何文兵，李 明，崔艷艷，張曉燕，付安軍，黃 鶴

酚類物質的含量和比例不僅影響葡萄酒的顏色、收斂性、澄清度和穩(wěn)定性等的感官品質，還決定著葡萄酒的抗氧化等生理活性功能［1?2］，其抗動脈粥樣硬化功效越來越受到人們的重視.

酚類物質在葡萄酒發(fā)酵和陳釀過程中的變化極其復雜［3?4］.具有山葡萄典型特點的北冰紅葡萄，其品質與栽培地氣候條件、土壤條件、地形條件及修剪整形方式等因素關系密切，而氣候條件、土壤條件對葡萄品質起著決定性的作用，進而影響著葡萄酒中酚類物質（花色素和單寧）及芳香物質（包括游離態(tài)和結合態(tài)）的含量，以及葡萄酒的品質［5?9］.鴨綠江河谷獨特的風土條件為北冰紅葡萄的栽培提供了保障，合適的采收期影響葡萄漿果的特殊風味，進而影響著葡萄酒的商業(yè)價值.

本研究以鴨綠江河谷三個采樣點的五個不同采收期采摘的北冰紅葡萄為原料，分析不同采收期北冰紅葡萄果實不同部位總酚含量的變化規(guī)律，旨在確定該地區(qū)環(huán)境條件下北冰紅葡萄的最適采收期，對明確當?shù)乇北t葡萄采收的依據(jù)，不斷提升葡萄酒品質具有重要的指導意義，為北冰紅葡萄相關產(chǎn)品在食品、醫(yī)藥等領域的開發(fā)和應用提供更多理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑及試驗材料

1.1.1 主要儀器

紫外可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）、高速冷凍離心機（賽默飛世爾科技公司）、糖度計、數(shù)顯游標卡尺（哈爾濱量具刃具集團有限責任公司）、分析天平（梅特勒?托利多電子天平）.

1.1.2 主要試劑

福林酚（分析純），樂美天德思特生物；石油醚、甲醇、無水碳酸鈉、一水和沒食子酸（以上試劑均為分析純），國藥集團化學試劑有限公司；液氮（99.9%），通化富氏氧氣有限公司.

1.1.3 試驗材料

北冰紅葡萄，于2022 年采自集安市鴨江谷酒莊有限公司葡萄基地.取樣方法參考岳泰新［10］、李小龍［11］的方法，將所選擇的各葡萄山去除三排邊行后，按“S”字形隨機選擇植株采集，用冰袋低溫帶回實驗室，在?40 ℃的冰箱內儲存.采樣時間見表1.

表1 不同取樣地及取樣時間

1.2 試驗方法

1.2.1 基本指標測定

（1）平均單粒果粒重量：采用分析天平進行稱量，重復3 次.

（2）果?？v莖、果粒橫徑及果型指數(shù)：采用數(shù)顯游標卡尺對采樣后的葡萄果粒進行縱莖和橫徑的測量，重復3 次，并依據(jù)公式計算果型指數(shù).

果型指數(shù)=果實縱徑/果實橫徑.

（3）總可溶性固形物：采用數(shù)顯折射儀測量，測定時記好讀數(shù)以質量分數(shù)（%）表示可溶性固形物的含量.重復測定3 次，計算平均值和標準偏差.

1.2.2 總酚測定

參照趙紅等［12］的方法，采用福林肖卡法，并略有調整，總酚測定結果以沒食子酸（GAE）計［13］.

（1）繪制沒食子酸標準曲線.將25.0 mg沒食子酸溶于10 mL 的60% 鹽酸甲醇溶液中，并用超純水定容至500 mL（現(xiàn)配），即為500 mg/L 沒食子酸標準溶液；配制不同濃度梯度的沒食子酸溶液（0 mg/L、50 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、500 mg/L）.

分別吸取不同濃度沒食子酸標準溶液0.2 mL，使其與0.2 mL 福林酚試劑混勻靜置1 min 后，添加1 mL 的Na2CO（312%）后混合震蕩，用6.6 mL 的蒸餾水進行定容，暗處避光反應1 h，隨后在波長765 nm 下測定吸光度，每個處理平行重復三次測定結果，以沒食子酸溶液濃度作為橫坐標，以吸光度作為縱坐標，繪制標準曲線.

（2）樣品預處理.葡萄皮樣品預處理：?40 ℃冷凍葡萄，立即剝取葡萄皮，液氮冷凍粉碎成粉末裝于培養(yǎng)皿中，真空冷凍干燥24 h，取出裝于自封袋中，存放于?80 ℃冰箱中［14］.

葡萄籽樣品預處理：?40 ℃冷凍葡萄，立即剝取葡萄籽，使用粉碎機進行葡萄籽的破碎，葡萄籽真空冷凍干燥24 h，并用0.18 mm孔徑（80 目）篩進行篩選，將過篩的葡萄籽粉使用石油醚進行脫脂，其比例1∶5，脫脂48 h，脫脂結束使用真空泵進行抽濾，抽濾結束后在鼓風烘干箱中將葡萄籽粉烘至恒重.

