羅 瑤，凈易堯，胡本祥, ，楊冰月，姬海月，顏永剛，張 崗，趙 璠，彭 亮*

1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院/陜西省秦嶺中草藥應(yīng)用開發(fā)工程技術(shù)研究中心/“秦藥”研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽 712046

2. 陜西國際商貿(mào)學(xué)院，陜西 咸陽 712046

3. 榆林市第五醫(yī)院，陜西 榆林 719000

遠(yuǎn)志是遠(yuǎn)志科多年生草本植物遠(yuǎn)志Polygala tenuifoliaWilld.或卵葉遠(yuǎn)志P.sibiricaL.的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味苦、辛，性溫，具有安神益智、交通心腎、祛痰、消腫的功效[1]。遠(yuǎn)志為我國85 種傳統(tǒng)出口大宗藥材及42 種重點(diǎn)保護(hù)的三級野生品種之一，是臨床益智藥處方中名列前3 位的單味中草藥，被視為養(yǎng)命之要藥[2]。遠(yuǎn)志廣泛分布于中國西北、華北和東北地區(qū)，以陜西、山西量大質(zhì)優(yōu)，是一種適應(yīng)性極強(qiáng)的中旱生植物耐干旱而怕水澇[3]。遠(yuǎn)志中的主要活性成分為齊墩果烷型三萜皂苷，具有增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶、鎮(zhèn)靜、抗抑郁等藥理作用[4]。在高等植物中，齊墩果烷型三萜類化合物的生物合成歷經(jīng)前體供應(yīng)、骨架合成、萜類合成3 個(gè)階段。第3 階段由β-香樹脂醇合成酶（β-amyrin synthas，β-AS）催化2,3-氧化鯊烯（2,3-oxidosqualene，OS）形成β-香樹脂醇，然后β-香樹脂醇在CYP450 作用下使C-28 氧化生成齊墩果酸，最終由CYP450 和UGTs 催化產(chǎn)生官能化反應(yīng)形成復(fù)雜多樣的三萜類成分[5-6]。細(xì)胞色素 P450（cytochrome P450，CYP450）是植物體內(nèi)最大的酶家族[7]，具有半胱氨酸-亞鐵血紅素結(jié)構(gòu)[8]，因其可以催化氧分子進(jìn)行還原性分離從而具有廣泛的催化活性，主要參與萜類、生物堿、脂類、植物激素等的生物合成[9]，CYP450 催化的結(jié)構(gòu)修飾是實(shí)現(xiàn)三萜皂苷多樣化和功能化的關(guān)鍵，系三萜類成分生物合成途徑的關(guān)鍵酶[10]。P450 基因在植物的生長及發(fā)育過程具有關(guān)鍵作用，可提高植物對各種生物及非生物脅迫的抗性[11]，楊杰等[12]研究表明白樺細(xì)胞色素P450 具有組織特異性以及激素誘導(dǎo)表達(dá)特性，可能在白樺生長發(fā)育、抵御脅迫及代謝物合成中發(fā)揮重要作用。植物激素在植物生長發(fā)育及抵御、適應(yīng)逆境環(huán)境中發(fā)揮重要作用。

本實(shí)驗(yàn)通過PCR 克隆得到了遠(yuǎn)志CYP72A546基因，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)、激素和非生物脅迫響應(yīng)分析，有助于深入探討CYP450 基因在遠(yuǎn)志植株防御反應(yīng)中的重要作用，為科學(xué)闡明遠(yuǎn)志皂苷類成分生物合成途徑及調(diào)控機(jī)制提供證據(jù)及通過遺傳工程改良藥材品質(zhì)奠定了基礎(chǔ)，可為進(jìn)一步探索遠(yuǎn)志CYP450基因功能提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

樣品于2021 年10 月陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園（陜西咸陽）采集，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)胡本祥教授鑒定為3 年生遠(yuǎn)志P.tenuifoliaWilld.及其成熟種子。

