3、H3-H4、H4-H5a、H4-H5b的相關(guān)信號(hào)，表明A 殘基的H2～H5化學(xué)位移分別為δH4.23、3.97、4.14、3.83、3.73。此外，根據(jù)HSQC譜圖可以看到δ5.26/109.3、4.23/81.4、3.97/76.6、4.14/83.9、3.83, 3.73/61.4 的交叉峰，由此推斷出A殘基的C2～C5化學(xué)位移分別為81.4、76.6、83.9、61.4。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[21-22,24]中殘基化學(xué)位移信息可推斷殘基A 為阿拉伯糖殘基，其連接方式為T-α-LAraf。采用以上方法及參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[21-22,24-27]對(duì)其余7 個(gè)糖殘基的其余信號(hào)進(jìn)行歸屬如下：→3)-α-L-Araf-(1→（B）、→5)-α-L-Araf-(1→（C）、→3,5)-α-L-Araf-(1→（D）、→3)-β-D-Galp-(1→（E）、→3,6)-β-D-Galp-(1→（F）、→6)-β-D-Galp-(1→（G）、→3)-α-D-Galp-(1→（H）。8 種殘基的化學(xué)位移值歸納如表1 所示。

根據(jù)HMBC 光譜確認(rèn)相鄰糖基殘基之間的糖苷鍵，在LGP-A 的HMBC 光譜（圖5-e）中，δ69.9/4.52 處的交叉峰代表→3,6)-β-D-Galp-(1→（F）的C-6 和→3,6)-β-D-Galp-(1→（F）的H-1 相關(guān)；δ69.9/4.54 處的交叉峰代表→6)-β-D-Galp-(1→（G）的C-6 和→6)-β-D-Galp-(1→（G）的H-1 相關(guān)；δ103.3/3.77、103.3/3.66 處的交叉峰代表→3,6)-β-DGalp-(1→（F）的C-1 和→3,6)-β-D-Galp-(1→（F）的H-6a、H-6b 相關(guān)；以上信息表明LGP-A 中含有→3,6)-β-D-Galp-(1→和→6)-β-D-Galp-(1→殘基，且多糖中殘基F 的連接以1，6 位C 相連。δ83.9/5.26 處的交叉峰代表→3,6)-β-D-Galp-(1→（F）的C-3 與T-α-LAraf（A）的H-1 相關(guān)。表明殘基A 的C-1 與殘基F的C-3相連；δ107.5/5.26處的交叉峰表明→5)-α-LAraf-(1→（C）的C-1 和T-α-L-Araf（A）的H-1 相關(guān)；δ83.9/5.09 處的交叉峰表明→3,6)-β-D-Galp-(1→（F）的C-3 和→5)-α-L-Araf-(1→（C）的H-1相關(guān)；δ66.9/5.09 處的交叉峰表明→5)-α-L-Araf-(1→（C）的C-5 和→5)-α-L-Araf-(1→（C）的H-1 相關(guān)。δ76.6/5.09 處的交叉峰表明T-α-L-Araf（A）的C-3和→5)-α-L-Araf-(1→（C）的H-1 相關(guān)；δ84.1/5.26處的交叉峰表明T-α-L-Araf（A）的H-1 和→3,5)-α-LAraf-(1→（D）的C-3 相關(guān)；基于上述結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道[21-27]，推斷LGP-A 是一種阿拉伯半乳聚糖，且主鏈?zhǔn)荈 的C-1 與C-6 相連，另2 個(gè)主要?dú)埢鵄、C 都是C-1 與主鏈中F 的C-3 相連。

由于多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，NMR 譜圖中信號(hào)重疊嚴(yán)重，采用NMR 分析結(jié)構(gòu)只能初步推測(cè)糖殘基之間的連接方式，很難準(zhǔn)確判斷糖苷鍵連接位點(diǎn)。后續(xù)課題組將繼續(xù)對(duì)LGP-A 的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，采用甲基化等分析手段進(jìn)一步表征多糖結(jié)構(gòu)。

