鄭垚

隨著醫(yī)學(xué)的不斷進(jìn)展，抗生素的應(yīng)用越發(fā)廣泛，免疫抑制劑、激素和抗腫瘤藥物的多方面應(yīng)用導(dǎo)致肺真菌性病變呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)[1]，而該類疾病癥狀不典型，臨床表現(xiàn)及影像學(xué)改變?nèi)狈μ禺愋?，常被肺部基礎(chǔ)疾病所掩蓋，極易造成誤診或漏診，已成為臨床診斷及治療的一大難題。通過病理檢查與常規(guī)HE 染色+特殊染色+免疫熒光染色方法的聯(lián)合應(yīng)用，可以明確真菌的種、屬，對(duì)臨床肺真菌感染的診斷與鑒別診斷具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 病例1 男性，25 歲，急性髓系白血病化療及骨髓移植期間，反復(fù)肺部細(xì)菌、真菌感染，CT 示右肺上葉斑片狀磨玻璃影增大。

1.1.2 病例2 男性，27 歲，急性髓系白血病5 年，造血干細(xì)胞移植術(shù)后1 年5 個(gè)月，可疑肺部感染2 個(gè)月，治療效果不佳，CT 示左肺下葉背段空洞性病變，考慮感染性病變。

1.1.3 病例3 男性，12 歲，慢性肉芽腫骨髓移植術(shù)后可疑肺真菌感染7 個(gè)月，CT 示左肺上葉下舌段實(shí)變影，可見空洞，洞壁光滑，內(nèi)見球形高密度灶，考慮感染性病變。

1.1.4 病例4 女性，20 歲，因慢性粒細(xì)胞性白血病行造血干細(xì)胞移植術(shù)后2 年，CT 示左肺上葉實(shí)變并空洞形成，雙肺多發(fā)斑片影。

1.1.5 病例5 男性，49 歲，骨髓增生異常綜合征2年，骨髓移植術(shù)后1 年，肺部感染9 個(gè)月，咯血2 個(gè)月。CT 示左肺上葉丘狀密度增高影，與肺組織邊緣呈鈍角，左側(cè)第2、3 肋骨骨折。

1.1.6 病例6 男性，21 歲，結(jié)核性胸膜炎、大葉性肺炎2 年，無誘因咳嗽、咳痰、發(fā)熱伴胸痛10 天入院。胸部增強(qiáng)CT 示右中下肺可見大片狀類圓形密度增高影；胸腔可見低密度的分隔，并可見鈣化影。

1.1.7 病例7 男性，71 歲，新型冠狀病毒感染1 月余，胸悶、氣短加劇，CT 示右肺多發(fā)片狀實(shí)變影及結(jié)節(jié)。

1.2 方法收集肺葉切除標(biāo)本及經(jīng)皮肺組織穿刺標(biāo)本，格林環(huán)保固定液固定，常規(guī)取材，包埋制片，3mm 連續(xù)切片，常規(guī)HE 染色（染液為格林環(huán)保試劑），光學(xué)顯微鏡下觀察，加做特殊染色及免疫熒光染色，特殊染色試劑為貝索生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，免疫熒光試劑為諾鬲生物科技有限公司諾立清免疫顯色試劑。

2 結(jié)果

2.1 臨床特點(diǎn)7 例患者中，男性多于女性，比例6:1，年齡12～71 歲，平均32.1 歲。除2 例為明確肺炎感染治療后患者，其余5 例均為血液系統(tǒng)疾病治療后患者，其中3 例為骨髓移植術(shù)后、2 例為造血干細(xì)胞移植術(shù)后。這5 例患者反復(fù)肺內(nèi)感染，抗感染治療效果不佳。CT 示肺內(nèi)多發(fā)實(shí)變、斑片影或密度增大影，3 例可見空洞性病變，均提示感染性病變可能。

