孟媛，姜國紅，張維民，韋標方*

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510006；2.臨沂市人民醫(yī)院股骨頭專科，山東臨沂 276000；3.青島市胸科醫(yī)院檢驗科，山東青島 266043）

股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head,ONFH）是一種常見的進展性疾病，主要由血管供應(yīng)減少、骨代謝紊亂引起，最終導(dǎo)致股骨頭骨塌陷。這種疾病可分為創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性兩種，非創(chuàng)傷性股骨頭壞死（non-traumatic osteonecrosis of the femoral head,NONFH）常與長期使用糖皮質(zhì)激素、酗酒、吸煙等因素相關(guān)，嚴重影響青壯年患者的生活質(zhì)量［1］。在美國每年有超過20 000 例新增病例［2］，而在中國約有812 萬人受此病影響［3］。因其高發(fā)病率和高致殘率，NONFH 已成為骨科領(lǐng)域的一個重大挑戰(zhàn)。晚期NONFH 患者通常需要全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)，但此治療方法對年輕患者而言存在并發(fā)癥風(fēng)險。目前，對于NONFH 的確切發(fā)病機制仍知之甚少，需進一步研究。

同型半胱氨酸（homocysteine, Hcy）與骨科疾病之間的關(guān)聯(lián)日益受到關(guān)注，尤其在骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis, OP） 和骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis, OA） 方面。研究顯示，Hcy 通過抑制膠原纖維之間的交聯(lián)，增加破骨細胞的活性和減少骨鈣素表達，影響骨基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和骨質(zhì)量［4］。此外，Hcy 還與維生素B12 和葉酸的代謝相關(guān)，影響骨轉(zhuǎn)換過程［5］。在骨關(guān)節(jié)炎方面，Hcy 通過SIRT1/AMPK/PGC-1α 途徑的下調(diào)導(dǎo)致線粒體功能障礙，增加軟骨細胞中的氧化應(yīng)激和促凋亡反應(yīng)。Hcy 還可通過增加基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）的表達，影響軟骨細胞介導(dǎo)的礦化過程，加劇軟骨損傷，SIRT1 不足還與促炎細胞因子的表達升高有關(guān)，加劇OA 的炎癥過程［6］。本研究假設(shè)Hcy 在NONFH 的發(fā)生過程中亦發(fā)揮作用，檢測血清Hcy 可能有助于早期診斷NONFH，并在臨床進行相關(guān)，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標準

納入標準：（1） NONFH 患者的臨床癥狀、影像學(xué)檢查、病例分析符合《中國成人股骨頭壞死臨床診療指南》（2020 年）；（2）NONFH 患者符合國際骨循環(huán)協(xié)會（Association for Research on Osteonecrosis,ARCO）分期I～IV 期的標準；（3）受試者年齡≥18 歲；（4）無髖關(guān)節(jié)創(chuàng)傷史與手術(shù)史；（5）病因限于單致病因素，包括酒精性、激素性、特發(fā)性。酒精性患者有超過500 ml/周的酗酒史，持續(xù)5 年以上；激素性患者有糖皮質(zhì)激素使用史，日攝入量超過16 mg；特發(fā)性患者無酗酒史、激素使用史、股骨頭創(chuàng)傷史。

排除標準：（1）有基礎(chǔ)性疾病病史，如高血壓、糖尿病、高脂血癥等；（2）心、肺、肝、腎存在實質(zhì)性病變；（3）有代謝性骨病病史；（4）近1 周內(nèi)有服藥史；（5）處于妊娠期和哺乳期婦女；（6）臨床數(shù)據(jù)缺失者。

1.2 一般資料

2023 年1 月—2023 年10 月就診于山東省臨沂市人民醫(yī)院符合上述標準的73 例NONFH 患者列入患者組。同一時期于本院健康體檢中心體檢的68 例健康查體者，其各項臨床資料符合健康標準，列入正常人組。所有參與研究的對象均知情同意，并簽署參與本研究的相關(guān)文件。本研究已經(jīng)獲得臨沂市人民醫(yī)院倫理委員會的審核批準（批準號：YX200380）。

1.3 檢測方法

清晨空腹狀態(tài)下抽取研究對象外周靜脈血5 ml，將樣本置于不含肝素的真空采血管中，室溫下放置2 h，離心機4℃預(yù)冷15 min，設(shè)置3 000 r/min，離心10 min，抽取上清液分離血清，將血清儲存于-80℃冰箱中等待檢測。

采用武漢華美公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）試劑盒檢測測受試者血清中Hcy 濃度，實驗流程嚴格遵守制造商提供的使用說明進行實驗操作。酶標板中分設(shè)標準品孔、研究組待測樣品孔和對照組待測樣品孔，嚴格按說明書劑量依次加入生物素標記的抗體工作液、生物素標記的抗體工作液和底物溶液，分別在37℃恒溫箱中進行孵育，并在酶標板上覆蓋專用板貼以防實驗試劑蒸發(fā)影響檢測結(jié)果精確度。反應(yīng)終止5 min 內(nèi)使用酶標儀檢測OD 值。

