蔣路園 ，吳文麗，張愷愷，張林鳳，邵芬娟，陳段芬，邱德有，楊艷芳*

1. 中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所 林木遺傳育種全國重點實驗室，國家林業(yè)局林木培育重點實驗室，北京 100091

2. 河北農(nóng)業(yè)大學園藝學院，河北 保定 071001

紅豆杉屬Taxusspp.植物，俗稱紫杉，不僅具有較高的觀賞價值，更是抗癌藥物紫杉醇的重要原材料，具有極高的藥用價值。紅豆杉屬植物主要分布在北半球，全球有11 個種[1]。南方紅豆杉TaxuschinensisSmith var.mairei, Lemee et Lévl S.Y. Hu et Liu 又稱美麗紅豆杉，是中國紅豆杉T.chinensis(Pilg.) Rehd.的變種，在我國分布范圍最廣。自1985 年美國國立癌癥研究院發(fā)現(xiàn)紅豆杉屬植物含有多種抗腫瘤活性成分后，人類為謀取暴利隨意采伐，導致南方紅豆杉自然資源日益減少[2]。紅豆杉資源保護及可持續(xù)開發(fā)利用是影響紅豆杉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵問題。

簡單重復序列標記（simple sequence repeats，SSR），又稱短串聯(lián)重復序列或微衛(wèi)星標記，是一類由幾個核苷酸（1～6 個）為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的重復序列，長度較短，且廣泛分布于真核生物基因組中[3]。由于重復單位的核苷酸不同以及重復次數(shù)不完全相同，造成SSR 長度的高度變異性。SSR 遵循孟德爾遺傳方式，呈共顯性遺傳，具有數(shù)量豐富、高度多態(tài)性、可靠性好、檢測快速等特征，已成為群體遺傳學分析中的一個有用的標記系統(tǒng)，被廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜的構(gòu)建、種質(zhì)資源遺傳多樣性研究、遺傳關(guān)系與分化及群體結(jié)構(gòu)分析等領(lǐng)域。此外，近年來，有研究發(fā)現(xiàn)SSR 還可能對植物的逆境脅迫響應(yīng)有重要作用[4]。

目前，已有研究者在紅豆杉中開發(fā)出了多個具有多態(tài)性的SSR 分子標記[5-11]，并利用SSR 分子標記技術(shù)在紅豆杉中開展相關(guān)研究，如國外研究者利用SSR 分子標記技術(shù)研究了生境斷裂對歐洲紅豆杉T.baccataL.的遺傳結(jié)構(gòu)的影響[12]，國內(nèi)研究者也通過SSR 技術(shù)發(fā)現(xiàn)生境斷裂是導致云南紅豆杉T.yunnanensisCheng et L. K. Fu 顯著遺傳瓶頸、近親繁殖和種群分化主要原因[13]。開發(fā)南方紅豆杉SSR分子標記，了解南方紅豆杉的遺傳多樣性，對南方紅豆杉資源保護、育種和遺傳改良非常重要。

赤霉素（gibberellin A3，GA3）和紫杉醇同為二萜類化合物，在生物合成途徑中存在底物競爭關(guān)系。前人研究表明，GA3處理可以提高紅豆杉中紫杉醇產(chǎn)量[14]，紫杉醇合成關(guān)鍵酶基因的啟動子序列含有GA3應(yīng)答成分[15]。因此，基于GA3處理南方紅豆杉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)SSR 標記，有可能獲得紫杉醇合成相關(guān)的SSR 位點。

隨著科技發(fā)展，下一代測序技術(shù)（nextgeneration sequencing，NGS）的出現(xiàn)使得SSR 標記快速經(jīng)濟開發(fā)成為現(xiàn)實。目前，人們已經(jīng)基于組學數(shù)據(jù)對包含紅豆杉在內(nèi)的多種植物開發(fā)獲得了一些具有多態(tài)性的標記[5,8-10]，然而，目前可檢索到的南方紅豆杉SSR 標記數(shù)量僅有少量具有多態(tài)性，遠遠不能滿足南方紅豆杉遺傳多樣性等研究。本課題組前期利用RNA-seq 技術(shù)對GA3處理下的南方紅豆杉的葉片進行了轉(zhuǎn)錄組測序，本研究基于此轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對SSR 分子標記進行了鑒定和分析，并開發(fā)出了13 對具有多態(tài)性的SSR 標記，豐富南方紅豆杉SSR 標記數(shù)量，為紅豆杉品種鑒定、分子輔助標記育種和遺傳多樣性分析提供理論基礎(chǔ)。