1.2 酶和主要試劑

脫落酸（abscisic acid，ABA）、殼聚糖（chitosan，CHT）（購自上海源葉生物科技有限公司）；Trizol 總RNA 提取試劑盒、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、ddH2O 均購自生工生物工程（上海）股份有限公司，Rapid Taq Master Mix（2×）、HiPure Plasmid Micro Kit C 質(zhì)粒小提試劑盒均購自諾唯贊生物科技股份有限公司（南京），PrimeScriptTMII 1st strand cDNA Synthesis Kit、TB Green?Premix Ex Taq?、T-Vector pMD?19、UEDNA 凝膠回收試盒均購自TaKaRa 公司；本實(shí)驗(yàn)所用引物由武漢金開瑞生物公司合成；序列測定由楊凌奧科生物科技有限公司完成。

1.3 儀器

ZQPW-70 型全溫振蕩培養(yǎng)箱（天津市萊玻特瑞公司），HFsafe-1200LC 型超凈工作臺（上海力申公司），Centrifuge5424 型高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司），T100TMThermal Cycler PCR 儀（美國Bio-Rad 公司），DYY-6D 型電泳儀（北京六一公司），StepOnePlus? Real-Time PCR 儀（美國Applied Biosystems 公司），SYNGENE GBOX 凝膠成像系統(tǒng)（基因有限公司），NanoDropTM 2000 型分光光度計(jì)（美國Thermo-Fisher 公司），K5800 型自動(dòng)檢測超微量分光光度計(jì)（凱奧公司），HH-B11·360-BS 型電熱恒溫培養(yǎng)箱、GR60DA 型高溫滅菌鍋（美國Zealway公司），分析天平（上海舜宇恒平公司），-80 ℃超低溫冰箱（中科美菱公司）。

2 方法

2.1 樣品處理

取生長一致的3 年生遠(yuǎn)志3 株，將根、莖、葉等量混合進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組測序分析。在相同條件下，采集遠(yuǎn)志不同組織（根、莖、葉）用于進(jìn)一步分析。綜合課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)合相關(guān)研究，分為激素處理組：殼聚糖（CHT，200 μmol/L）、脫落酸（ABA，200 μmol/L）；非生物脅迫處理組：干旱（PEG 6000，10%）、鹽（NaCl，100 mmol/L）；噴施無菌水作為對照組（Mock），所有樣品均于處理后0、6、12、24 和48 h 進(jìn)行取樣，以0 h 為空白對照，每個(gè)處理組的每個(gè)處理時(shí)間點(diǎn)做3 個(gè)樣本重復(fù)，經(jīng)液氮速凍后儲存于-80 ℃冰箱。

2.2 RNA 提取及cDNA 合成

取3 株遠(yuǎn)志植株充分混合后，液氮速凍并充分粉碎后使用Trizol 試劑盒提取總RNA，提取方法參照其說明書進(jìn)行，并用使用Prime ScriptTMII 1st strand cDNA Synthesis Kit 合成cDNA 后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 基因克隆

以cDNA 作為模板，以CYP72A546-F/R（表1）作為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。25 μL 標(biāo)準(zhǔn)體系：Rapid Taq Master Mix（2×）12.5 μL、Forward Primer 1 μL、Reverse Primer 1 μL 和DNA 模板 1 μL，ddH2O 9.5 μL 補(bǔ)齊。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃、3 min；95 ℃、15 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，30 個(gè)循環(huán)數(shù)；72 ℃、5 min，12 ℃保溫。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，DNA 膠回收試劑盒純化回收目的片段后，與pMD19T 連接并轉(zhuǎn)化DH5α，挑取陽性克隆送楊凌奧科完成測序。

表1 PtCYP72A546 基因克隆及表達(dá)分析引物序列Table 1 Primer sequences for gene cloning and expression analyses of PtCYP72A546

2.4 生物信息學(xué)分析

利用軟件及在線工具（表2）對遠(yuǎn)志CYP72A546進(jìn)行生物信息分析預(yù)測。

表2 PtCYP72A546 基因生物信息軟件及網(wǎng)站Table 2 Bioinformatics software and websites for analyses of PtCYP72A546

2.5 基因表達(dá)模式

利用qPCR 檢測CYP72A546在遠(yuǎn)志不同樣品中的相對表達(dá)量，以GAPDH為內(nèi)參基因[13]，引物序列見表1。反應(yīng)體系20 μL：TB Green?Premix Ex TaqTMII（TliRNaseHPlus）（2×）10 μL、Forward/Reverse Primer 各0.8 μL、DNA 模板2 μL、ROX Reference Dye（50×）0.4 μL、ddH2O 6 μL。反應(yīng)程序：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，60 ℃、34 s，40 個(gè)循環(huán)；之后繪制熔解曲線，條件為95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s，3 次重復(fù)?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量采用2-△△Ct計(jì)算[14]，SPSS 27.0 統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05 代表有顯著性差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 基因克隆

