王姿楊 ，邢耀瑩 ，付文芮 ，王 露 ，鄧小斌 ，龐 哲 ，崔治家 *，邵 晶 ,

1. 甘肅中醫(yī)藥大學藥學院，甘肅 蘭州 730000

2. 西北中藏藥省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730000

3. 甘肅省高校中（藏）藥化學與質(zhì)量研究省級重點實驗室，甘肅 蘭州 730000

4. 甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室，甘肅 蘭州 730000

甘松NardostachyosRadixet Rhizoma 為敗醬科植物甘松NardostachysjatamansiDC.的干燥根及根莖，是我國應用歷史悠久的傳統(tǒng)中藥及藏藥，在阿育吠陀和烏納尼醫(yī)學體系中也一直用于治療各種疾病。最早記載于唐代陳藏器所著的藥學專著《本草拾遺》中。甘松性辛、甘，溫；歸脾、胃經(jīng)；具有理氣止痛、開郁醒脾、外用祛濕消腫的功效。臨床上常用于治療脘腹脹滿、食欲不振、嘔吐；外用治療牙痛、腳氣腫毒[1]。甘松中含有萜類、黃酮類、醌類、糖類、香豆素類、木脂素類等成分[2-6]?，F(xiàn)代藥理研究表明，甘松具有抗心律失常、抗氧化、抑菌、抗炎、抗瘧、抗抑郁、降血壓、鎮(zhèn)靜、抗癲癇、保護心肌細胞等多種生物活性[7-18]。

我國甘松藥材以野生為主，主要分布在西藏、四川、甘肅、青海等省份[19]。由于采收、加工、儲藏等環(huán)節(jié)的不規(guī)范性，導致市場甘松藥材質(zhì)量差異較大，且常摻雜有其他植物干燥根及根莖，有時難以識別，《中國藥典》2020 年版對甘松質(zhì)量評價以揮發(fā)油和甘松新酮含量為指標，文獻研究多以揮發(fā)油、甘松新酮、綠原酸和蒙花苷等作為指標性成分對甘松藥材進行質(zhì)量控制[20]，另有文獻研究丁香酸、馬兜鈴酮同樣作為甘松藥材的化學成分[21-22]，分別具有抗肺癌藥理作用[23]、殺傷癌細胞作用[24]。本課題組前期開展的基于“網(wǎng)絡藥理學-分子對接-藥效學驗證”的甘松“理氣止痛、開郁醒脾”功效質(zhì)量標志物研究，也表明綠原酸、丁香酸、甘松新酮、馬兜鈴酮等可作為甘松質(zhì)量標志成分，相關研究結(jié)果另行發(fā)表。目前尚無文獻報道甘松中丁香酸、馬兜鈴酮2 種化學成分在HPLC 研究中的指認及定量分析，故對甘松原料藥材、飲片、藥材粉末的綜合質(zhì)量評價中尚缺乏全面性，因此有必要對甘松建立基于臨床有效性的多成分綜合評價方法。

本研究以收集到的16 個批次的甘松藥材作為研究對象，通過HPLC 法對甘松中綠原酸、丁香酸、蒙花苷、甘松新酮、馬兜鈴酮5 種化學成分同時進行含量測定，建立不同批次甘松樣品指紋圖譜，并運用主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚類分析（cluster analysis，HCA），對所有樣品的圖譜進行探索性分析，結(jié)合正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）篩選不同批次甘松藥材的差異成分，并對其共有峰進行分析，同時構(gòu)建甘松藥材的主成分綜合評價模型，為甘松藥材的質(zhì)量綜合評價提供方法和參考依據(jù)，以期規(guī)范當前甘松藥材的市場流通及產(chǎn)地采收加工現(xiàn)狀，同時保障優(yōu)質(zhì)的甘松藥材能夠應用于中醫(yī)藥臨床。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ME204E 型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；BS110S 型十萬分之一電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國 Waters 公司）；YH-IS 型遠紅外電熱鼓風干燥箱（上海錦屏儀器儀表有限公司通州分公司）；3 號藥典篩（浙江上虞市金鼎標準篩具廠）。

