苗得慶，周 樊，范志梁，顧春松*

膿毒癥是機體因細菌、病毒等病原微生物感染后出現(xiàn)的全身炎性反應綜合征.該病早期識別和診斷困難，其中因診治不當導致的感染性休克死亡率高達40%，嚴重危害人們健康［1］.刺梨為薔薇科薔薇屬植物繅絲花的果實（RosaroxburghiiTratt），首次記載于《本草綱目拾遺》，是貴州常用的民族中藥材，其味甘、酸，是滋補健身的佳果.現(xiàn)代藥理研究表明，刺梨具有降血脂、抗腫瘤、抗氧化應激等作用［2］.刺梨資源豐富、價格低廉、毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性，是治療膿毒癥的潛在藥物.但是目前尚缺少刺梨治療膿毒癥的相關藥理作用及物質(zhì)基礎的具體研究，本文利用網(wǎng)絡藥理學研究方法，篩選刺梨化學活性物質(zhì)并推測其干預膿毒癥的作用靶點、機制，為后期該藥物臨床應用提供科學理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 刺梨相關成分及靶點篩選

通過查閱刺梨相關文獻對其所含化學成分進行總結，并使用chemdraw 軟件繪制各化合物結構.將繪制的各化合物結構輸入SwissADME數(shù)據(jù)庫，并規(guī)定選取化合物標準：GIabsortion為“High”，說明該成分口服生物利用度好，易吸收；Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge 五 種類藥性檢測中結果有不少于2 個“Yes”.

根據(jù)文獻查閱結果，若化合物藥理作用與膿毒癥相關性較高，仍保留并納入得到最終潛在化合物.再利用基于藥效團匹配法的PharmMapper 數(shù)據(jù)庫獲取不同潛在化合物的核心作用靶點，選NF（Normalized Fit Score）≥0.9的靶點蛋白，結合相關文獻報道，綜合得到活性化合物的核心作用靶點.

1.2 疾病靶點篩選

為保證目標數(shù)據(jù)正確、全面，以“sepsis”“sepsis shock”等相關膿毒癥名詞為關鍵搜索詞，搜索Gene Cards 數(shù)據(jù)庫、DRUG BANK 數(shù)據(jù)庫、OMIM 數(shù)據(jù)庫、Therapeutic Target Database數(shù)據(jù)庫以獲得膿毒癥疾病的核心靶點.其中DRUG BANK 數(shù)據(jù)庫由臨床試藥數(shù)據(jù)構建，Gene Cards、OMIM、Therapeutic Target Database數(shù)據(jù)庫基于文獻數(shù)據(jù)，故本實驗采用不同數(shù)據(jù)庫進行疾病靶點收集可獲得更加全面的靶點信息.將所收集靶點信息去重合并，使用UniProt 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫將疾病靶點與藥物化學成分的潛在靶點統(tǒng)一規(guī)范為Gene Symbol，其后將兩者進行映射，以獲得刺梨潛在干預膿毒癥的靶點.

1.3 刺梨成分-膿毒癥靶點

將所獲的交集靶點上傳至STRING 11.5 數(shù)據(jù)庫，并將Organisms 選擇為“Homo sapiens”，設置置信度為0.40，隨后進行PPI 網(wǎng)絡關系分析，并將所得結果導入CytoScape 3.7.2 軟件.利用該軟件分析蛋白質(zhì)相互作用關系，得到相關蛋白質(zhì)具有的潛在功能.

1.4 刺梨成分與膿毒癥靶點GO 功能富集和KEGG 通路富集

利用Metascape 數(shù)據(jù)庫進行核心靶點的生物信息富集分析，包括GO 分析的生物過程（BP）、分子功能（MF）、細胞成分（CC）和KEGG通路.

1.5 成分-靶點-通路網(wǎng)絡圖的構建

綜合“1.4”所得生物信息富集分析結果與“1.2”所得藥物疾病交集靶點，將其導入到CytoScape3.7.2 軟件中構建：藥物成分?靶點?通路網(wǎng)絡圖.利用CytoScape 3.7.2 軟件得到刺梨潛在化學成分及靶點的拓撲分析結果，包括介度（Betweenness）、連接度（Degree），并根據(jù)網(wǎng)絡拓撲分析結果得到核心靶點及干預膿毒癥的主要活性成分.