1 材料、儀器及試劑

南方紅豆杉T.chinensisSmith var.mairei,Lemee et Lévl S. Y. Hu et Liu、東北紅豆杉T.cuspidataSiebold & Zucc.和曼地亞紅豆杉T. ×mediaRehder 材料經(jīng)中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所楊艷芳研究員鑒定后，分別種植于中國林業(yè)科學研究院科研溫室和廊坊種植基地，樣品信息見表1。

表1 樣本信息Table 1 Sample information

3730XL 型基因測序儀（Applied Biosystems）、veritiTM96 型PCR 儀（Thermo Fisher Scientific）、5430R 型離心機（Eppendrof）、NanoDrop 分光光度計（Gene Company Limited）等。本實驗所用主要試劑包括：CTAB（北京酷來搏科技有限公司）、TaqDNA 聚合酶（康為世紀生物科技股份有限公司）、瓊脂糖（南京森貝伽生物科技有限公司）、TAE buffer（北京酷來搏科技有限公司）、ddH2O（北京酷來搏科技有限公司）等。

2 方法

2.1 樣品的處理

5 年生南方紅豆杉種植于中國林業(yè)科學研究院科研溫室，利用200 μmol/L GA3分別在上午9:00 和下午15:00 噴施于紅豆杉葉片，處理2 d 后，于第3天上午9:00 收集葉片，液氮速凍后保存在-80 ℃冰箱，用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組測序。純水處理作為對照。樣品經(jīng)過RNA 提取、cDNA 文庫構(gòu)建質(zhì)檢合格后，采用Illumina 測序平臺進行轉(zhuǎn)錄組測序，過濾原始數(shù)據(jù)后，采用Trinity 軟件進行組裝。

2.2 紅豆杉基因組DNA 提取

溫室中的紅豆杉葉片采集后立刻置于液氮中，放置-80 ℃冰箱。廊坊基地紅豆杉葉片于采集時裝入含有硅膠的自封袋中進行干燥。樣品通過液氮研磨后用于基因組DNA 提取。提取方法采用mCTAB法（modified CTAB method）[16]，在1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測完整度，并根據(jù)Nanodrop 測定將DNA原液稀釋至50 ng/μL 保存于-20 ℃條件下用于后續(xù)實驗。

2.3 紅豆杉轉(zhuǎn)錄組SSR 位點的篩選及引物設(shè)計

使用MISA 軟件對南方紅豆杉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行SSR 分析，搜索SSR 位點。可搜索單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸，最小重復數(shù)分別設(shè)置為10、6、5、5、5、5 次。采用Primer 3（2.3.5 版，默認參數(shù)）進行SSR 引物設(shè)計。

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)的一批SSR 引物中，選擇重復單元堿基數(shù)2～3 bp，重復單元7～10 次的96對SSR 引物進行篩選實驗。所選擇的引物長度在20～25 bp，理論退火溫度52～56 ℃，PCR 產(chǎn)物長度處于150～350 bp。

2.4 SSR 引物的PCR 擴增

PCR 擴增為2 輪擴增。第1 輪（獲取相應(yīng)片段）PCR 擴增反應(yīng)體系：雙蒸水（ddH2O）5.9 μL，10×Taq Buffer 1 μL，2 mmol/L dNTP 1 μL，5 μmol/L 正向SSR 引物0.5 μL，5 μmol/L 反向SSR 引物0.5 μL，TaqDNA 聚合酶0.1 μL，50 ng/μL 的DNA 模板 1 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預變性4 min；20 個循環(huán)的3 步PCR（94 ℃變性0.5 min，退火時間0.5 min，退火溫度為52 ℃，72 ℃延伸1 min）；72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。第2 輪（添加熒光標記）PCR 擴增反應(yīng)體系：ddH2O 5.9 μL，10×Taq Buffer 1 μL，2 mmol/L dNTP 1 μL，5 μmol/L 帶熒光的M13 正向接頭引物0.5 μL，5 μmol/L 反向SSR 引物0.5 μL，TaqDNA 聚合酶0.1 μL，50 ng/μL的第1 輪模板1 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預變性4 min；30 個循環(huán)的3 步PCR（94 ℃變性0.5 min，退火時間0.5 min，退火溫度為50 ℃，72 ℃延伸1 min）；72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。

2.5 毛細管電泳檢測

將PCR 產(chǎn)物根據(jù)不同熒光標記進行混板，在生工生物工程（上海）股份有限公司通過3730XL 測序儀檢測對PCR 產(chǎn)物進行毛細管熒光電泳檢測。通過毛細管熒光電泳檢測，最終選定多態(tài)性好，擴增成功率高的SSR 引物用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

