李尚丹, 鄧儀昊, 何紅云

(1)昆明理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室, 昆明 650500;2)昆明理工大學(xué)附屬安寧市第一人民醫(yī)院醫(yī)院辦公室, 昆明 650399)

缺血性腦卒中 (ischemic stroke,IS)是一種因大腦局部血流中斷造成中樞神經(jīng)系統(tǒng) (central nervous system,CNS)損傷的腦功能障礙疾病[1],誘發(fā)興奮性毒性、氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥、細(xì)胞凋亡等一系列級聯(lián)反應(yīng),進(jìn)一步加重缺血區(qū)神經(jīng)元損傷甚至死亡[2]。在缺血性腦卒中缺血、缺氧和營養(yǎng)缺乏等應(yīng)激條件的刺激下,自噬被不同程度激活以減輕神經(jīng)元損傷[3]。自噬是一種由溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)分解代謝機(jī)制,蛋白質(zhì)、受損線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等自噬底物被膜包裹成自噬體,隨后與溶酶體融合,利用溶酶體中的酶將自噬底物降解后再利用,以維持細(xì)胞正常的結(jié)構(gòu)和功能[4],這一動態(tài)的連續(xù)變化過程稱為“自噬流”[5]。

自噬流中任何一個步驟的中斷都會導(dǎo)致自噬流障礙[6]。自噬流障礙會導(dǎo)致自噬底物無法被及時降解進(jìn)行再利用,進(jìn)而加重大腦缺血區(qū)神經(jīng)元損傷[7]。其中,溶酶體功能障礙和自噬體-溶酶體融合障礙是導(dǎo)致自噬流障礙的主要因素(Fig.1)[6]。溶酶體功能和自噬體-溶酶體融合嚴(yán)格受到轉(zhuǎn)錄因子EB(transcription factor EB,TFEB)的調(diào)控[8]。TFEB的活性與其磷酸化狀態(tài)有關(guān)[9]。當(dāng)TFEB的2個特殊的絲氨酸殘基Ser142和Ser211均被磷酸化時,TFEB留存在細(xì)胞質(zhì)中為無活性狀態(tài)[10]。而去磷酸化的TFEB具有活性,會轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核激活自噬相關(guān)基因的表達(dá),增強(qiáng)溶酶體功能并促進(jìn)自噬體-溶酶體融合,進(jìn)而改善自噬流障礙,減輕缺血性腦卒中后的神經(jīng)元損傷[11]。

Fig.1 Neuronal autophagic flux dysfunction in ischemic stroke (Created with MedPeer (www.medpeer.cn)) The substrates to be degraded are engulfed by a flat membrane called an isolated membrane. When it is wrapped into a closed double-membrane organelle, autophagosomes are formed. Mature autophagosomes fuse with lysosomes to form autolysosomes. The components to be degraded are finally hydrolyzed by various acidic hydrolases in lysosomes, and the degraded components are recycled by cells. This continuous process is called autophagic flux. The interruption of any step in the autophagic flux of ischemic stroke will lead to autophagic flux dysfunction. The proteins and cellular components in the cells cannot be cleared in time and accumulate in large quantities, which in turn aggravates neuronal damage in the cerebral ischemic area

本文將詳細(xì)闡述缺血性腦卒中后TFEB核轉(zhuǎn)位的分子機(jī)制,進(jìn)一步分析TFEB核轉(zhuǎn)位可增強(qiáng)溶酶體功能并促進(jìn)自噬體-溶酶體融合,以期為未來臨床研究靶向TFEB改善自噬流障礙治療缺血性腦卒中提供理論依據(jù)。

1 自噬流障礙是腦缺血后神經(jīng)元損傷的重要病理機(jī)制

溶酶體功能受損、過度自噬或自噬不足、自噬體-溶酶體融合障礙等都會導(dǎo)致自噬流障礙,使細(xì)胞中蛋白質(zhì)和細(xì)胞成分無法被及時清除而大量聚集,誘發(fā)多種人類疾病,包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病和癌癥等[12]。溶酶體發(fā)揮降解作用是依靠其內(nèi)部的酸性水解酶實(shí)現(xiàn)的,包括組織蛋白酶D (cathepsin D,CTSD)、組織蛋白酶B (cathepsin B,CTSB)、組織蛋白酶L (cathepsin L,CTSL)等[13]。其中,CTSD是參與自噬-溶酶體降解底物的主要水解酶,改變CTSD活性或表達(dá)水平都可能會導(dǎo)致溶酶體功能受損[14]。Hossain[15]等研究發(fā)現(xiàn),在原代神經(jīng)元細(xì)胞中敲除CTSD會導(dǎo)致溶酶體功能障礙,進(jìn)一步加重大腦缺血性神經(jīng)元損傷。因此,溶酶體功能受損會引發(fā)自噬流障礙,加快缺血性腦卒中的病理進(jìn)程。