3.2.5 剛果紅實(shí)驗(yàn) 若1 個(gè)多糖具有三螺旋結(jié)構(gòu)與剛果紅試劑混合后會(huì)發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，混合溶液的最大吸收波長(zhǎng)（λmax）向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，即紅移。氫氧化鈉可以破壞多糖三螺旋結(jié)構(gòu)，因此隨著氫氧化鈉濃度升高混合溶液λmax逐漸減小，即藍(lán)移[28]。從圖6中可以看到LGP-A 與剛果紅混合后λmax未發(fā)生顯著性紅移，且隨氫氧化鈉濃度升高，混合溶液與剛果紅單一溶液λmax變化趨勢(shì)相似，因此判斷LGP-A不含三螺旋結(jié)構(gòu)。

圖6 LGP-A 剛果紅實(shí)驗(yàn)Fig. 6 Congo Red experiment of LGP-A

3.2.6 SEM 分析 如圖7 所示，LGP-A 在掃描電鏡下呈現(xiàn)出帶孔的片狀堆疊，表面緊密，說(shuō)明其分子間及分子鏈間相互作用較強(qiáng)，其結(jié)構(gòu)有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，另有少量棒狀結(jié)構(gòu)，說(shuō)明LGP-A 排布不規(guī)律，規(guī)整性不強(qiáng)，可能為無(wú)定型結(jié)構(gòu)。

圖7 LGP-A 的SEM 圖Fig. 7 SEM of LGP-A

3.3 LGP-A 細(xì)胞免疫活性

3.3.1 對(duì)細(xì)胞增殖的影響 用 CCK-8 法檢測(cè)LGP-A 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞增殖率的影響，結(jié)果如圖8-A 所示，與對(duì)照組相比，LGP-A 質(zhì)量濃度在0.625～5.0 μg/mL 對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性作用，亦未顯著促進(jìn)RAW264.7 細(xì)胞增殖。因此采用0.625～5.0 μg/mL 質(zhì)量濃度的多糖溶液進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

圖8 LGP-A 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞的增殖活性 (A)、吞噬中性紅 (B) 及釋放NO (C)、TNF-α (D) 和IL-6 (E) 的影響(± s , n=3)Fig. 8 Effects of LGP-A on proliferation (A), phagocytosis of neutral red (B), release of NO (C), TNF-α (D) and IL-6 (E) of RAW264.7 cells (± s , n=3)

3.3.2 對(duì)細(xì)胞吞噬能力的影響 巨噬細(xì)胞的吞噬作用是非特異性免疫在病原體入侵時(shí)的最初反應(yīng)，巨噬細(xì)胞吞噬病原體后不僅可以激活特異性免疫，對(duì)炎癥的消退也起到重要作用。因此，巨噬細(xì)胞的吞噬能力可以作為機(jī)體免疫防御水平的指標(biāo)之一。有研究表明，中藥多糖能夠提高巨噬細(xì)胞吞噬能力，增強(qiáng)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)能力。LGP-A 多糖的結(jié)果如圖8-B 所示，以對(duì)照組為100%吞噬率，在0.625～5.0 μg/mL LGP-A 可以顯著性增強(qiáng)RAW264.7 細(xì)胞的吞噬能力（P＜0.01），1.25 μg/mL 下吞噬率為138.5%。

3.3.3 對(duì)細(xì)胞NO、TNF-α、IL-6 分泌量的影響 NO作為細(xì)胞產(chǎn)生的一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)，可以激活巨噬細(xì)胞啟動(dòng)非特異性免疫，促進(jìn)巨噬細(xì)胞代謝，提高巨噬細(xì)胞吞噬能力[26]，是評(píng)價(jià)免疫應(yīng)答水平的重要指標(biāo)。細(xì)胞因子主要是巨噬細(xì)胞在免疫應(yīng)答過(guò)程中的產(chǎn)物，可以參與免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能。其中TNF-α 是一種強(qiáng)促炎因子[29]，參與機(jī)體多種生命活動(dòng)，對(duì)腫瘤也有一定的抑制活性。IL-6 可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，還可以調(diào)節(jié)代謝及再生[30]。因此TNF-α、IL-6 等細(xì)胞因子水平的上升是巨噬細(xì)胞激活的標(biāo)志之一。有研究表明，多糖提高RAW264.7 細(xì)胞NO、TNF-α、IL-6 等因子的分泌，且分泌水平低于LPS 誘導(dǎo)組，以此來(lái)評(píng)價(jià)其免疫調(diào)節(jié)活性[31]。