基于課題組前期的遠(yuǎn)志全長轉(zhuǎn)錄組測序及注釋結(jié)果，獲得一個(gè)PtCYP450基因，經(jīng)PCR 擴(kuò)增、測序分析和NCBI 比對，獲得了全長1 560 bp 的遠(yuǎn)志基因CYP72A546，編碼519 個(gè)氨基酸，含有CYP450 的保守結(jié)構(gòu)域，證實(shí)其為CYP450家族基因（圖1～3）。

圖1 PtCYP72A546 基因PCR 結(jié)果Fig.1 PCR results of PtCYP72A546

圖2 PtCYP72A546 基因cDNA 序列全長及其編碼的氨基酸序列Fig.2 Complete cDNA and deduced amino acid sequences of PtCYP72A546

圖3 PtCYP72A546 蛋白的結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Domain analysis of PtCYP72A546 protein

3.2 生物信息學(xué)分析

3.2.1 理化性質(zhì)預(yù)測 從蛋白的相對分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、親疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點(diǎn)等方面對PtCYP72A546 編碼蛋白進(jìn)行多方位預(yù)測分析。結(jié)果表明，PtCYP72A546 蛋白相對分子質(zhì)量為59 770，分子式為C2740H4287N713O748S18，原子總數(shù)為8 506，理論等電點(diǎn)為5.02，屬酸性蛋白。親疏水性預(yù)測顯示，PtCYP72A546 蛋白的親水系數(shù)為0.774，不穩(wěn)定系數(shù)為39.13，系穩(wěn)定性疏水性蛋白（圖4）。明確目標(biāo)蛋白磷酸化位點(diǎn)及水平可為該蛋白特性研究提供重要參考[15]，PtCYP72A546 蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測表明其存在多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的位點(diǎn)個(gè)數(shù)分別為32、28 和14（圖5）。

圖4 PtCYP72A546 氨基酸疏水性預(yù)測Fig.4 Hydrophobicity prediction analysis of amino acid sequence of PtCYP72A546

圖5 PtCYP72A546 磷酸化位點(diǎn)預(yù)測Fig.5 Prediction of phosphorylation sites of PtCYP72A546

3.2.2 PtCYP72A546 蛋白跨膜區(qū)及信號肽分析蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長調(diào)節(jié)等方面具有重要作用，信號肽則是引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)分泌通路轉(zhuǎn)移的短肽鏈，序列長度多數(shù)含有 5～30 個(gè)氨基酸[13,16]，結(jié)果表明，PtCYP72A546 蛋白僅有1 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域且不存在信號肽（圖6、7）。

圖6 PtCYP72A546 編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析Fig.6 Prediction analysis of the transmembrane domain of protein encoded by gene PtCYP72A546

圖7 PtCYP72A546 蛋白信號肽預(yù)測結(jié)果Fig.7 Prediction of a signal peptide for PtCYP72A546 protein

3.2.3 CYP72A546 蛋白二級結(jié)構(gòu)及分析 蛋白二級結(jié)構(gòu)為多肽主鏈骨架原子沿一定的軸盤旋或折疊而形成的特定構(gòu)象，有α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲等幾種主要形式，二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測可為研究蛋白質(zhì)功能與結(jié)構(gòu)關(guān)系提供參考依據(jù)[17]。PtCYP72A546 蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果見圖8，結(jié)合表3 分析可知，PtCYP72A546 蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)、延伸主鏈結(jié)構(gòu)、無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)和β-轉(zhuǎn)角氨基酸數(shù)目分別為271、59、155、34 個(gè)，占比依次為52.20%、11.37%、29.87%和6.55%。

圖8 PtCYP72A546 蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.8 Secondary structure prediction of PtCYP72A546 protein

3.2.4 CYP72A546 蛋白三級結(jié)構(gòu)及分析 使用SWISS-MODEL 在線軟件預(yù)測分析PtCYP72A546蛋白三維結(jié)構(gòu)，用Cytochrome P4504B1（SMTL ID：6c94.1）為模板，蛋白覆蓋率為100%，預(yù)測結(jié)果見圖9。