稱取0.1 g 北冰紅葡萄干粉于50 mL 離心管中（離心管要用錫箔紙包裹），加入20 mL料液比1∶20 的鹽酸甲醇溶液置于超聲波提取機中（溫度為30 ℃，功率為40 W）提取1 h，然后在4 ℃、5 000 rpm 的條件下進行離心10 min，將上清液轉移至絲口瓶中［15］，沉淀物重復進行2 次上述提取過程，合并3 次上清液，用超純水定容至100 mL 備用.

2 結果與分析

2.1 沒食子酸標準曲線

標準曲線見圖1，所構建標準曲線回歸方程y=0.001 4x?0.001（R2=0.999 3），說明該標準曲線的相關性較高.標樣在0～500 mg/L內有良好的線性關系，符合總酚的定量檢測.

圖1 沒食子酸標準曲線

2.2 不同采收期的北冰紅葡萄基本理化指標

采用Excel 2010 軟件進行試驗數(shù)據(jù)處理，以SPSS 22.0 軟件進行方差分析，并用Duncan顯著性差異檢驗.

由表2 可知，葡萄果實的平均單粒果粒重量隨著葡萄的成熟總體趨勢呈增長狀態(tài)，且相互間均存在顯著差異（p<0.05）.整體上在T1～T2 時期迅速增長，T2～T3 時期趨于平緩，但北冰紅A 坡在T2～T3 時期呈現(xiàn)下降的趨勢，可能與測量時產(chǎn)生的誤差有關，也可能受到生長環(huán)境變化的影響［16］.葡萄果實成熟后期單粒果粒重差異不顯著，至T4、T5 時期，三個采樣點果型指數(shù)基本恒定，可能此時期果實已經(jīng)成熟，發(fā)育緩慢.

表2 不同采收期北冰紅葡萄的基本理化指標

A 坡北冰紅葡萄果實在T5 時期總酚含量達到1.53±0.01 g，高于同一時期的B 坡和A/B坡，原因在于A 坡所處地理位置的光照強度和溫度高于其他坡，其外部環(huán)境條件更有利于果實的生長.有研究表明，若在葡萄開花期溫度低于14 ℃會導致受精不好，子房大量脫落，影響果實品質和產(chǎn)量［17］.

葡萄果實的可溶性固形物的百分含量隨著葡萄的成熟總體呈先快后慢的增長模式，且相互間均存在顯著差異（p<0.05）.T2～T3 時期上升幅度最大，表明此階段是果實向生理成熟轉變的重要時期，至T4、T5 時期，三個采樣點果實中可溶性固形物含量最高.而黃競等［18］對不同采收期“野釀2 號”毛葡萄酒理化特征和芳香組成的含量研究中發(fā)現(xiàn)，隨著采收期的延長，毛葡萄中的總糖增多，與該試驗A 坡、B 坡的含量變化結果相符，但A/B 坡T5 時期的可溶性固形物含量偏低，可能受當時采收期所處位置競爭性雜草和濕度狀況的影響.

可溶性固形物含量的增加主要是葡萄植株其他部分所積累的物質向果實運輸而導致的［19］.大部分中晚熟葡萄品種，因生長期較長和糖分的長時間積累，所以到采摘末期含糖量相對較高［20］，而葡萄在發(fā)育的不同時期（花芽分化、開花過程和果實發(fā)育及轉色后期），其酚類物質的累積及含糖量的增長等生命過程，又與氣溫密切相關，高溫對含糖量的提高和含酸量的減少都有促進作用［21］，同時高溫也引起了水果中有機酸和可溶性固形物濃度的減少.

北冰紅葡萄是釀制冰酒的重要原料，葡萄果實的糖含量積累變化規(guī)律的研究尤為關鍵［22］，其糖分水平與葡萄的采收期和成熟度有著直接關系，影響葡萄酒質量.

葡萄果實的大小及內含物對其在收獲期間的質量有重要影響.北冰紅葡萄T1?T2 果粒的生長速度很快，果實橫縱徑增長較為明顯.在此過程中，不僅果粒的大小發(fā)生變化，果實也發(fā)生著從綠到紫的變化［23］.本試驗研究北冰紅釀酒葡萄果實在生長期各品質的變化與張穩(wěn)穩(wěn)［24］所研究的“北紅”和“北玫”生長過程中的質量指標的變化規(guī)律是一致的.

由表2 可知，果形指數(shù)大約在0.99～1.05 之間，表明北冰紅葡萄屬于圓型果實.果形指數(shù)隨果實不斷成熟，變化趨勢不明顯，且北冰紅A 坡和北冰紅B 坡不同時期的果形指數(shù)不存在顯著性差異，所以本研究中果形指數(shù)不作為最適采收期的參考標準.

