程瑩瑩 ， 武建軍， 蔡海燕， 焦旭文， 馬江波， 丁銀秀*

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)系，寧夏 銀川 750006； 2.西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710038； 3.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，寧夏 銀川 751006

神經(jīng)炎癥作為一種基本的細(xì)胞內(nèi)進展，是腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)喪失的一種預(yù)警信號[1]。研究報道，機體受損時，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞可能參與并加劇神經(jīng)炎癥過程，通過其形態(tài)及功能變化、釋放大量炎性物質(zhì)，如IL-1β、IL-6、NO 等，導(dǎo)致神經(jīng)變性、死亡[2～4]。研究表明，占大腦內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞85%～95%的星形膠質(zhì)細(xì)胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能中起著至關(guān)重要的作用，包括支撐營養(yǎng)、維持突觸內(nèi)穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)并保護神經(jīng)元、參與血腦屏障等[5,6]，揭示星形膠質(zhì)細(xì)胞幾乎在所有的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中都發(fā)揮著重要的神經(jīng)保護或神經(jīng)毒性作用[7,8]，而其在炎癥反應(yīng)中具體的變化及發(fā)揮的作用仍不清楚。因此，本實驗通過體外給予LPS、IFN-γ炎性刺激，模擬體內(nèi)病理狀態(tài)下的大腦微環(huán)境，通過觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活及功能變化，從而為神經(jīng)炎癥發(fā)生發(fā)展的作用機制提供初步的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

C57BL/6 野生型新生仔鼠（1～3 d），由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，SPF 級，符合倫理學(xué)規(guī)定，遵循實驗動物管理條例。

1.2 主要試劑

DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25% 胰蛋白酶、HBSS 液 購 自Gibco 公 司；lipopolysaccharide (LPS)、interferon-γ (IFN-γ) 購 自Sigma 公 司；兔 抗iNOS、ARG1、β-actin、TNF-α、IL-10，鼠抗IL-6 均購自CST 公司，兔抗GFAP 購自DAKO 公司，TGF-β1 購自Sigma公司；Alexa Fluo594 熒光標(biāo)記山羊抗兔IgG 和山羊抗鼠IgG、Alexa Fluo488 熒光標(biāo)記山羊抗兔IgG 和山羊抗鼠IgG 抗體均購自Invitrogen 公司。H-1000 封片劑購自Vector 公司。

1.3 方法

1.3.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng) 按照常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)流程，進行小鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)。取出生1～3 d 的野生型C57BL/6 仔鼠的大腦皮層，鏡下剔除血管及被膜，0.25%胰蛋白酶消化液處理剪碎的組織，終止消化后，吹打，200 目篩網(wǎng)過濾，離心棄上清，制成單細(xì)胞懸液。以1×106密度接種在T 75 cm2培養(yǎng)瓶，于37 ℃孵育箱中培養(yǎng)，隨后每3 d 換液1 次，待細(xì)胞長至90%，進行細(xì)胞純化、傳代。傳至第3 代，GFAP 免疫染色鑒定純度達(dá)95%以上用于后續(xù)實驗。

1.3.2 實驗分組 參照文獻報道的炎性刺激方法[9,10]，取100 ng /ml LPS 和20 ng /ml IFN-γ 劑量，隨機分 為Control、LPS（100 ng/ml）、IFN-γ（20 ng/ml）、M1（LPS，100 ng/ml+IFN-γ，20 ng/ml）4 組。給藥處理24 h 后進行實驗。

1.3.3 免疫細(xì)胞化學(xué) 細(xì)胞炎性處理后，4%多聚甲醛室溫固定30 min，封閉液（0.3% Triton X-100+1%BSA）室溫孵育1 h，加入一抗（GFAP）溶液4 ℃孵育過夜，加入熒光二抗，室溫避光孵育2 h，胞核復(fù)染10 min，H-1000 封片劑封片。Olympus 激光共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像。

1.3.4 CCK-8 細(xì)胞活力檢測 將第3 代細(xì)胞種植于多聚賴氨酸包被的96 孔板內(nèi)。培養(yǎng)4 d 時，鏡下觀察細(xì)胞生長良好，細(xì)胞數(shù)量達(dá)到70%以上，LPS 和或IFN-γ 作用24 h 后，CCK-8 檢測，492 nm 處檢測吸光度，分析各組細(xì)胞的活力狀態(tài)。

1.3.5 Western blot 蛋白電泳 各組細(xì)胞加入RIPA 裂解液，超聲震碎儀冰上裂解30 min 后，4 ℃下13 000 r/min 離心15 min，收集樣本。BCA 蛋白定量。經(jīng)配膠、上樣、電泳（80～120 V）、轉(zhuǎn)膜（300 mA, 2 h,冰上）、封閉（室溫, 搖床30 r, 2 h）后，加入第一抗體（iNOS、ARG1、IL-10），4 ℃搖床孵育過夜。入HRP標(biāo)記的二抗，室溫/搖床孵育2 h。發(fā)光顯影，記錄圖像數(shù)據(jù)用于定量分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 5.0 軟件，采用One-way ANOVA 分析對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤( mean±SEM )表示。當(dāng)組間比較P值小于0.05時，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)與鑒定

鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞10 d 時，細(xì)胞貼壁生長，數(shù)量較多，呈“鋪路石”樣排列，胞核較大，呈圓形或卵圓形，胞體呈梭形，折光性偏暗，可發(fā)出許多胞突。傳代至第3代時，GFAP/Hoechst免疫熒光染色鑒定，星形膠質(zhì)細(xì)胞的純化率達(dá)95%以上（圖1）。

圖1 星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)與純度鑒定A：倒置相差顯微鏡下觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞的生長情況（10 d，視野下灰色區(qū)域為星形膠質(zhì)細(xì)胞，上層較小的發(fā)亮的細(xì)胞為小膠質(zhì)細(xì)胞） B：GFAP 陽性細(xì)胞率95%以上（紅色）Fig.1 Primary cultured astrocytes and its purity identification. A:The growth of astrocytes was observed under inverted phase contrast microscope(10 days, the gray and diffuse areas were astrocytes in the visual field, the smaller, shiny cells in the upper layer were microglia); B: The ratio of GFAP positive astrocytes was over 95% (red).

2.2 炎癥環(huán)境中，星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)改變，GFAP 陽性細(xì)胞數(shù)量增多

給予M1 刺激24 h 后，GFAP 陽性細(xì)胞胞體腫脹變大，形態(tài)改變并扭曲，突起變長，細(xì)胞數(shù)量明顯增多。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，與Control 組相比，M1 組GFAP 陽性細(xì)胞明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）（圖2）。

圖2 LPS 和IFN-γ 聯(lián)合刺激下星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)改變和數(shù)量變化A:免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，各組GFAP 陽性細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變（紅色）B:各組的GFAP 陽性細(xì)胞數(shù)量***P＜0.001Fig.2 The morphological and quantitative changes of astrocytes after LPS and IFN-γ combined stimulation. A:The morphological changes of GFAP positive astrocytes in each group were detected by immunocytochemical staining (red); B: The cell numbers of GFAP positive astrocytes in each group; ***P＜0.001.

2.3 炎癥干預(yù)下，星形膠質(zhì)細(xì)胞活力下降

給予LPS 和或IFN-γ 炎性刺激24 h 后，測定細(xì)胞活力。結(jié)果顯示，與Control 組相比，LPS 組、IFN-γ 組及M1 組的吸光度（Absorbance Values）均升高；其中M1 組吸光度顯著升高，表明其死亡細(xì)胞數(shù)目增多，細(xì)胞活力下降（P＜0.001）（圖3）。

圖3 炎癥刺激下星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞活力的變化情況各組細(xì)胞的吸光度比較,***P＜0.001 ns,無統(tǒng)計學(xué)意義Fig. 3 Cell viability of astrocytes under inflammatory stimulation. The absorbance values of each group were compared. ***P＜0.001, ns, no statistical significance.

2.4 炎癥干預(yù)下，星形膠質(zhì)細(xì)胞上誘導(dǎo)促炎因子表達(dá)升高

炎癥干預(yù)下，測定星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP 及促炎因子（iNOS、IL-6、TNF-α）表達(dá)的變化情況。Western blot 結(jié)果顯示，給予M1 刺激24 h 后，GFAP 及促炎因子iNOS、IL-6、TNF-α 的 蛋 白 表 達(dá) 顯 著 升 高，與Control 組、LPS 組和IFN-γ 組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）（圖4）。

圖4 Western blot 蛋白分析法測定炎癥刺激下促炎因子的蛋白表達(dá)水平A: GFAP, iNOS, IL-6, TNF-α和β-actin 的免疫蛋白條帶B: 各組的灰度值比較, *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001,ns.無統(tǒng)計學(xué)意義Fig. 4 The protein expression of pro inflammatory factors under inflammatory stimulation by Western blot. A: The immunoblotting bands of GFAP, iNOS, IL-6, TNF-α and β-actin; B:The gray values of each group were compared; *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001, ns,no statistical significance.

2.5 炎癥環(huán)境中，星形膠質(zhì)細(xì)胞上誘導(dǎo)抗炎因子表達(dá)情況

炎癥干預(yù)下，測定星形膠質(zhì)細(xì)胞抗炎因子（ARG1、IL-10 、TGF-β1）表達(dá)的變化情況。Western blot 結(jié)果顯示，與Control 組相比，給予LPS、IFN-γ 炎性刺激24 h 后，ARG1、IL-10 、TGF-β1 各組的表達(dá)水平呈上調(diào)趨勢；其中，與LPS 組相比，M1 組的ARG1表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖5）。

圖5 Western blot 法測定炎癥刺激下抗炎因子的蛋白表達(dá)水平A:ARG1, IL-10,TGF-β1 和βactin 的免疫蛋白條帶 B-D:各組的灰度值比較 *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001,ns.無統(tǒng)計學(xué)意義Fig.5 The protein expres sion of anti-inflammatory factors under inflammatory stimulation by Western blot. A: The immunoblotting bands of ARG1, IL-10, TGF-β 1 and β-actin; B-D: The gray values of each group were compared; *P＜0.05， **P＜0.01， ***P＜0.001， ns, no significance.