1.6 分子對接評估

選擇分析得到刺梨成分?膿毒癥靶點網(wǎng)絡圖中度值排名前6 的靶點.通過RCSB 數(shù)據(jù)庫下載其pdb 格式，利用Open Babel 軟件將核心化合物轉(zhuǎn)換為pdb 格式.采用pymol 軟件對蛋白進行除水、去配體、加氫等處理并儲存為pdbqt 格式，對潛在化合物進行減少能量并賦予配體原子類型等處理并儲存為pdbqt 格式，利用Schr?dinger 軟件進行分子對接處理，以對接得分作為判斷二者結合活性的參考.

2 結果

2.1 刺梨主要活性成分靶點預測結果

綜合相關文獻共獲得刺梨相關的100 個化學結構，其主要成分為黃酮類、多糖類和有機酸類，還包括萜類等成分.通過SwissADME篩選出57 種活性成分，其中活性最強的10 個活性成分結構見表1.利用PharmMapper 預測并選擇NF≥0.9 的靶點，去除所有重復基因后共計132 個預測靶點.

表1 刺梨活性最高的10 種成分

2.2 刺梨干預膿毒癥相關靶點獲取

在Gene cards 數(shù)據(jù)庫中得到膿毒癥疾病相關靶點2 974 個，選取Score≥0.55 的結果并結合Therapeutic Target Database、DRUG BANK、OMIM 數(shù)據(jù)庫進行補充，去重合并收集到1 497個相關疾病靶點.將刺梨有效成分的132 個靶點與1 497 個膿毒癥相關靶點取交集，獲得30個交集靶點，并將結果繪制成VENN 圖（圖1）.

圖1 藥物-疾病靶點VENN 圖

2.3 PPI 網(wǎng)絡構建

將30 個交集靶點上傳至STRING11.5 數(shù)據(jù)庫進行PPI 分析.并利用CytoScape 3.7.2 軟件構建PPI 網(wǎng)絡（圖2），進一步分析網(wǎng)絡信息，推測AKT、SRC、MMP9 等為核心靶點.

圖2 刺梨-膿毒癥靶點PPI 網(wǎng)絡

2.4 GO 功能富集和KEGG 通路富集

運用Metascape 數(shù)據(jù)庫對潛在核心靶點進行生物信息富集分析（圖3）.圖3（a）表明刺梨干預膿毒癥相關核心生物過程為：調(diào)節(jié)脂質(zhì)結合（lipid binding）、調(diào)節(jié)激酶活性（kinase activity）、調(diào)節(jié)磷酸轉(zhuǎn)移酶活性（phosphotrans?ferase activity）.圖3（b）為KEGG 通路富集分析結果中刺梨干預膿毒癥排名前20 的信號通路.

圖3 刺梨主要成分潛在靶點的富集分析

2.5 刺梨成分-靶點-通路網(wǎng)絡的構建

運用CytoScape 3.7.2 構建“刺梨成分?靶點?通路”網(wǎng)絡圖，并分析得到刺梨干預膿毒癥疾病靶點網(wǎng)絡拓撲信息數(shù)據(jù)，進而分析得到核心化學成分及作用靶點.如圖4 所示，此網(wǎng)絡由167 個節(jié)點和361 條邊構成，橙色節(jié)點表示刺梨潛在靶點，紅色節(jié)點表示刺梨中的潛在信號通路，藍色節(jié)點表示刺梨活性成分.

圖4 刺梨干預膿毒癥成分-靶點-通路圖

通過CytoScape 對網(wǎng)絡進行分析發(fā)現(xiàn)，刺梨每種活性成分對應多個靶點，每個靶點連接多種成分，體現(xiàn)了刺梨內(nèi)含的多種成分可能通過多靶點干預膿毒癥.其中CL49（槲皮素）連接度為68，介度為0.519 333 77，緊密度為0.521 126 76，預測CL49 為刺梨干預膿毒癥的主要成分，其次為CL46（鞣花酸），連接度為41，介度為0.260 542 11，緊密度為0.440 476 19（表2）.AKT1、PIK3R1、SRC、MMP9 靶點基因的網(wǎng)絡節(jié)點度排位靠前，連接度分別為21、19、12、12，預測Phospholipase D signaling pathway 為刺梨干預膿毒癥的核心靶點（表3）.