2.6 數(shù)據(jù)分析

將下機的原始數(shù)據(jù)“.fsa”文件導入到分析軟件GeneMarker 4.0 中進行峰圖判讀，具有多態(tài)峰圖的則表示該引物具有多態(tài)性，記錄等位基因大小，得到等位基因矩陣。根據(jù)判讀所得等位基因位點矩陣，通過GenALEx 來計算每個個體間的遺傳距離和每對引物的等位基因數(shù)（number of alleles，Na）、有效等位基因數(shù)（effective number of allele，Ne）、期望雜合度（expected heterozygosity，He）、觀測雜合度（observed heterozygosity，Ho）、Shannon’s 指數(shù)（Shannon’s information index，I）等遺傳多樣性數(shù)據(jù)。利用PIC-CALC 0.6 軟件計算SSR 位點的多態(tài)性信息數(shù)據(jù)（polymorphism information content，PIC）。基于GenALEx 計算所得的個體遺傳距離矩陣，通過MEGA 進行UPGMA 聚類分析，構(gòu)建聚類樹。

3 結(jié)果與分析

3.1 轉(zhuǎn)錄組SSR 位點數(shù)量與分布

利用Trinity 拼接從GA3處理下的南方紅豆杉轉(zhuǎn)錄組中共獲得202 361 條Unigene，通過鑒定，共獲得了12 008 個SSR 位點，出現(xiàn)頻率（SSR 數(shù)與總Unigene 數(shù)之比）為5.93%，這些SSR 分布在10 894 條Unigene 中，發(fā)生頻率（含SSR 的Unigene 數(shù)與總Unigene 數(shù)之比）為5.38%，SSR平均分布距離為1/7.64 kb。含有1 個以上SSR 位點的Unigene 有975 條，包含復合形SSR 的Unigene 有489 條。

南方紅豆杉SSR 類型豐富，單核苷酸至六核苷酸重復類型均存在。12 008 個SSR 位點包括6 213個單核苷酸（51.74%）、2 507 個二核苷酸（20.88%）、2 992 個三核苷酸（24.92%）、226 個四核苷酸（1.88%）、27 個五核苷酸（0.22%）、43 個六核苷酸（0.36%）。其中單核苷酸最豐富，其次是三核苷酸和二核苷酸類型，五核苷酸類型最少。所有SSR 中以10 次重復的SSR 最多，占24.48%，5 次重復占16.73%，6 次重復占15.30%。南方紅豆杉轉(zhuǎn)錄組SSR，基序的重復次數(shù)在5～72，以5～10 次重復的SSR 最多，共8 413 個，占總SSR 的70.06%；其次是10～14 次重復，共2 566 個，占總SSR 的21.37%；14 次以上的重復較少，共1 029 個，占總SSR 的8.57%（表2）。

表2 南方紅豆杉SSR 不同基序長度和重復次數(shù)的分布Table 2 Distribution of SSR with different motif types and repeat numbers in T. chinensis var. mairei

3.2 轉(zhuǎn)錄組SSR 基序重復類型和頻率特征

研究發(fā)現(xiàn)，在12 008 個SSR 位點中包含114種重復基元，其中單、二、三、四、五、六核苷酸重復分別有2、4、10、29、26、43 種。從出現(xiàn)頻率來看（表3），頻率較高的重復基元分別為A/T，占總位點數(shù)的49.60%。單核苷酸重復類型中，A/T出現(xiàn)頻率明顯高于C/G，分別占總位點數(shù)的49.60%和2.14%；二核苷酸重復類型中，AG/CT 最多，約占總位點數(shù)的10.93%，其次是AT/AT 和AC/GT，分別占總位點數(shù)的5.14%、4.65%，CG/CG 最少，約占總位點數(shù)的0.17%；三核苷酸重復類型中，AAG/CTT 最多，約占總位點數(shù)的5.49%，ACT/AGT最少，約占總位點數(shù)的0.44%；四核苷酸重復類型中，AAAG/CTTT 最多，約占總位點數(shù)的0.23%，AACG/CGTT 、 AACT/AGTT 、 ACCT/AGGT 、ATCG/ATCG 最少，占總位點數(shù)不足0.001%；五、六核苷酸約占總位點數(shù)0.58%。

表3 南方紅豆杉SSR 類型分布Table 3 Distribution of SSR repeat types in T. chinensis var. mairei