1.2 材料

對照品綠原酸（批號A22GB158496）、丁香酸（ 批號 S18J10K93270 ）、 蒙花苷（ 批號A02GB144093）、甘松新酮（批號H30D5X1）、馬兜鈴酮（批號R09J9F63410），購自上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分數(shù)均大于98%。甲醇（色譜純，批號 20220103）、乙腈（色譜純，批號20230301）、85%磷酸（色譜純，批號20210415）、乙醇（分析級，批號20220901），購自天津市大茂化學試劑廠。實驗用甘松藥材為2022 年6、10 月分別于四川、青海、甘肅3 個省野外采集的樣品。經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學崔治家教授鑒定為敗醬科植物甘松N.jatamansiDC.的干燥根及根莖，共16 批（編號S1～S16），具體信息見表1。

表1 甘松藥材來源Table 1 Sources of N. jatamansi

2 方法

2.1 不同產(chǎn)地甘松樣品HPLC 指紋圖譜的建立

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、丁香酸、蒙花苷、甘松新酮、馬兜鈴酮5 種對照品適量，加甲醇分別制成一定質(zhì)量濃度的母液，分別量取一定體積混合，制成含綠原酸80.0 μg/mL、丁香酸0.8μg/mL、蒙花苷3.5 μg/mL、甘松新酮700.0 μg/mL、馬兜鈴酮175.0 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取甘松藥材細粉0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入95%乙醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min（30 ℃、40 kHz、600 W），放冷，用95%乙醇補足質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液10 mL，水浴蒸干，用甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中，搖勻，過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.1.3 色譜條件 色譜條件參考楊祎辰等[25]研究，并在其基礎上加以改善，最終確定色譜條件：Agilent 5 HC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為0.2%磷酸水溶液（B）-乙腈（D），梯度洗脫（0～20 min，10%～35% D；20～23 min，35%～40% D；23～37 min，40%～54% D；37～42 min，54%～69%D；42～47 min，69%～72% D；47～48 min，72%～10% D）；體積流量為1.0 mL/min；檢測波長為275 nm；柱溫30 ℃；進樣量為10 μL。

2.1.4 精密度試驗 取甘松樣品（S1），按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1.3”項下色譜條件重復進樣6 次，測得各共有峰保留時間的RSD均小于0.35%，峰面積的RSD 均小于1.91%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 重復性試驗 取甘松樣品（S1）6 份，按照“2.1.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.3”項色譜條件下進樣測得各共有峰保留時間的RSD 均小于0.35%，峰面積的RSD 均小于2.98%。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取甘松樣品（S1），按照“2.1.2”項方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件，分別于制備后的0、2、4、8、12、16、24 h 進樣分析，測得各共有峰保留時間的RSD 均小于0.36%，峰面積的RSD 均小于2.47%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 指紋圖譜的建立及化學計量學分析 將“2.1.2”項下方法制成的16 批供試品溶液按“2.1.3”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。并導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）》，以S1樣品為參照指紋圖譜（R），設置時間窗寬度為0.2 min，采用多點校正法自動匹配分析法建立指紋圖譜，中位數(shù)法生成對照指紋圖譜，并進行相似度計算。將得到的60 個共有峰的峰面積導入SPSS 25.0進行HCA 分析，SIMCA 14.1 進行PCA 分析、OPLSDA 分析。

2.2 5 個指標成分含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 同“2.1.1”項。

2.2.2 供試品溶液的制備 同“2.1.2”項。

2.2.3 色譜條件 同“2.1.3”項。

2.2.4 線性關系考察 取“2.1.1”項下混合對照品溶液，用甲醇逐次稀釋成系列不同濃度，進樣測定，記錄5 種成分的色譜峰面積，以各成分的峰面積為縱坐標（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，分別建立綠原酸、丁香酸、蒙花苷、甘松新酮和馬兜鈴酮的線性回歸方程，計算相關系數(shù)（R2），各相關系數(shù)均大于0.999 6，表明各成分線性關系良好，見表2。