在腦缺血時,過度自噬或自噬不足也會誘發(fā)細(xì)胞死亡并加重缺血性腦損傷[4]。過度自噬使細(xì)胞成分被溶酶體過度降解,造成降解產(chǎn)物大量堆積,引發(fā)自噬流障礙,導(dǎo)致細(xì)胞死亡[16]。在缺血性中風(fēng)小鼠中,白細(xì)胞介素 (interleukin,IL)-17A水平顯著升高,IL-17A介導(dǎo)的過度自噬會加快神經(jīng)元凋亡和壞死,從而加重缺血性腦損傷[17]。而自噬水平不足使得自噬底物不能被溶酶體有效降解,引發(fā)底物堆積,也會導(dǎo)致自噬流障礙[16]。此外,小鼠腦缺血會誘導(dǎo)miR-497表達(dá),miR-497過表達(dá)會降低自噬水平,使自噬水平不足,誘導(dǎo)缺血后神經(jīng)元的死亡[18]。由此可見,過度自噬或自噬不足都會引起自噬流障礙,繼而加重缺血性腦損傷。

自噬體與溶酶體的融合是自噬完成的關(guān)鍵,自噬體-溶酶體融合障礙會導(dǎo)致自噬-溶酶體不能形成,阻斷自噬流[19]。既往研究表明,突觸融合蛋白17(syntaxin 17,STX17)是參與自噬體和溶酶體融合的重要可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor,SNARE)蛋白,使用腺相關(guān)病毒9 (adeno-associated virus 9,AAV9)敲低小鼠大腦中STX17會抑制自噬體和溶酶體的融合,加重腦缺血再灌注損傷 (ischemia-reperfusion injury,IR)程度[20]。因此,自噬體與溶酶體融合障礙會導(dǎo)致神經(jīng)元自噬流障礙,加劇腦缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。

綜上所述,自噬流障礙是腦缺血后神經(jīng)元損傷的重要病理機(jī)制。新近研究表明,TFEB核轉(zhuǎn)位會通過及時清除自噬底物以促進(jìn)細(xì)胞更新,改善自噬流障礙,對神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用[21]。

2 轉(zhuǎn)錄因子EB核轉(zhuǎn)位可改善卒中后的自噬流障礙

TFEB是進(jìn)化上保守的小眼畸形轉(zhuǎn)錄因子 (microphthalmia associated transcription factor,MITF)家族成員之一,具有典型的堿性螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸-拉鏈 (basic helix-loop-helix leucine zipper,bHLH-Zip)結(jié)構(gòu)[22]。TFEB活化會激活自噬,進(jìn)而調(diào)控凋亡、炎癥和氧化應(yīng)激等信號過程[23]。更具體地說,TFEB的激活會促進(jìn)自噬流,刺激線粒體自噬,限制活性氧 (reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生,抑制炎癥小體的激活,并抑制白介素的分泌,最終抑制細(xì)胞焦亡和炎癥等反應(yīng)[24, 25]。

TFEB是自噬流信號通路的關(guān)鍵中樞調(diào)節(jié)因子。TFEB與位于自噬和溶酶體基因啟動子區(qū)域的“協(xié)同溶酶體表達(dá)與調(diào)控 (coordinated lysosomal expression and regulation, CLEAR)”元件結(jié)合,進(jìn)而驅(qū)動自噬過程和溶酶體生物發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá),包括自噬啟動相關(guān)基因 (BECN1、WIPI1、ATG9B和NRBF2)以及自噬體與溶酶體融合相關(guān)基因 (UVRAG,RAB7)等基因[26]。TFEB核轉(zhuǎn)位通過促進(jìn)自噬體形成和自噬體-溶酶體融合,進(jìn)而加快清除自噬底物,利于神經(jīng)元存活[27]。根據(jù)研究顯示,在大鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞中敲除TFEB會導(dǎo)致自噬流信號通路受損,使胞內(nèi)蛋白質(zhì)聚集體和受損細(xì)胞器無法被及時清除而積累,對神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷[28]。此外,擬人參皂苷F11 (pseudoginsenoside F11,PF11)在永久性腦缺血期間通過上調(diào)鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin,CaN)活性進(jìn)而促TFEB核轉(zhuǎn)位,減少自噬體及底物的異常堆積,以減輕自噬流障礙和缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷[29]。