1.4 評價指標

記錄患者一般資料，包括性別、年齡、身高、體重、體重指數(shù)（body mass index, BMI）、病因及壞死側(cè)別。采用疼痛視覺模擬評分（Visual Analogue Scale,VAS）、Harris 評分評估參患者臨床狀態(tài)。行影像學(xué)檢查，根據(jù)ARCO 分期標準對NONFH 分期，雙側(cè)NONFH 患者取受累較嚴重一側(cè)的ARCO 分級。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

本實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 軟件（IBM Corp., Armonk,NY,USA）統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，Origin2022進行作圖。呈現(xiàn)正態(tài)分布的計量資料以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，三組及三組以上比較采用單因素方差分析；資料呈非正態(tài)分布時，采用非參數(shù)檢驗。計數(shù)資料采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗，等級資料分析采用秩和檢驗。血清指標與臨床指標之間行Pearson或Spearman相關(guān)分析。采用受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve, ROC）分析評估血清標志物預(yù)測NONFH 的價值。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者與正常人比較

患者與正常人兩組間比較見表1?；颊呓M與正常人組在年齡、性別、BMI 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。ELISA 法定量檢測Hcy 濃度結(jié)果并進行組間分析，患者組血清Hcy 濃度明顯高于正常人組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 患者與正常人兩組資料比較Table 1 Data comparison between the patient group and the healthy group

2.2 患者血清Hcy 指標分層比較

73 例NONFH 患者按吸煙史、病因、患髖側(cè)數(shù)、壞死區(qū)塌陷情況、ARCO 分期分類比較血清Hcy 檢測結(jié)果見表2。是否吸煙兩組患者間Hcy 檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），激素性、酒精性、特發(fā)性所致NONFH 三組患者間的Hcy 檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。但是，NONFH 累及雙側(cè)組的Hcy水平顯著高于累及單側(cè)組（P＜0.05），影像表現(xiàn)股骨頭塌陷組Hcy 水平顯著高于非塌陷組（P＜0.05）。按ARCO 分期分組，隨ARCO 分期等級遞增Hcy 水平顯著升高，各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 73 例NONFH 患者各臨床指標與Hcy 檢驗結(jié)果的分層比較Table 2 Stratified comparison of Hcy based clinical conditions in the 73 NONFH patient

2.3 患者的血清Hcy 水平與其他臨床資料相關(guān)分析

患者血清Hcy 水平與其他臨床指標相關(guān)性見表3，直線-散點圖見圖1a～1c。相關(guān)分析結(jié)果顯示，患者的血清Hcy 水平與VAS 評分和ARCO 分期等級呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。相反，患者的血清Hcy 水平與Harris 評分呈顯著負相關(guān)（P＜0.05）。

圖1 血清Hcy 水平與其他臨床資料的散點-直線圖。1a: 血清Hcy 水平與VAS 評分；1b: 血清Hcy 水平與Harris 評分；1c:血清Hcy 水平與ARCO 分期。Figure 1.Scatter-line graph of serum Hcy level and other clinical data.1a: Serum Hcy level and VAS score; 1b: Serum Hcy level and Harris score;1c:Serum Hcy level and ARCO staging.

表3 Hcy 檢測結(jié)果與其他臨床資料相關(guān)分析Table 3 Correlation analysis between Hcy assay results and other clinical data

2.4 血清Hcy 水平預(yù)測NONFH 的ROC 分析

對73 例患者與68 例正常人血清Hcy 水平的ROC分析結(jié)果見圖2。血清Hcy 水平預(yù)測NONFH 的敏感性為67.1%，特異性為85.3%，曲線下面積（area under curve,AUC）為0.818（95%CI0.751～0.886，P＜0.05）。

圖2 血清Hcy 水平預(yù)測股骨頭壞死的ROC 曲線。Figure 2.ROC curve of using serum Hcy level predicting avascular necrosis of the femoral head.

3 討 論

NONFH 是一種進行性骨疾病，通常導(dǎo)致髖關(guān)節(jié)功能障礙和股骨頭塌陷。在NONFH 早期成骨細胞與破骨細胞活性發(fā)生顯著變化［7］，在股骨頭壞死區(qū)中破骨細胞顯著活躍，在硬化區(qū)成骨細胞活性增加。另一方面，血管內(nèi)皮損傷可導(dǎo)致局部微循環(huán)血栓，進一步加劇壞死區(qū)缺血缺氧。在以上因素影響下，局部骨吸收活躍、骨重塑出現(xiàn)微空洞、股骨頭骨小梁力學(xué)性能與結(jié)構(gòu)發(fā)生改變［8］。在持續(xù)壓力負荷下，股骨頭負重區(qū)出現(xiàn)反復(fù)修復(fù)與反復(fù)骨折過程，大量骨折與囊性變性在修復(fù)區(qū)出現(xiàn)最終導(dǎo)致股骨頭塌陷［9］。因此確立有效的股骨頭局部微循環(huán)及骨代謝情況的評價指標對于早期NONFH 診斷具有重要意義。