表2 甘松藥材中5 種成分線性關系考察結(jié)果Table 2 Results of linear relationship between five components of N. jatamansi

2.2.5 精密度試驗 精密吸取“2.1.1”項下混合對照品溶液，在“2.1.3”項條件下連續(xù)進樣6 次，記錄綠原酸、丁香酸、蒙花苷、甘松新酮、馬兜鈴酮的峰面積積分值，計算RSD 分別為2.02%、2.87%、2.02%、1.08%、2.08%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復性試驗 精密稱取甘松樣品粉末（S1）6 份，按照“2.1.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.3”項色譜條件下進樣測定，計算綠原酸、丁香酸、蒙花苷、甘松新酮、馬兜鈴酮的平均質(zhì)量分數(shù)分別為1.590 0、0.038 4、0.043 5、10.242 3、1.576 3 mg/g，RSD 分別為2.66%、1.23%、0.90%、1.84%、3.25%，表明該方法重復性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取甘松樣品（S1），按照“2.1.2”項方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件，分別于制備后的0、2、4、8、12、16、24 h 進樣分析，記錄綠原酸、丁香酸、蒙花苷、甘松新酮、馬兜鈴酮的峰面積積分值，計算RSD 分別為2.47%、2.37%、1.98%、1.47%、1.64%，表明樣品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知成分含量的甘松粉末9 份（S1），每份約0.25 g，置具塞錐形瓶中，按比例（1∶0.8、1∶1、1∶1.2）分別精密加入一定體積的對照品溶液，每個比例按“2.1.2”項方法平行制備3 份供試品溶液，在“2.1.3”項下方法進樣分析，計算加樣回收率和RSD 值。結(jié)果綠原酸、丁香酸、蒙花苷、甘松新酮、馬兜鈴酮的平均回收率分別為99.41%、98.96%、99.13%、102.97%、101.03%，RSD 分別為1.33%、1.87%、1.91%、0.96%、1.58%。

2.2.9 樣品測定 分別精密稱取16 批次甘松樣品粉末0.5 g（平行3 份），按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.3”項條件下進樣分析，測定5 個成分峰面積，代入“2.2.4”項下直線回歸方程，計算各成分的質(zhì)量分數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 HPLC 指紋圖譜的建立

將16 批次樣品色譜數(shù)據(jù)導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）》，建立16 批樣品的HPLC 指紋圖譜（圖1），以S1 為參照圖譜，時間窗口設定為0.2 min，以中位數(shù)法建立對照圖譜（R），采用多點校正全譜峰自動匹配共得到60 個共有峰，通過與混合對照品溶液圖譜（圖2）比對，指認出其中5 個共有峰，依次為綠原酸（7 號峰）、丁香酸（13 號峰）、蒙花苷（32號峰）、甘松新酮（50 號峰）、馬兜鈴酮（55 號峰）。

圖1 16 批次甘松的HPLC 疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜 (R)Fig.1 HPLC superimposed fingerprints and control fingerprints of 16 batches of N. jatamansi (R)

圖2 混合對照品溶液的HPLC 圖Fig.2 HPLC diagram of mixed reference solution

3.2 共有峰面積差異分析

不同產(chǎn)地甘松藥材各共有峰峰面積RSD 為26.17%～88.42%，且7（綠原酸）、50（甘松新酮）、52、55（馬兜鈴酮）號共有峰峰面積相對較高；四川產(chǎn)甘松藥材各共有峰峰面積RSD 為1.12%～65.72%，且7、12、35、50、52、55、59 號共有峰峰面積相對較高；青海河南產(chǎn)甘松藥材各共有峰峰面積RSD 為22.98%～72.76%，且7、12、35、41、49、50、52、55、59 號共有峰峰面積相對較高；甘肅瑪曲產(chǎn)甘松藥材7、12、50、52、55 號共有峰峰面積相對較高。不同產(chǎn)地甘松藥材的共有峰峰面積差異較大，其中均以50 號共有峰甘松新酮的峰面積最高。