圖9 PtCYP72A546 蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.9 Prediction of tertiary structure of PtCYP72A546 protein

3.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

從NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載擬南芥（模式植物）及與遠(yuǎn)志CYP72A546 氨基酸序列具有一定同源性的細(xì)胞色素P450 家族的氨基酸序列[甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、大豆Glycinemax(L.) Merr.、百脈根Lotuscorniculatus Linn.、豆科植物Gastrolobium bilobum、苜蓿MedicagosativaL.、擬南芥Arabidopsis thaliana(L.) Heynh.、喜樹CamptothecaacuminataDecne.、芝麻SesamumindicumL.、煙草Nicotiana tabacumL.]共11 條。利用MEGA11 中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，見圖10。本研究中所有CYP72A 亞家族基因編碼的蛋白聚為一大支，遠(yuǎn)志和大豆、甘草、苜蓿、百脈根聚為一個(gè)分支，同源性較高。

3.4 PtCYP72A546 蛋白亞細(xì)胞定位分析

為研究PtCYP72A546 蛋白在細(xì)胞中的作用位置，構(gòu)建pBWA(V)HS-PtCYP72A546-GLOSGFP 質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草葉片觀察其亞細(xì)胞定位情況。通過激光共聚焦顯微鏡下觀察葉片表皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，PtCYP72A546-GFP 融合蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上具有明顯信號（圖11）。

圖11 PtCYP72A546 蛋白在煙草葉片下表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位Fig.11 Subcellular localization of PtCYP72A546 protein in lower epidermal cells of tobacco leaves

3.5 PtCYP72A546 的表達(dá)模式

以遠(yuǎn)志葉為參考樣本，qPCR 檢測CYP72A546基因在遠(yuǎn)志根、莖和葉中的表達(dá)情況（圖12）。結(jié)果顯示，CYP72A546 在根中的表達(dá)顯著高于其他組織，分別為莖、葉的6.61、3.52 倍，說明PtCYP72A546主要在根中發(fā)揮生物學(xué)功能。

圖12 PtCYP72A546 在不同組織部位表達(dá)分析Fig.12 Expression analysis of PtCYP72A546 in different tissues

PtCYP72A546 響應(yīng)外源激素（CHT、ABA）處理不同時(shí)間點(diǎn)（6、12、24、48 h）的表達(dá)情況見圖13-A，以0 h（CK）為空白對照：Mock 在處理6 h內(nèi)迅速上調(diào)并達(dá)到峰值（為CK 的2.60 倍），后開始下調(diào)，處理48 h 后為CK 的0.18 倍；CHT 處理組與Mock 變化趨勢一致，處理6 h 上調(diào)至峰值（為CK 的5.49 倍），為同時(shí)間點(diǎn)Mock 和ABA 的2.11 和1.12倍。ABA 處理下PtCYP72A546 的相對表達(dá)量隨時(shí)間推移呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，在12 h 達(dá)到最高（為CK 的7.45 倍），為同時(shí)間點(diǎn)下Mock 和CHT 的4.86 和1.50 倍。PtCYP72A546 響應(yīng)脅迫處理不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)見圖13-B。CYP721A546 在PEG6000 處理下，相對表達(dá)量于12 h 達(dá)峰值（為CK 的4.98 倍），為同時(shí)間點(diǎn)Mock 和NaCl 的3.25 和1.30 倍；NaCl 處理24 h 顯著誘導(dǎo)（為CK 的5.14 倍），為同時(shí)間點(diǎn)Mock 和PEG 的19.61 和2.87 倍。

圖13 PtCYP72A546 響應(yīng)激素 (A) 和非生物脅迫處理 (B) 的表達(dá)模式Fig.13 Expression pattern of PtCYP72A546 in response to hormones (A) and abiotic stress treatments (B)