表2 刺梨主要活性成分網(wǎng)絡節(jié)點特征參數(shù)

表3 刺梨主要活性成分靶點網(wǎng)絡節(jié)點特征參數(shù)

由表4 可知，不同通路是通過共有靶點相互連接形成，表明刺梨可能通過多條通路協(xié)同發(fā)力起到干預膿毒癥的作用.

表4 刺梨干預膿毒癥靶點通路富集結果

2.6 刺梨分子對接篩選

將刺梨中排名前十名的化合物與AKT1、APOE、ERBB2、ESR1、MMP9、SRC 6 個核心蛋白進行分子對接，得到60 組化合物?蛋白對接結果.其中所有對接得分均

圖5 分子對接結果

圖6 刺梨部分核心化合物分子對接模式

3 討論

中醫(yī)原理中并沒有膿毒癥相關概述，根據(jù)《傷寒論》和《溫病學》的有關中醫(yī)理論，將膿毒癥歸屬于“熱病”“溫病”等范疇，多是從“毒瘀虛”闡述膿毒癥的病因病機，治療上多用清熱解毒類藥物［3?4］.刺梨是貴州省代表民族藥物，有健脾養(yǎng)胃、補腎壯陽等功效，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其還有提高免疫力、延緩衰老、保護血管等作用.本研究利用網(wǎng)絡藥理學方法，構建成分?靶點?信號通路網(wǎng)絡，通過分析相關網(wǎng)絡要素（節(jié)點、度值等），探討了刺梨干預膿毒癥的主要成分.

3.1 成分分析

通過對刺梨成分的研究發(fā)現(xiàn)，刺梨主要活性成分以槲皮素、山奈酚、木犀草素、兒茶素等黃酮類成分為主，而黃酮類化合物也是刺梨果實中含量最高、活性最強的成分［5］.有研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過PI3K 途徑減輕膿毒癥小鼠心肌組織炎性及氧化應激反應，進而達到緩解心肌損傷的作用［6］.此外，槲皮素還對膿毒癥肺損傷的大鼠有保護作用，其機制與減少NF?κB p65 蛋白表達有關［7］.鞣花酸和木犀草素在網(wǎng)絡拓撲分析中分別排名2、3位，其中鞣花酸可通過Nrf2/HO?1 途徑對膿毒癥心功能不全的小鼠有顯著保護作用［8］，而木犀草素可通過ROS、NF?κB、Caspase 等通路發(fā)揮對膿毒癥的調(diào)控作用［9?11］.兒茶素和沒食子酸亦為刺梨的主要活性物質(zhì)，前者單獨使用可抑制NLRP3 炎癥小體活化，二者聯(lián)合使用有較強的抗菌活性，具有潛在的膿毒癥干預作用［12］.

分子對接結果顯示，刺梨排名前十的化合物均與主要蛋白靶點有較強的結合活性，且CL76（兒茶素）化合物與6 個蛋白的結合能均

3.2 潛在靶點分析

分析結果顯示，AKT1、PIK3R1、SRC、MMP9、ERBB2、MMP2 等靶點排名靠前，推測可能是刺梨干預膿毒癥的關鍵靶點.

絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT）是關鍵致癌蛋白，可介導細胞存活、增殖、凋亡等過程［13］.AKT1 作為AKT 家族的重要成員，是其中最活躍的增殖和生存途徑蛋白，當AKT 被磷酸化激活后，其下GSK3β 蛋白活性受到抑制的同時，β?catenin 的磷酸化過程被阻斷而不能降解，以至于β?catenin 在細胞內(nèi)大量聚集并進入細胞核，加速細胞凋亡及炎性激活［14］.因此抑制AKT1 激活有助于增加組織抗炎、抗凋亡等作用，進而減輕腦水腫、保護血腦屏障并減輕腦損傷［15］.PI3K 是經(jīng)典存活通路蛋白，位于AKT 上游，與AKT 共同組成信號通路調(diào)節(jié)細胞的自噬發(fā)生，這與KEGG 分析結果一致，說明PI3K 和AKT 靶點在刺激干預膿毒癥過程中起關鍵作用［16］.SRC 是酪氨酸激酶價值的重要蛋白酶，在調(diào)節(jié)免疫細胞募集和機體防御中具有重要作用，其可參與ROCK、NF?κB 等炎性通路過程，且有研究表明，ROCK 和NF?κB可減少膿毒癥模型中細粒細胞轉(zhuǎn)移及肺水腫表征，減少炎性因子表達，進而緩解膿毒癥引起的肺組織病變［17?18］.基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）家族蛋白在細胞凋亡中擔任重要角色，其可通過多種途徑分解細胞外基質(zhì)，其中MMP?9 和MMP?2 是最有代表性的關鍵靶點［19］.研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者體內(nèi)MMP?9、MMP?2 表達顯著提高，這一表現(xiàn)直接提示患者預后不佳并增加器官衰竭的幾率［20］.