3.3 SSR 引物有效性驗證

選擇重復單元堿基數(shù)2～3 bp，重復單元7～10 次的96 對SSR 引物進行篩選實驗。結(jié)果顯示，以我國多個地區(qū)的南方紅豆杉DNA 為模板進行SSR-PCR，13 對（表4）引物具有多態(tài)性，多態(tài)性引物比率為13.54%。引物多態(tài)峰圖舉例見圖1。

圖1 HDS10 標記在太行山、湖南和福建地區(qū)紅豆杉樣本中的基因分型Fig.1 Genotyping by HDS10 maker for T. chinensis var. mairei from Taihang mountain, Hunan, and Fujian Provinces

表4 SSR 引物信息Table 4 Information of primers

13 個SSR 位點的多態(tài)性信息見表5。12 個樣本的Na為2～10，13 個SSR 位點上總的Na為55，平均值為4.23。Ne為1.53～5.43，平均值為2.76。I為0.53～1.85，平均值為1.10。Ho為0.14～0.82，平均值為0.39。He為0.35～0.82，平均值為0.58 個。PIC 為0.29～0.79，HDS5、HDS14、HDS52、HDS54和HDS93 為中多態(tài)性位點（0.25＜PIC＜0.5），HDS1、HDS10、HDS56、HDS76、HDS82、HDS84、HDS86 和HDS88 則為高多態(tài)性位點（PIC＞0.5）。其中，HDS 84 的多態(tài)性最高，其PIC 值為0.79。

表5 SSR 引物位點多樣性Table 5 SSR loci diversity of 13 SSR primers

3.4 SSR 位點種間擴增

將上述13 對具有多態(tài)性的SSR 引物在東北紅豆杉和曼地亞紅豆杉DNA 樣品中進行擴增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有13 對引物在東北紅豆杉DNA 樣品中有擴增，而在曼地亞紅豆杉DNA 樣品中僅有3 對引物有擴增（表6）。兩者相比較，13 對引物在東北紅豆杉DNA 樣品中的有效擴增率（100%），明顯高于在曼地亞紅豆杉DNA 樣品中的有效擴增率（23.08%）。

表6 種間擴增結(jié)果統(tǒng)計Table 6 Statistics of interspecific amplification results

3.5 聚類分析

UPGMA 聚類分析表明，來自浙江、福建和湖南緯度較低地區(qū)的南方紅豆杉聚類在一起，而來自太行山地區(qū)的4 份樣品聚為一類（圖2）?？梢钥闯?，浙江、福建和湖南地區(qū)的南方紅豆杉親緣關(guān)系更近，而太行山地區(qū)的南方紅豆杉與上述緯度更低南方來源的南方紅豆杉親緣關(guān)系較遠。此外，在3 種緯度較低的南方地區(qū)的南方紅豆杉中，也可以看出，浙江地區(qū)和湖南地區(qū)的距離相較福建地區(qū)更近。

圖2 12 份南方紅豆杉聚類分析Fig.2 Cluster analysis of 12 samples of T. chinensis var.mairei

4 討論

隨著科技的飛速發(fā)展，高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)以及更新迭代，使得利用基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定獲取SSR 標記更加方便，數(shù)量更加豐富，更加有助于進行植物種質(zhì)資源鑒定及遺傳多樣性評價等方面研究。目前，已經(jīng)有多種植物基于基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘鑒定出SSR 標記[7,17-19]。相較于基因組SSR，轉(zhuǎn)錄組EST-SSR 標記能更準確地鑒別植物基因型，在種間通用性更好，能準確評估種間親緣關(guān)系[20-23]。在南方紅豆杉中，也有研究人員通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)鑒定出了多個SSR 標記，并用于連鎖圖譜構(gòu)建等研究[4,7]。但是，已開發(fā)的SSR 標記還不能滿足連鎖圖譜構(gòu)建和遺傳分析的需要，紅豆杉SSR分子標記相關(guān)研究仍需要進一步加強。