2.2 肉眼所見6 例肺葉切除標(biāo)本中，大部分肺組織內(nèi)可見多個(gè)大小不等的灰白結(jié)節(jié)，直徑0.4～3.0cm。病例2、3、4、5 肺內(nèi)可見明顯空腔樣結(jié)構(gòu)，腔內(nèi)可見灰黃、灰褐色黏稠狀物。病例5 送檢肺組織與肋骨間組織，見空腔樣結(jié)構(gòu)。病例6 肺內(nèi)見一巨大結(jié)節(jié)狀腫物，大小為14.5cm×11.5cm×11.5cm，結(jié)節(jié)中心有不規(guī)則壞死，多彩狀。病例7 為CT 引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺組織3 條。

2.3 顯微鏡下觀察

2.3.1 病例1、2、3 為曲霉菌感染。肺炎癥性病變，伴慢性支氣管炎、支氣管擴(kuò)張及機(jī)化性肺炎，局灶細(xì)支氣管周圍淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，周邊肺泡腔內(nèi)見大量組織細(xì)胞聚集。送檢肺實(shí)質(zhì)內(nèi)見多個(gè)大小不等的真菌團(tuán)，部分真菌團(tuán)內(nèi)菌體呈放射狀排列、纖維包裹形成（見圖1a）。病例2、3 病灶中央為凝固性壞死、空洞形成，伴周邊菌群圍繞，菌群外圍為中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞構(gòu)成的肉芽腫性炎（見圖1b）。病例2、3 部分區(qū)域可見散在的巨噬細(xì)胞和異物巨細(xì)胞性肉芽腫性炎，巨噬細(xì)胞內(nèi)可見吞噬的菌絲（見圖1c）。真菌結(jié)構(gòu)為透明、有隔菌絲，約45°分枝，鹿角樣（見圖1a～c）。

圖1 曲霉菌感染病變HE 染色鏡下所見

2.3.2 病例4、5、6 為毛霉菌感染。肺炎癥性病變，多個(gè)化膿性肉芽腫及膿腫灶形成，病變中見凝固性壞死，壞死組織內(nèi)可見真菌菌團(tuán)，真菌結(jié)構(gòu)為透明、無隔或少隔菌絲，菌絲寬大，≥90°分枝，局部可見菌團(tuán)侵犯血管，菌栓形成，病例4、5 可見空洞形成（見圖2a）。局部可見細(xì)支氣管周圍炎（見圖2b）。炎癥細(xì)胞在病變周邊以淋巴單核細(xì)胞為主要成分，中心中性粒細(xì)胞較多，摻雜多少不等嗜酸性粒細(xì)胞，部分區(qū)域嗜酸性粒細(xì)胞較明顯，并形成嗜酸性小膿腫。部分區(qū)域可見散在的吞噬細(xì)胞和包涵異物的巨細(xì)胞（見圖2c）。

圖2 毛霉菌感染病變HE 染色鏡下所見

2.3.3 病例7 為隱球菌感染。該病例為CT 引導(dǎo)下肺組織穿刺活檢，顯微鏡下HE 染色切片可見纖維結(jié)締組織及肉芽組織中大量組織樣細(xì)胞及上皮樣細(xì)胞聚集，其間散在大量透明且大小不等的圓形、空泡狀結(jié)構(gòu)，大小接近組織細(xì)胞核，中央空亮，邊緣肥厚，并見凝固性壞死及小膿腫灶形成（見圖3）。

圖3 隱球菌感染病變HE 染色鏡下所見（×40）

2.4 特殊染色及免疫熒光結(jié)果

2.4.1 病例1、2、3 中特殊染色 抗酸染色（-），PAS染色（菌絲及孢子呈淺紫紅色）（見圖4a），六胺銀染色（菌絲及孢子呈黑色）（見圖4b）；免疫熒光真菌染色：鏡下可見透明、有隔菌絲，約45°分枝，鹿角樣，提示曲霉菌陽性（見圖4c）。

圖4 曲霉菌感染病變特殊染色鏡下所見

2.4.2 病例4、5、6 特殊染色 抗酸染色（-），PAS 染色（菌絲及孢子呈淺紫紅色）（見圖5a），六胺銀染色（菌絲及孢子呈黑色）（見圖5b）；免疫熒光真菌染色：鏡下可見透明、無隔或少隔菌絲，菌絲寬大，≥90°分枝，提示毛霉菌陽性（見圖5c）。