4 討論

細(xì)胞色素P450 家族基因參與多種內(nèi)源、外源物質(zhì)的代謝途徑，廣泛存在于生物體內(nèi)，目前已在植物中發(fā)現(xiàn)127 個(gè)CYP450 家族，在系統(tǒng)發(fā)生樹上被分為11 個(gè)具有明顯進(jìn)化枝的簇[18]。相關(guān)研究表明，細(xì)胞色素P450 基因除了參與萜類及甾醇類化合物的合成，還可以催化生物體的生長發(fā)育[16]。近年來，關(guān)于P450 家族基因的篩選和挖掘，尤其是在藥用植物三萜皂苷生物合成途徑中的功能解析引發(fā)強(qiáng)烈關(guān)注[19]。

本實(shí)驗(yàn)利用 PCR 技術(shù)克隆得到遠(yuǎn)志CYP72A546 基因的全cDNA 序列，并對其進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，PtCYP72A546 基因具有完整的ORF，并具有P450 家族的保守結(jié)構(gòu)域，確定其為P450 家族基因；PtCYP72A546 蛋白具有1 個(gè)跨膜區(qū)但不存在信號肽，系疏水性穩(wěn)定蛋白；亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示該蛋白主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。進(jìn)化樹分析主要用于研究基因家族成員分類和進(jìn)化關(guān)，有助于推測親緣關(guān)系密切相關(guān)的蛋白家族成員的生物學(xué)功能[20]，PtCYP72A546 與其他9 種植物CYP72 亞家族的分子進(jìn)化關(guān)系分析表明，PtCYP72A546 編碼的蛋白屬于CYP72A 亞家族，主要與豆科植物 GuCYP72A153、LjCYP72A68、GmCYP72A68、GbCYP72A68、MtCYP72A68 聚為一支，推測可能具有相似的生物學(xué)功能。研究表明，遠(yuǎn)志[21]、苜蓿[22]和大豆[23]等都含有齊墩果烷型三萜皂苷成分，且根據(jù)Biazzi 等[24]的報(bào)道，齊墩果烷型三萜皂苷物質(zhì)的合成通常由CYP72 和/或CYP85 家族簇參與，如苜蓿 CYP72A61、CYP72A63、CYP72A67、CYP72A6 和甘草CYP72A154 都參與齊墩果烷三萜骨架的催化合成[25]，推測遠(yuǎn)志CYP72A546基因可能具有參與齊墩果烷型三萜皂苷生物合成相關(guān)的生物學(xué)功能。

P450基因參與調(diào)控植物體內(nèi)的多種新陳代謝反應(yīng)，在維持植物的正常生長發(fā)育及脅迫響應(yīng)調(diào)控生理機(jī)制中具有主導(dǎo)作用。P450基因的表達(dá)調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平，并具有組織器官的特異性，葉片直接暴露于大氣中，主要受環(huán)境變化影，而根主要受土壤微生態(tài)的影響較為顯著，這勢必導(dǎo)致P450基因在表達(dá)水平做出一定響應(yīng)，從而可能在植物適應(yīng)環(huán)境和介導(dǎo)次生代謝產(chǎn)物合成等方面發(fā)揮重要作用[26]。PtCYP72A546 主要在根中高表達(dá)，推測其可能通過調(diào)控遠(yuǎn)志藥用部位根的生長發(fā)育及次生代謝進(jìn)而影響遠(yuǎn)志藥材品質(zhì)。內(nèi)源激素在調(diào)節(jié)植物體生理生化反應(yīng)中起重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，而植物CYP450基因表達(dá)也與激素密切相關(guān)。PtCYP72A546 響應(yīng)ABA及CHT 誘導(dǎo)，受激素誘導(dǎo)后表達(dá)量有明顯升高，旱、鹽脅迫均提高了PtCYP72A546 表達(dá)水平，表明它們可能通過參與多種生物學(xué)過程的調(diào)節(jié)影響遠(yuǎn)志的生理和代謝。

本實(shí)驗(yàn)通過基因克隆和生物信息學(xué)研究，初步判斷CYP72A546基因可能與合成遠(yuǎn)志齊墩果烷型三萜皂苷下游反應(yīng)有關(guān)，但其具體調(diào)控途徑和作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本究發(fā)現(xiàn)有助于進(jìn)一步對參與遠(yuǎn)志齊墩果烷型三萜皂苷合成的CYP450基因進(jìn)行功能鑒定，也為遠(yuǎn)志三萜皂苷類成分合成調(diào)控及遺傳改良提供科學(xué)支撐。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突