綜上,TFEB是自噬流信號通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,TFEB核轉(zhuǎn)位可改善卒中后自噬流障礙。而TFEB的表達(dá)、定位和活性受到翻譯后修飾的嚴(yán)格調(diào)控[30]。

3 轉(zhuǎn)錄因子EB核轉(zhuǎn)位的調(diào)控機(jī)制

TFEB的細(xì)胞定位和活性主要由其磷酸化調(diào)控[31]。生理?xiàng)l件下,磷酸化的TFEB與14-3-3黏附蛋白結(jié)合形成非活性形式的復(fù)合物錨定在細(xì)胞質(zhì)中[32]。當(dāng)細(xì)胞受到饑餓、溶酶體功能異常等外界刺激時,去磷酸化的TFEB與14-3-3黏附蛋白解離后活化,隨后從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核(Fig.2)[10]。

Fig.2 TFEB nuclear translocation enhances autophagic flux (Created with MedPeer (www.medpeer.cn)) The cellular localization and activity of TFEB are closely related to its phosphorylation. The activation of mTORC1 can inhibit its nuclear translocation by phosphorylating TFEB. Calcineurin mediates the dephosphorylation of TFEB.Dephosphorylated TFEB enters the nucleus and binds to the CLEAR sequence in the nucleus, promotes the expression of downstream lysosomal genes, and enhances the biosynthesis and physiological function of lysosomes

TFEB磷酸化由多種激酶催化,使其保留在細(xì)胞質(zhì)中,包括哺乳動物雷帕霉素靶蛋白1 (mammalian/mechanistic targets of rapamycin complex 1,mTORC1)、蛋白激酶C-β (protein kinase C-beta,PKC-β)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶 (extracellular signal regulated kinase,ERK)、蛋白激酶B (protein kinase B,Akt)、糖原合酶激酶-3β (glycogen synthase kinase-3beta,GSK-3β)等[10]。其中,mTORC1介導(dǎo)的TFEB磷酸化是最廣泛研究的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[31]。TFEB是mTORC1的直接下游靶標(biāo)[33]。在營養(yǎng)豐富、無溶酶體應(yīng)激和液泡型三磷酸腺苷酶 (vacuolar-type adenosinetriphosphatases,V-ATPases)不被抑制的條件下,V-ATPases、Ragulator復(fù)合體和Rag GTP酶形成活性復(fù)合物,在溶酶體表面與mTORC1結(jié)合并激活mTCOR1[34]。mTORC1介導(dǎo)TFEB的2個絲氨酸殘基Ser142和S211磷酸化,磷酸化的TFEB與細(xì)胞質(zhì)中的14-3-3黏附蛋白結(jié)合,掩蓋位于Ser241和Ser252之間的核定位信號 (nuclear localization signal,NLS),將TFEB保留在細(xì)胞質(zhì)中[35, 36]。而在饑餓、溶酶體應(yīng)激或V-ATPases抑制的條件下,Rag GTP酶被關(guān)閉,其從溶酶體表面釋放mTORC1并將其滅活[22]。由于mTORC1不能再磷酸化TFEB,去磷酸化的TFEB轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中并與其靶基因的CLEAR序列結(jié)合,上調(diào)自噬和溶酶體基因的表達(dá)[37]。

鈣調(diào)磷酸酶使TFEB去磷酸化,誘導(dǎo)TFEB由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核,激活其轉(zhuǎn)錄活性,以誘導(dǎo)激活自噬和溶酶體相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄[38]。在饑餓或高能耗的情況下,溶酶體通過粘脂蛋白1 (mucolipin 1,MCOLN1)釋放鈣離子,引起局部鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo),激活鈣調(diào)磷酸酶,鈣調(diào)磷酸酶結(jié)合TFEB并使其去磷酸化,從而促進(jìn)TFEB核轉(zhuǎn)位和靶基因轉(zhuǎn)錄[39]。