2.3 不同采收期北冰紅葡萄果實不同部位總酚含量變化趨勢

測試了不同時期、同一采收地不同坡度北冰紅葡萄（皮和籽）的總酚，北冰紅A 坡、B坡和A/B 坡.測定結果如圖2 所示.

圖2 不同采收期北冰紅葡萄中總酚含量變化趨勢

由圖2 可知，整體看來，隨著采收期的延長總酚含量逐漸升高，且存在顯著差異（p<0.05）.其中圖2（a）從生長階段到成熟階段，總酚含量的累積趨勢是：下降?上升?下降?上升.圖2（b）總酚含量積累趨勢呈逐漸增長趨勢.圖2（c）總酚含量積累趨勢呈先下降后上升的趨勢.其中圖2（a）在T3 采收期總酚高于同一時期的其他坡，可能是由于A 坡的光照時長高于其他坡，光照是植物生命活動中的重要的生態(tài)作用因素，影響著葡萄漿果成熟過程中物質的積累.而B 坡在T3 時期的采收環(huán)境條件未能達到葡萄生長的最適條件，至T5 時期總酚累積含量才達到最高.圖2（a）與圖2（b）的對比表明日照時間對果實的大小、顏色和內含物質的形成都有很大的影響，且總酚含量隨采收期的延長而增高，這可能是因為在成熟后，合成總酚的關鍵酶及調節(jié)因子的活性會有所提高，這對總酚的合成與積累有利［25］，也可能與當?shù)氐臍夂蛞蛩氐茸匀粭l件有關，同時也受其自身品種屬性的影響［26］.但不同坡度T5 時期的北冰紅葡萄果實（皮和籽）中總酚含量均達到最高，分別為88.48±4.76 mg/g、88.06±8.35 mg/g、78.34±3.67 mg/g，高于其他時期的總酚含量.

圖2（a）、圖2（b）、圖2（c）果籽中總酚含量的變化均呈先下降后上升的趨勢.表明成熟末期葡萄皮中的總酚含量遠遠大于果籽中的總酚含量.圖2（a）果皮中總酚含量與果皮+果籽中總酚含量變化趨勢一致.由此可見葡萄果皮總酚物質的含量與該葡萄品種的成熟度和最佳采收期有關.其中A 坡果皮在T3 時期和T5 時期總酚含量分別為57.64±9.17 mg/g和52.98±4.80 mg/g，而B 坡和A/B 坡在T5 時期最高總酚含量分別為65.64±9.44 mg/g、52.87±5.64 mg/g，可能由于A 坡的日照時長和溫度高于B 坡和A/B 坡，導致A 坡北冰紅葡萄在T3時期已成熟達到采收的標準，而B 坡和A/B 坡的葡萄還處于生長發(fā)育的階段，由于溫度和日照時長低于A 坡，所以生長周期比A 坡長，到T5 時期才開始成熟，達到采收的標準.

3 結語

酚類物質是葡萄漿果中重要的次生代謝產(chǎn)物，作為葡萄酒的“骨架成分”，影響葡萄酒的色澤、風味和口感上的收斂性，是國內外葡萄與葡萄酒研究領域中的熱點.本文以福林肖卡法測定鴨綠江河谷產(chǎn)區(qū)3 個采樣點的不同采收期北冰紅葡萄漿果的常規(guī)指標及果皮、果籽中的總酚含量，探究時間和空間與北冰紅葡萄漿果中不同部位總酚含量變化規(guī)律，并結合其果實品質，評估栽培地點及取樣時間對釀酒葡萄的品質的影響，為葡萄的進一步加工及質量評價提供了理論依據(jù).

研究結果表明：整體上果皮中總酚含量大于果籽中總酚含量，但不同采收期果皮與果籽中總酚含量大小不同，前期出現(xiàn)果籽中總酚含量大于果皮中總酚含量的情況，隨著采收期的延長，果皮中總酚含量遠大于果籽的總酚含量；采收期影響果實品質，延遲采收期明顯提高了北冰紅葡萄大小、平均單果重和可溶性固形物含量；采收期影響果實總酚含量，不同采收期北冰紅葡萄中總酚的含量有較大差別，且同一階段的北冰紅葡萄，其果肉和果籽中的總酚含量也有較大差別，T5 時期的北冰紅葡萄總酚含量較高.

因此，在鴨綠江河谷地區(qū)，適當延長收獲時間能明顯增加北冰紅葡萄的總酚及可溶性固形物的含量；達到提高酒質量的目的.從而確定北冰紅葡萄的最佳收獲時期為T5.

本文僅對不同采收期的北冰紅葡萄漿果中總酚進行了研究，后續(xù)將開展對不同采收期的北冰紅葡萄漿果中酚類化合物種類及組成比例特征及其與抗氧化、抗癌及抗病毒等生理活性間的關系的研究，以期為北冰紅葡萄酒的品質、營養(yǎng)保健等方面的鑒定提供科學依據(jù).