3.3 相似度分析

以生成的對照指紋圖譜為標準，計算16 批次甘松樣品的相似度，結(jié)果如表3 所示，樣品相似度為0.943～0.999，其中四川甘松相似度為 0.943～0.974，平均相似度為0.956；青海甘松相似度為0.981～0.999，相似度較高，平均相似度為0.997；甘肅甘松相似度為0.959，表明各批次甘松樣品之間不同峰面積對應的成分含量存在一定差異，可通過指紋圖相似度結(jié)果將青海甘松分別與四川、甘肅甘松進行區(qū)分，但甘肅甘松并未能通過指紋圖譜相似度與四川甘松進行有效區(qū)分。從平均相似度來看，呈現(xiàn)青海＞甘肅＞四川的趨勢。

表3 16 批次甘松樣品HPLC 指紋圖譜相似度評價結(jié)果Table 3 HPLC fingerprint similarity evaluation results of 16 batches of N. jatamansi samples

3.4 化學模式識別

3.4.1 HCA 以指紋圖譜60 個共有峰的峰面積為變量，進行min-max 標準化處理，導入SPSS 25.0軟件，采用組間聯(lián)接、歐式距離法進行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果如圖3 所示，各色塊顏色由藍至紅分別代表各化合物峰面積由低到高，當距離為20 時，16 批甘松樣品可聚為2 類，其中5 批甘松（S1～S3、S6、S15）聚為第1 類，分別產(chǎn)自四川阿壩州、青海河南縣、甘肅瑪曲縣；其余甘松（S4、S5、S7～S14、S16）聚為第2 類，均產(chǎn)自青海河南縣；當距離為15 時，16 批甘松樣品可聚為3 類，其中3 批甘松（S1～S3）聚為第1 類，產(chǎn)自四川阿壩州，此類樣品各共有峰代表的化學成分含量高低不一；2 批甘松（S6、S15）聚為第2 類，分別產(chǎn)自青海河南縣、甘肅瑪曲縣，此類樣品各共有峰代表的化學成分含量均相對較??；其余甘松（S4、S5、S7～S14、S16）聚為第3 類，均產(chǎn)自青海河南，此類樣品各共有峰代表的化學成分含量整體分布較為均勻，且各成分相對含量均處于較高水平。HCA 結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的甘松藥材質(zhì)量存在一定的差異，除S6 外，均可按其產(chǎn)地來源進行有效區(qū)分。

圖3 甘松60 個共有峰的聚類分析熱圖Fig.3 Cluster analysis heat map of 60 common peaks of N.jatamansi

3.4.2 PCA 以60 個共有峰的峰面積為變量，得到16×60 階數(shù)據(jù)矩陣，導入SIMCA 14.1 軟件進行PCA，以主成分特征值＞1 為提取標準，得到7個主成分，其累積方差貢獻率為94.503%，說明這7 個主成分能充分代表甘松藥材的基本特征和主要信息。特征值及貢獻率見表4。

表4 特征值及方差貢獻率Table 4 Characteristic values and variance contribution rate

進一步通過將各特征向量標準化后，由PC1（52.408%）和PC2（16.338%）為坐標軸構(gòu)建的PCA得分散點圖可以看出不同產(chǎn)地的甘松樣品（除S6外）明顯分開，如圖4，結(jié)果顯示不同產(chǎn)地的16 批樣品被分為3 類，與HCA 結(jié)果完全一致。