由此可見,TFEB通過磷酸化、去磷酸化在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間不斷穿梭來快速響應(yīng)環(huán)境變化,從而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。

4 轉(zhuǎn)錄因子EB核轉(zhuǎn)位改善自噬流障礙減輕缺血性腦損傷的機(jī)制

4.1 TFEB核轉(zhuǎn)位增強(qiáng)溶酶體功能高效代謝底物

溶酶體在調(diào)節(jié)自噬流信號通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用,是參與細(xì)胞內(nèi)底物降解過程的細(xì)胞器,維持其功能的正常是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)所必需的[40]。TFEB磷酸化會抑制其核轉(zhuǎn)位,使溶酶體生物合成減少,最終導(dǎo)致溶酶體功能障礙[41]。而TFEB去磷酸化激活核轉(zhuǎn)位時,粘脂蛋白1(mucolipin 1,MCOLN1)介導(dǎo)溶酶體釋放鈣離子,調(diào)節(jié)溶酶體胞吐作用及溶酶體酶的分解代謝活性,以增加溶酶體的數(shù)量并增強(qiáng)溶酶體功能,加快病理?xiàng)l件下的細(xì)胞降解清除底物的速率[42]。我們以往的研究發(fā)現(xiàn),腦缺血發(fā)生時,GSK-3β會增加TFEB磷酸化,抑制TFEB核轉(zhuǎn)位,使溶酶體生物合成減少,引起溶酶體功能障礙,加重神經(jīng)元損傷。而抑制GSK-3β能促進(jìn)神經(jīng)元中TFEB核表達(dá),增強(qiáng)神經(jīng)元溶酶體功能,以達(dá)到神經(jīng)保護(hù)的目的[43]。因此,TFEB核轉(zhuǎn)位增強(qiáng)溶酶體的功能后會高效降解代謝底物,進(jìn)而改善自噬流障礙,從而發(fā)揮對腦缺血損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。

4.2 TFEB核轉(zhuǎn)位介導(dǎo)自噬體與溶酶體融合上調(diào)自噬流

自噬體和溶酶體的融合是溶酶體降解自噬底物的基礎(chǔ)[44]。TFEB核轉(zhuǎn)位不僅增強(qiáng)溶酶體功能,而且促進(jìn)自噬體-溶酶體融合[45]。新近研究表明,運(yùn)動促進(jìn)皮層中TFEB的核轉(zhuǎn)位,促進(jìn)自噬體與溶酶體融合,形成自噬-溶酶體,上調(diào)自噬流活性,有助于提高突變蛋白的清除效率[46]。并且,海藻糖通過上調(diào)腺苷5′-單磷酸激活蛋白激酶和輔激活蛋白關(guān)聯(lián)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1活性,進(jìn)而誘導(dǎo)TFEB激活,促進(jìn)自噬體與溶酶體融合,改善自噬流障礙,有效降低高鹽喂養(yǎng)的卒中型自發(fā)性高血壓大鼠的卒中發(fā)病率[47]。此外,蜜二糖通過促進(jìn)神經(jīng)元中的TFEB核轉(zhuǎn)位促自噬-溶酶體形成,改善自噬流障礙,從而賦予對腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用[48]。上述結(jié)果表明,TFEB核轉(zhuǎn)位調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因的表達(dá),促進(jìn)自噬體與溶酶體融合,改善缺血性腦卒中后自噬流障礙。

5 問題與展望

自噬流障礙與缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān),而TFEB在自噬流信號通路中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。目前,通過靶向TFEB以調(diào)節(jié)自噬流信號通路是減輕缺血后腦損傷程度的有效方法,但由于TFEB下游機(jī)制、靶基因以及TFEB激活的潛在機(jī)制尚未完全確定,促進(jìn)TFEB核轉(zhuǎn)位的方法和分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究探索。此外,靶向TFEB調(diào)控自噬途徑的生物活性物質(zhì)尚處于起步階段,未來具有巨大潛力。加大對TFEB的分子機(jī)制和藥物的研究力度有望成為開發(fā)治療缺血性腦卒中的新策略。