3 討論

神經(jīng)炎癥作為一種基本的細(xì)胞內(nèi)進程，依賴其與神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、血腦屏障和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中浸潤的T 細(xì)胞的細(xì)胞間相互作用，是阿爾茲海默癥、帕金森病、急性創(chuàng)傷性腦損傷及感染性神經(jīng)病理學(xué)等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的典型特征[11]。

近年來，對星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)炎癥中扮演的角色仍存在較大的分歧和爭議。研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活后，分泌營養(yǎng)因子等發(fā)揮神經(jīng)保護作用，而過度激活時，會分泌大量炎性因子，導(dǎo)致神經(jīng)損傷[12,13]。本研究旨在探討星形膠質(zhì)細(xì)胞參與神經(jīng)炎癥的功能意義，采用細(xì)胞培養(yǎng)、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫印跡等方法，觀察炎性刺激下星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活及其功能變化。結(jié)果表明：炎性刺激后，星形膠質(zhì)細(xì)胞被異常激活，數(shù)量增多，形態(tài)改變，促炎因子iNOS、IL-6、TNF-α 表達(dá)上調(diào)，發(fā)生A1 樣功能極化表現(xiàn)。

結(jié)合文獻報道及前期研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)炎癥是把“雙刃劍”，核心環(huán)節(jié)是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活，在促炎環(huán)境中，小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生M1/M2 極化，分泌部分炎性因子，一方面作用于神經(jīng)元，引起變性死亡，另一方面激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，分泌細(xì)胞因子，加重神經(jīng)炎癥與損傷；相反，在抗炎環(huán)境中，M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞作用星形膠質(zhì)細(xì)胞，使其發(fā)生A2 表型，二者協(xié)同發(fā)揮神經(jīng)保護或神經(jīng)修復(fù)作用[14-16]。前期研究發(fā)現(xiàn)，LPS 作用于小膠質(zhì)細(xì)胞后，小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生M1/M2 極化，而在星形膠質(zhì)細(xì)胞作用不顯著；給予M1 刺激后，星形膠質(zhì)細(xì)胞極化效果顯著。也就是說，部分的星形膠質(zhì)細(xì)胞被LPS 激活后，同時釋放促炎因子和抗炎因子，一方面引發(fā)/加速炎癥反應(yīng)，另一方面清除細(xì)胞碎屑、營養(yǎng)修復(fù)受損細(xì)胞。因此，LPS 組的促炎因子和抗炎因子均表達(dá)上調(diào)。給予M1 刺激后，顯著激活星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生極化，與LPS 組相比，促炎效應(yīng)明顯大于抗炎效應(yīng)，導(dǎo)致促炎因子表達(dá)明顯升高，而部分抗炎因子表達(dá)呈下調(diào)趨勢；引起我們思考的是，與CON 組相比，LPS 組和M1 組的抗炎因子均上調(diào)，M1 組僅比LPS 組表達(dá)略低，可能是因為在LPS 作用下，被激活的部分星形膠質(zhì)細(xì)胞為抗炎型細(xì)胞，為了穩(wěn)定細(xì)胞/機體狀態(tài)，分泌部分抗炎因子（ARG1、IL-10、TGF-β 1），發(fā)揮神經(jīng)保護作用；而在M1 作用下，星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯激活極化，促炎型細(xì)胞數(shù)量明顯多于抗炎型細(xì)胞數(shù)量，但抗炎型細(xì)胞仍有部分存活，從而炎性因子明顯上調(diào)，而抗炎因子降低。此外，TGF-β1 作為星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性分泌因子，星形膠質(zhì)細(xì)胞受不同程度刺激后均會分泌TGF-β1，TGF-β1 表達(dá)上調(diào)。該結(jié)果提示炎性刺激誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生A1 樣極化及功能變化，有助于深入認(rèn)識星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)炎癥中的角色及機制問題。

盡管有學(xué)者認(rèn)為，主導(dǎo)神經(jīng)炎癥發(fā)生的是小膠質(zhì)細(xì)胞的“第一觸發(fā)或反應(yīng)識別”，但我們認(rèn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)炎癥的后續(xù)發(fā)展中扮演著不容忽視的角色。一是星形膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布廣泛，二是其在生理穩(wěn)態(tài)和病理進程中的價值，都值得我們強烈關(guān)注。此外，在神經(jīng)炎癥的發(fā)生發(fā)展中，小膠質(zhì)細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的互作效應(yīng)也值得深入研究。