圖4 16 批不同產(chǎn)地甘松樣品的PCA 散點得分圖Fig.4 Scatter plot of PCA scores of 16 batches of N.jatamansi samples of different origins

因子載荷矩陣反映了各主成分與60 個共有峰即原始變量之間的相關系數(shù)，見表5。結(jié)果表明，主成分1 主要反映了色譜峰3、4、7、9～22、24、26～31、34、37～39、41、42、44～50、52～56、58、59 的信息，主成分2 主要反映了色譜峰1、2、5、6、23、33、35、36、40、57 的信息，主成分3主要反映了色譜峰8、25、32 的信息，主成分4 主要反映了色譜峰43 的信息，主成分5 主要反映了色譜峰60 的信息，主成分6 主要反映了色譜峰56的信息，主成分7 主要反映了色譜峰51 的信息。

表5 因子載荷矩陣Table 5 Factor load matrix

3.4.3 OPLS-DA 為了更好地分析不同產(chǎn)地甘松樣本之間的差異，采用SMICA 14.1 軟件對16 批甘松藥材60 個共有峰進行有監(jiān)督的OPLS-DA（模型的擬合效果通常通過R2X、R2Y、Q2這3 個指標來評價，這些指標大于0.5 較為可信，并且越接近1說明模型的擬合效果越好[25-27]）散點得分圖見圖5。結(jié)果顯示，同HCA 和PCA 一致，分為3 類。200 次置換檢驗顯示該模型不存在過擬合（圖6）。變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值是篩選差異性化合物的重要指標，VIP 值越高，對組間差異的影響越大[28]。以VIP＞1 篩選出差異化合物，由VIP 得分圖（圖7）可知，貢獻值較大的差異化合物有31 個，依次為35、57、40、33、45、23、28、38、36、30、48、9、52、49、50、41、44、55、7、18、34、59、31、26、13、27、17、46、20、29、54 號峰，其中7 號峰為綠原酸，13 號峰為丁香酸、50 號峰為甘松新酮，55 號峰為馬兜鈴酮，這些化合物是甘松各批次樣品間產(chǎn)生差異的主要標志性成分，提示在甘松的質(zhì)量控制和品質(zhì)評價中，應重點關注這些成分的含量變化。而32 號峰為蒙花苷，但32 號峰并未出現(xiàn)在VIP＞1 的色譜峰中，則基于本研究樣本，提示它可能不是甘松質(zhì)量差異的主要成分。

圖5 16 批甘松藥材OPLS-DA 圖Fig.5 OPLS-DA analysis of 16 batches of N. jatamansi

圖6 不同產(chǎn)地甘松200 次置換檢驗OPLS-DA 模型驗證Fig.6 Validation of OPLS-DA model for 200 times replacement test of N. jatamansi of different origin

圖7 不同產(chǎn)地甘松各成分VIP 圖Fig.7 VIP diagram of each component of N. jatamansi of different origins

3.4.4 指紋圖譜綜合評價 運用SPSS 25.0 軟件計算16 批次甘松樣品的主成分得分，以各主成分對應的貢獻率為權(quán)重系數(shù)計算綜合得分，并將其排序，見表6。由表可知，S4、S7、S10 3 個批次甘松綜合得分位居前3，因此，以60 個共有峰峰面積為綜合評價指標，可得S4、S7、S10 3 個批次甘松質(zhì)量較好，S6 和S15 排名最后。

表6 16 批次甘松的主成分因子得分和排序Table 6 Principal component factor scores and ranking of 16 batches of N. jatamansi