由圖 8-C～E 可知，LGP-A 多糖可以促進(jìn)RAW264.7 細(xì)胞NO、TNF-α、IL-6 等細(xì)胞因子的分泌，且呈劑量相關(guān)性。與對(duì)照組相比，5 μg/mL LGP-A 組的NO、TNF-α 分和IL-6 分泌量均較顯著上升，分別為（20.64±1.29）μmol/L、（27.16±0.17）ng/mL 和（3.77±0.13）ng/mL，但低于1 μg/mL LPS組分泌量 [（25.79±1.63）μmol/L、（75.54±0.23）ng/mL、（18.97±0.11）ng/mL]。綜合細(xì)胞因子與細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可知LGP-A 具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。

4 討論

目前對(duì)羅漢果根多糖的構(gòu)效關(guān)系未有充分研究，但在其他多糖的研究中發(fā)現(xiàn)單糖組成是影響多糖生物活性的重要因素，其中半乳糖、阿拉伯糖等單糖是否存在和含量高低會(huì)影響其免疫活性。由阿拉伯糖和半乳糖聚合而成的中性多糖稱為阿拉伯半乳聚糖（AG），安全無(wú)毒，且具有良好的生物活性。如從落葉松中提取的AG 能促進(jìn)TNF-α、IL-6 和IL-1β 等細(xì)胞因子，具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性。在臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)AG 可以提高人體對(duì)細(xì)菌抗原的免疫力，還可以治療風(fēng)寒感冒等呼吸道疾病[32-33]。除了免疫活性外，AG 在抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、維持腸道穩(wěn)態(tài)等方面也有較好的活性。

本研究通過(guò)紅外光譜、核磁波共振波譜、相關(guān)參考文獻(xiàn)和結(jié)合單糖組成分析結(jié)果，對(duì)LGP-A 結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步分析，推斷其是一種阿拉伯半乳聚糖。實(shí)驗(yàn)證明LGP-A 具有較好的免疫活性，可能與其相對(duì)分子質(zhì)量大小有關(guān)。相對(duì)分子質(zhì)量是多糖發(fā)揮生物活性的重要影響因素，多糖需要與受體結(jié)合跨越細(xì)胞屏障才能進(jìn)入機(jī)體發(fā)揮生物活性。多糖相對(duì)分子質(zhì)量過(guò)高難以跨越細(xì)胞屏障，相對(duì)分子質(zhì)量過(guò)低難以形成活性聚合物結(jié)構(gòu)[34]。研究發(fā)現(xiàn)不同植物多糖發(fā)揮免疫活性的最佳相對(duì)分子質(zhì)量范圍不同，如單糖組成、糖鏈主要結(jié)構(gòu)及官能團(tuán)基本一致但相對(duì)分子質(zhì)量有明顯差異的鐵皮石斛多糖在免疫調(diào)節(jié)活性方面具有顯著差異，在1.2×105～5.44×105免疫效果強(qiáng)于3.91×104[35]，推測(cè)在一定范圍內(nèi)，多糖相對(duì)分子質(zhì)量越大活性越強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)從羅漢果根中分離得到的LGP-A 多糖，經(jīng)PMP-HPLC 分析后發(fā)現(xiàn)與紅花多糖HH1-1 單糖組成[21]及比例相似，相對(duì)分子質(zhì)量與草菇多糖相似。研究表明紅花多糖HH1-1 與草菇多糖可以增加巨噬細(xì)胞NO 生成量，促進(jìn)細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS 的分泌及其mRNA表達(dá)量[36]，表現(xiàn)出良好的免疫調(diào)節(jié)能力，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以上研究比較一致。

目前羅漢果栽培方式是一年一栽，每年產(chǎn)生大量的根資源。但羅漢果根不是傳統(tǒng)的藥用部位，尚未得到系統(tǒng)的研究與開(kāi)發(fā)，從而遭受丟棄造成巨大的資源浪費(fèi)。本實(shí)驗(yàn)以羅漢果根為原料，通過(guò)脫脂、水提醇沉得到羅漢果根粗多糖，利用DEAE-52 和Sephadex LH-20 柱色譜純化得到1 個(gè)均一性較好的中性多糖LGP-A，通過(guò)FT-IR、NMR、SEM 等技術(shù)初步表征了其結(jié)構(gòu)，以細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明其具有免疫調(diào)節(jié)活性。今后擬進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)LGP-A 精細(xì)結(jié)構(gòu)的解析，并開(kāi)展其體內(nèi)的免疫活性研究，為開(kāi)發(fā)羅漢果根多糖的大健康產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突