本研究利用GA3處理的南方紅豆杉葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)搜索到二核苷酸至六核苷酸重復類型的SSR位點有6 213 個，高于李炎林等[10]利用公共數(shù)據(jù)庫中南方紅豆杉根、莖、葉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)搜索到的SSR位點數(shù)（2 160 個）。差異可能是與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源、MISA 軟件檢索設(shè)置參數(shù)等不同導致，也有可能與GA3處理有關(guān)。研究表明，二、三核苷酸重復類型為植物的SSR 位點的主要類型[24-26]。易官美等[9]研究報道在南方紅豆杉中主要以二核苷酸重復類型為主，而李炎林等[10]報道則是以三核苷酸重復類型為主。此外，在武星彤[5]的研究中，南方紅豆杉SSR重復基序是以六核苷酸重復為主，其次為三核苷酸。本研究南方紅豆杉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，三核苷酸重復基序比二核苷酸重復基序更豐富，與李炎林等[10]結(jié)果更為相似。分析原因，可能與南方紅豆杉的產(chǎn)地不同以及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和軟件設(shè)置參數(shù)等有關(guān)。從優(yōu)勢重復基序來看，單核苷酸至五核苷酸分別為A/T、AG/CT、AAG/CTT、AAAG/CTTT、ATCCG/ATCGG。二、三核苷酸的優(yōu)勢重復基序與前人結(jié)果較為一致[5,9-10]。

遺傳多樣性能夠體現(xiàn)生物遺傳信息變異的程度，群體遺傳多樣性主要由等位基因數(shù)、雜合度和多態(tài)信息含量等3 個方面體現(xiàn)[27]。本研究中13 對SSR 引物共有55 個位點具有多態(tài)，在12 個樣品中的Ho平均值低于He，與武星彤的結(jié)果相似，而PIC平均值為0.53，則高于武星彤[5]報道的7 個省份的南方紅豆杉PIC 數(shù)值0.453，表明本研究所檢測的4個南方紅豆杉群體的遺傳多樣性要高于武星彤所采用的南方紅豆杉群體。究其原因，推測是由于本研究中所檢測的太行山南方紅豆杉屬于目前發(fā)現(xiàn)的最北端的南方紅豆杉，其與福建、浙江、廣西等南方地區(qū)的生長的南方紅豆杉生長環(huán)境且表型特征都具有較大不同。此外，研究中所涉及的SSR 位點不同也有可能會造成結(jié)果的差異。盡管本研究和武星彤[5]研究中采用的群體以及樣品數(shù)量不多，但是兩者結(jié)果高度相似，也能充分表明當前人為因素對南方紅豆杉的遺傳多樣性產(chǎn)生不可忽略的影響。

種間擴增法被認為能有效開發(fā)近源物種新SSR位點。武星彤開發(fā)的107 個SSR 位點在5 種紅豆杉種間平均擴增率為96.07%[5]。本研究中獲得的13 對引物在東北紅豆杉DNA 樣品中擴增率達100%，但在曼地亞紅豆杉DNA 樣品中擴增率僅達23.08%。標記通用性的高低一定程度上反映物種基因組差異的大小和親緣關(guān)系的遠近[28-29]。本研究的結(jié)果說明相較于曼地亞紅豆杉，南方紅豆杉與東北紅豆杉親緣關(guān)系更近，基因組差異更小。分析原因可能有2個：一是因為曼地亞紅豆杉是歐洲紅豆杉T.baccata和東北紅豆杉的天然雜交種[30]，遺傳背景復雜；二是因為曼地亞紅豆杉不是我國本土樹種，是從外國引種而來，與南方紅豆杉的親緣關(guān)系、自然分布距離遠。因此，本研究開發(fā)的SSR 引物可用于紅豆杉種間親緣關(guān)系鑒定、系統(tǒng)發(fā)育等研究。

研究中所獲得13 對SSR 多態(tài)性引物，將12 個不同地區(qū)的南方紅豆杉進行了很好的聚類，聚類結(jié)果與其實際來源地較為一致。來自太行山的4 個樣品明顯聚為一類，與其他南方地區(qū)的紅豆杉可以得以顯著區(qū)分?？梢?，本研究所開發(fā)的SSR 引物能夠用于后續(xù)南方紅豆杉遺傳多樣性分析及遺傳結(jié)構(gòu)分析等研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明通過南方紅豆杉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)SSR 標記切實可行，鑒定篩選出的13對SSR 引物為南方紅豆杉的遺傳多樣性分析提供了候選標記。隨著紅豆杉基因組的發(fā)表[31-32]以及更多轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的公布，將會有更多的與功能基因相關(guān)的SSR 位點被開發(fā)，例如與紫杉醇生物合成相關(guān)的SSR 位點，希望今后研究人員可以基于此，在今后的研究中充分利用SSR 分子標記技術(shù)，并對紅豆杉的群體遺傳、遺傳圖譜構(gòu)建和譜系地理等諸多方面進行更加深入的研究，這些都將為未來的紅豆杉分子育種提供幫助。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突