3.5 不同產(chǎn)地甘松的化學成分含量測定

由甘松HPLC 指紋圖譜共指認出5 個共有化學成分，含量測定結(jié)果見表7。由表可以看出不同產(chǎn)地批次甘松中5 個指標成分含量存在差異。不同產(chǎn)地甘松藥材平均含量為甘松新酮＞馬兜鈴酮＞綠原酸＞丁香酸＞蒙花苷。青海（除S6 的綠原酸質(zhì)量分數(shù)為1.447 6 mg/g 外）、四川、甘肅甘松的綠原酸質(zhì)量分數(shù)分別為均在2.302 9 mg/g 以上、1.046 5～1.670 3 mg/g、1.997 2 mg/g，呈現(xiàn)青海＞甘肅＞四川的趨勢；四川甘松中丁香酸的質(zhì)量分數(shù)均小于0.041 4 mg/g，整體小于甘肅、青海（除S6 的丁香酸質(zhì)量分數(shù)為0.028 4 mg/g 外）甘松中丁香酸的含量，可作為四川甘松與其他產(chǎn)地甘松區(qū)分的指標成分；蒙花苷含量在甘肅甘松中達到最低（0.016 7 mg/g），明顯低于其他產(chǎn)區(qū)甘松，可作為區(qū)分甘肅甘松與其他產(chǎn)區(qū)甘松的指標成分；甘松新酮在青海、四川、甘肅甘松中質(zhì)量分數(shù)依次降低，分別為14.570 2～37.869 1 mg/g、10.900 6～13.817 1 mg/g、7.442 1 mg/g；青海（除S6 的馬兜鈴酮質(zhì)量分數(shù)為1.246 1 mg/g 外）、四川、甘肅甘松的馬兜鈴酮質(zhì)量分數(shù)分別為均在2.506 8 mg/g 以上、1.850 2～2.223 2 mg/g、0.673 7 mg/g；青海（除S6 的5 種成分總質(zhì)量分數(shù)為17.310 5 mg/g 外）、四川、甘肅甘松的5 種成分總質(zhì)量分數(shù)分別為均在30.759 9 mg/g以上、14.137 8～17.369 8 mg/g、10.182 6 mg/g。甘松新酮、馬兜鈴酮及5 種成分總質(zhì)量分數(shù)均呈現(xiàn)青海＞四川＞甘肅的趨勢，表明綠原酸、甘松新酮、馬兜鈴酮及5 種成分總含量可作為3 產(chǎn)地甘松相互區(qū)分的指標成分。

表7 16 批次甘松中5 個化學成分的含量 (n＝3)Table 7 Contents of five chemical components in 16 batches of N. jatamansi (n＝3)

通過分析含量測定結(jié)果柱形圖（圖8），可以看到VIP＞1 的4 個差異性成分（綠原酸、丁香酸、甘松新酮、馬兜鈴酮）的含量在不同產(chǎn)地間存在顯著差異，且均為青海產(chǎn)甘松平均含量最高，且在平均含量水平上，綠原酸和丁香酸呈現(xiàn)青海＞甘肅＞四川的趨勢，甘松新酮和馬兜鈴酮呈現(xiàn)青海＞四川＞甘肅的趨勢，蒙花苷在不同產(chǎn)地批次樣本間也存在顯著差異，平均含量為四川＞青海＞甘肅，但其VIP＜1，故基于本研究結(jié)果，可將綠原酸、丁香酸、甘松新酮、馬兜鈴酮4 種指標成分作為評價甘松質(zhì)量差異潛在的標志成分。

圖8 5 個指標成分含量測定柱形圖Fig.8 Content determination bar graph of five index components

將綠原酸、丁香酸、甘松新酮、馬兜鈴酮4 種指標成分含量進行min-max 歸一化處理后，采用組間聯(lián)接、歐式距離法進行系統(tǒng)聚類，結(jié)果見圖9，可知不同樣本間，當歐氏距離為15 時，16 批甘肅樣本可分為2 類，其中S4、S5、S7～S14、S16 聚為第1 類，此類含萜類（甘松新酮、馬兜鈴酮）、苯丙素類（綠原酸）、酚類（丁香酸）成分含量均較高，其中綠原酸、丁香酸、甘松新酮、馬兜鈴酮含量最高的分別為S16、S12、S4 樣本。S1～S3、S6 及S15 聚為第2 類，此類含上述4 種成分含量均較少，其中綠原酸、丁香酸、甘松新酮、馬兜鈴酮含量最低的分別為S2、S6、S15 樣本，此聚類結(jié)果與60 個共有峰聚類結(jié)果完全相同。而在不同成分間，甘松新酮、馬兜鈴酮均屬于萜類成分，聚為一類，綠原酸、丁香酸分別屬于苯丙素類、酚類，各自聚為一類。依據(jù)4 種成分含量聚類結(jié)果，可將不同產(chǎn)地甘松進行有效區(qū)分，進一步驗證了這4 種指標成分作為甘松的潛在質(zhì)量標志物的合理性。