Hcy 是一類處于蛋氨酸代謝中間體的含硫非蛋白質(zhì)氨基酸，主要代謝途徑包括轉(zhuǎn)甲基化、再甲基化和轉(zhuǎn)硫途徑系統(tǒng)［10］。Hcy 與蛋氨酸的轉(zhuǎn)甲基化代謝循環(huán)途徑調(diào)節(jié)SAM 與SAH 濃度使細胞甲基化平衡，在甲基化平衡環(huán)境下Hcy 可經(jīng)由再甲基化和轉(zhuǎn)硫途徑系統(tǒng)轉(zhuǎn)化為蛋氨酸或胱硫氨酸，當細胞內(nèi)蛋氨酸水平較低時，Hcy 通過酶蛋氨酸合酶再甲基化為蛋氨酸，另一方面，當細胞內(nèi)蛋氨酸高水平時轉(zhuǎn)硫途徑系統(tǒng)通過胱硫氨酸β 合酶（CBS）將Hcy 轉(zhuǎn)化為胱硫氨酸［11］，Hcy 的反應(yīng)性巰基能夠使Hcy 獲得促氧化劑作用，Hcy 促氧化應(yīng)激作用使Hcy 毒性的主要原因之一［12］。

Hcy 轉(zhuǎn)硫途徑系統(tǒng)的硫代謝產(chǎn)物包括GSH 與硫化氫（H2S），H2S 是一種氣體遞質(zhì)，具有抗炎、抗氧化和抗凋亡功能，對骨代謝穩(wěn)態(tài)起重要作用［13，14］。另一方面，高水平Hcy 損害成骨細胞中的抗氧化系統(tǒng)，Hcy 能夠劑量依賴上調(diào)ROS 生成加劇氧化應(yīng)激并增強線粒體毒性調(diào)節(jié)成骨細胞凋亡［15］。Hcy 可在骨表面累積降低骨小梁或海綿狀骨密度［16］，對骨生物力學(xué)穩(wěn)態(tài)有嚴重影響。血漿Hcy 水平是骨基質(zhì)相關(guān)標志物，Zhu 等［17］對10 748 名受試者進行血漿水平檢測，發(fā)現(xiàn)Hcy 水平與骨礦物質(zhì)密度（BMD）呈負相關(guān)。高Hcy 水平破壞骨骼穩(wěn)態(tài)，通過誘導(dǎo)成骨細胞凋亡，促進破骨細胞活躍，損害骨重塑及骨生物力學(xué)特性。Vijayan 等［18］的研究表明Hcy 可差異化影響骨骼中NF-κB 配體（RANKL） 和骨保護素（OPG）合成，使OPG：RANKL 比率轉(zhuǎn)變導(dǎo)致破骨細胞活性增加和骨質(zhì)量降低。Park 等［19］通過對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的研究證實高同型半胱氨酸血癥可促進成骨細胞凋亡。Zhai 等［15］通過NaSH 和Hcy 聯(lián)合干預(yù)小鼠前成骨細胞MC3T3-E1，證明Hcy 升高可促使線粒體ROS 產(chǎn)生增多并引起線粒體損傷，同樣促進成骨細胞凋亡。另外，Esse 等［20］的研究指出高Hcy 水平可通過一氧化氮合成障礙、硫化氫信號通路失調(diào)、氧化應(yīng)激、脂蛋白代謝紊亂、蛋白質(zhì)N-同型半胱氨?；⒓毎图谆葯C制促進血管內(nèi)皮功能障礙，這也暗示了血Hcy 水平與NONFH 疾病進程的相關(guān)性。

本研究中探討了NONFH 患者Hcy 水平在疾病早期診斷中的應(yīng)用價值，研究組Hcy 水平顯著高于對照組。股骨頭塌陷雙側(cè)受累患者的Hcy 水平顯著高于單側(cè)受累患者；股骨頭已塌陷患者的Hcy 水平顯著高于未塌陷患者。隨著ARCO 分期的加重，血清Hcy 水平呈逐漸升高趨勢。血清Hcy 濃度與VAS 評分及ARCO 分期呈正相關(guān)，與Harris 評分呈負相關(guān)。繪制的ROC 曲線顯示，血清Hcy 水平在診斷股骨頭壞死塌陷時有高的敏感性和特異性，表明血清Hcy水平可預(yù)測NONFH 疾病進展。

綜上所述，本研究評估了Hcy 作為早期NONFH診斷生物標志物的潛在價值。但本研究亦存在局限性：（1）依賴影像學(xué)資料進行NONFH 的早期診斷存在準確性限制，特別是在I 期NONFH 患者的識別上；（2）缺乏關(guān)于Hcy 水平隨疾病進展的長期變化數(shù)據(jù)，限制了對NONFH 病理機制的全面理解。因此，雖然Hcy 在早期NONFH 診斷中顯示出潛力，但需要進一步的研究以解決這些局限性，優(yōu)化診斷方法。