3.3 通路分析

通過GO 功能富集分析可知，刺梨干預膿毒癥的生物學進程有regulation of kinase activ?ity、protein tyrosine kinase activity、apical part of cell 等，通過KEGG 富集分析可知，刺梨干預膿毒癥的信號通路主要與調(diào)節(jié)細胞凋亡相關，例如：Phospholipase D signaling pathway 和Endocrine resistance pathway.

Phospholipase D signaling pathway 是存在細胞內(nèi)的一種關鍵的次級信號傳遞系統(tǒng)，包括催化磷脂酰膽堿水解過程，是機體內(nèi)PI3K/AKT、MAPK/ERK 及PKC 等信號通路的重要活性底物.Endocrine resistance pathway 是機體內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的重要通路，其下游包括PI3K/AKT、MAPK 及Apoptosis 等關鍵通路，與Phospholi?pase D signaling pathway 有較強的相關性.研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT 通路是生物體重要的信號轉(zhuǎn)導通路，是目前唯一明確的自噬調(diào)節(jié)信號通路［21］，可通過調(diào)控細胞自噬減輕膿毒癥引起的多器官功能障礙綜合征［22］.自噬和膿毒癥關系密切，在膿毒癥的早期便存在細胞自噬，并且表現(xiàn)為短暫的活性升高趨勢，但隨著早期高動力狀態(tài)下消耗大量的自噬前體，在膿毒癥后期表現(xiàn)為噬障礙，自噬的清除保護作用失效，導致膿毒癥晚期出現(xiàn)免疫麻痹的現(xiàn)象［23］.此外，多數(shù)研究也通過動物實驗驗證了這一觀點［24］，其中包括了槲皮素對PI3K/AKT通路的調(diào)節(jié)作用，這與刺梨干預膿毒癥的成分分析結果一致.MAPK 是與細胞增殖、分化、凋亡及炎癥等通路的關鍵交點，其以磷酸化為特征激活，參與細胞調(diào)節(jié)功能［25］.MAPK 信號通路可調(diào)控氧化應激反應、炎癥及細胞凋亡等生物過程來調(diào)控膿毒癥病情進展，在膿毒癥動物模型體內(nèi)的MAPK 通路相關蛋白活性顯著增強，因此，抑制MAPK 信號通路的活性也是干預膿毒癥的重要手段［26］.

綜上所述，膿毒癥疾病相關生物信息通路主要與Phospholipase D signaling pathway 和Endocrine resistance pathway 相關，刺梨可能通過調(diào)控PI3K/AKT、MAPK 等信號通路干預膿毒癥.

4 結語

本研究利用網(wǎng)絡藥理學及分子對接相關技術方法，通過靶點預測、蛋白相互作用網(wǎng)絡、GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，初步闡明刺梨多成分、多靶點共同調(diào)控膿毒癥的作用機制.刺梨可能是通過槲皮素、鞣花酸、木犀草素等活性有效成分，作用于AKT1、PIK3R1、SRC、MMP9 等生物靶點，參與PI3K/AKT、MAPK等多條信號通路的調(diào)控進而發(fā)揮治療膿毒癥的作用.本研究基于科學理論推測刺梨干預膿毒癥的作用機制，為刺梨新藥效的發(fā)現(xiàn)提供理論參考依據(jù)，但網(wǎng)絡藥理學研究仍存在一定的局限性，后續(xù)研究團隊將持續(xù)關注刺梨藥理研究進展，并在此基礎上結合動物、細胞實驗，深入探討刺梨干預膿毒癥的作用機制，為中醫(yī)藥防治膿毒癥提供更有效的治療指南.