圖9 4 種指標成分聚類分析熱圖Fig.9 Heat map of cluster analysis of four index components

4 討論

本研究以甘松為研究對象，收集了16 批不同產(chǎn)地甘松樣品進行指紋圖譜和多成分含量測定研究，并通過相似度分析、HCA、PCA 以及OPLSDA 綜合評價甘松的質(zhì)量。通過考察提取方法（95%乙醇回流提取、95%乙醇超聲提?。?、提取時間（15、30、45 min）對提取結(jié)果的影響，最終確定以95%乙醇超聲提取30 min 作為供試品溶液提取方法?？疾觳煌ㄩL（254、275、326 nm）下指紋圖譜色譜峰數(shù)量、峰型和分離度，同時對各波長下綠原酸、丁香酸、蒙花苷、甘松新酮、馬兜鈴酮5 種成分進行含量檢測，分析發(fā)現(xiàn)275 nm 下各色譜峰的響應較高且分離度較好，因此選用275 nm 作為檢測波長。

本研究對16 批次不同產(chǎn)地甘松指紋圖譜進行研究，結(jié)合化學模式識別法分析，首次對甘松中丁香酸和馬兜鈴酮2 種化學成分于同一HPLC 色譜條件下進行指認并定量分析，對甘松的多成分控制藥材質(zhì)量進行了補充，使其質(zhì)量評價更為全面客觀。在指紋圖譜相似度分析中，16 批次樣品相似度均高于0.943，表明采集到的16 批甘松的化學成分組成較為相似，但各批次樣品之間化學成分含量存在一定差異，指紋圖譜相似度結(jié)果將青海甘松分別與四川、甘肅甘松進行區(qū)分，而甘肅甘松未能通過指紋圖譜相似度與四川甘松進行有效區(qū)分，可能是因為甘松中不同成分峰面積對應的含量變化對相似度結(jié)果有抵消作用[29]，進一步分析不同產(chǎn)地甘松平均相似度，呈現(xiàn)青海＞甘肅＞四川的趨勢。

含量測定結(jié)果顯示，16 批樣品中5 種成分含量差異較大，綠原酸的質(zhì)量分數(shù)為1.046 5～4.975 3 mg/g、丁香酸的質(zhì)量分數(shù)為0.028 4～0.108 7 mg/g、蒙花苷的質(zhì)量分數(shù)為0.016 7～0.157 4 mg/g、甘松新酮的質(zhì)量分數(shù)為7.442 1～37.869 1 mg/g、馬兜鈴酮的質(zhì)量分數(shù)為0.673 7～4.306 5 mg/g。5 種成分在不同產(chǎn)地間均呈現(xiàn)顯著性差異，且平均含量從高到低依次為甘松新酮＞馬兜鈴酮＞綠原酸＞丁香酸＞蒙花苷。

HCA、PCA、OPLS-DA 結(jié)果均顯示，四川阿壩州產(chǎn)甘松（S1～S3）聚為第1 類，青海河南縣、甘肅瑪曲縣產(chǎn)甘松（S6、S15）聚為第2 類，青海河南縣產(chǎn)甘松（S4、S5、S7～S14、S16）聚為第3 類。本研究S6 與S15 無法區(qū)分的原因可能是因為2 批樣品各共有峰代表的化學成分相對含量均較低，且較為接近，導致兩者無法區(qū)分；也可能是生長年限不同，由于本研究甘松樣本均為野生采挖，且甘松為多年草本植物，《中國藥典》2020 年版對其生長年限并未作出明確規(guī)定，文獻研究表明其生長年限的不同會對其次生代謝產(chǎn)物的積累產(chǎn)生影響[25,30]，生長年限等信息的不明確，亦會影響聚類分析的結(jié)果；另氣候環(huán)境、經(jīng)緯度、海拔等的影響，也會導致對樣本的區(qū)分能力較弱。

本研究結(jié)果表明，青海甘松中綠原酸、丁香酸、甘松新酮、馬兜鈴酮的平均質(zhì)量分數(shù)分別為3.123 5、0.077 9、29.038 2、2.887 5 mg/g，整體高于其他產(chǎn)區(qū)，特別是甘松新酮作為《中國藥典》2020年版甘松項下限定質(zhì)控指標成分，在四川甘松中質(zhì)量分數(shù)為10.900 6～13.817 1 mg/g，青海甘松中質(zhì)量分數(shù)為14.570 2～37.869 1 mg/g，甘肅甘松中質(zhì)量分數(shù)為7.442 1 mg/g，甘松新酮可將3 產(chǎn)地甘松完全區(qū)分；另OPLS-DA 這4 種成分均屬于VIP＞1 的差異成分，顯著性分析也顯示4 種成分的含量在不同產(chǎn)地間存在顯著差異，表明本研究確定綠原酸、丁香酸、甘松新酮、馬兜鈴酮作為甘松的質(zhì)量差異的特異性標志成分是合理的。

本研究采用HPLC 法對收集到的16 批次甘松藥材建立指紋圖譜，并對其中綠原酸、丁香酸、蒙花苷、甘松新酮和馬兜鈴酮的含量進行比較分析，運用PCA 和HCA，對其共有峰進行分析，構(gòu)建甘松藥材的主成分綜合評價模型，結(jié)合OPLS-DA 篩選不同批次甘松藥材的差異成分，為甘松藥材的質(zhì)量控制全面化、規(guī)范化、標準化提供參考依據(jù)。本研究建立的甘松指紋圖譜及5 種成分含量測定方法可為甘松原料藥材的質(zhì)量差異性評價提供科學方法，可為甘松藥材市場流通的等級劃分提供參考依據(jù)，以保障優(yōu)質(zhì)的甘松藥材能夠應用于中醫(yī)藥臨床。

本課題組前期已開展了基于“網(wǎng)絡藥理學-分子對接-藥效學驗證”的甘松“理氣止痛、開郁醒脾”功效質(zhì)量標志物研究，為確定綠原酸、丁香酸、甘松新酮、馬兜鈴酮等作為甘松質(zhì)量標志成分提供了有效支撐，相關研究結(jié)果另行發(fā)表。另由于甘松藥材資源多為野生，且生長環(huán)境多為藏區(qū)，分布區(qū)域有限，資源相對匱乏，樣本獲取難度較大，課題組近半年通過努力采集收集了甘肅、四川等地產(chǎn)甘松，但樣本持有量仍非常有限。但為了盡快推進甘松藥材研究，課題組對有限的樣本進行了多成分定量及指紋圖譜研究，以期為甘松藥材的資源整合、有效開發(fā)利用提供有益參考。另本課題組后續(xù)研究將考慮在HPLC 指紋圖譜研究的基礎上，通過GC-MS測定甘松揮發(fā)性成分、ICP-MS 測定無機元素等，結(jié)合甘松藥理藥效，實現(xiàn)基于甘松揮發(fā)性成分、無機元素指紋圖譜的譜效相關研究，為甘松產(chǎn)地區(qū)分及質(zhì)量標志物的確立提供更為全面的參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突