圖5 毛霉菌感染病變特殊染色鏡下所見

2.4.3 病例7 特殊染色 抗酸染色（-），PAS 染色（菌體空亮，莢膜輕微著淡紫色）（見圖6a），六胺銀染色（菌體空亮，莢膜黑色）（見圖6b），AB-PAS（-）；免疫熒光真菌染色：菌體中央亮白，折光性強(qiáng)，周邊藍(lán)白色莢膜包裹，輪廓清晰，提示隱球菌陽性（見圖6c）。

圖6 隱球菌感染病變特殊染色鏡下所見

3 討論

3.1 概述肺部真菌感染性疾病是由不同真菌感染肺深部引起的一類疾病，分為兩種，其中繼發(fā)性肺真菌病是免疫功能低下導(dǎo)致的疾病。常見于長(zhǎng)期使用激素類藥物、廣譜抗生素、免疫抑制劑的患者；接受過器官移植、骨髓移植的患者；因放療、化療、特殊感染引起免疫功能下降的人群[2]。肺部真菌性病變常見的菌種主要是曲霉菌、念珠菌、毛霉菌、隱球菌和肺孢子菌。該類疾病發(fā)生率有逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)。

3.2 臨床及影像特點(diǎn)7 例中男性多于女性，年齡偏低，2 例為急性髓系白血病，1 例慢性肉芽腫，1 例慢性粒細(xì)胞性白血病，1 例骨髓增生異常綜合征，均進(jìn)行過骨髓或造血干細(xì)胞移植手術(shù)，1 例為結(jié)核性胸膜炎、大葉性肺炎愈后，1 例為新冠感染轉(zhuǎn)陰后，均是因特定疾病導(dǎo)致的免疫功能低下人群，白血病患者因反復(fù)肺內(nèi)感染導(dǎo)致發(fā)熱、咳嗽、咳痰、咳血等癥狀，反復(fù)抗炎治療后效果越來越差。新型冠狀病毒感染患者因出現(xiàn)胸悶、氣短加劇的癥狀來院就診，但病毒核酸檢測(cè)陰性，考慮肺內(nèi)病變與新型冠狀病毒無明確關(guān)聯(lián)。CT 示肺內(nèi)多發(fā)實(shí)變影或密度增高影，3 例可見空洞性病變，均提示感染性病變可能。以上病例臨床及影像學(xué)沒有明顯特異性，臨床根據(jù)影像及相關(guān)檢查均考慮感染性病變，可能為細(xì)菌性、結(jié)核、真菌感染，因此為進(jìn)一步確診和治療，做肺葉切除和肺穿刺送病理進(jìn)一步檢查。

3.3 病理診斷

3.3.1 HE 染色特點(diǎn) 7 例患者均為炎癥性病變，部分區(qū)域可見散在的巨噬細(xì)胞和異物巨細(xì)胞[3]。曲霉菌感染以淋巴細(xì)胞為主，局灶細(xì)支氣管周圍可見淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，周邊肺泡腔內(nèi)見大量泡沫樣組織細(xì)胞聚集。毛霉菌感染的肺部炎癥細(xì)胞以中性粒細(xì)胞為主，部分區(qū)域嗜酸性粒細(xì)胞較多并形成嗜酸性小膿腫。6 例肺葉切除標(biāo)本均可見凝固性壞死，且病灶大者現(xiàn)中央空洞形成。曲霉菌感染除大的凝固性壞死周邊有菌群外，其余肺內(nèi)可見小菌團(tuán)，外圍纖維包裹形成，而毛霉菌感染的肺組織內(nèi)則是凝固性壞死中心菌團(tuán)顯著，周圍肺內(nèi)散在菌體。肺毛霉菌病的病變主要為急性化膿性炎性改變，毛霉菌攻擊性極強(qiáng)，很快向周圍播散，并常見血管內(nèi)菌栓形成；毛霉菌侵犯血管比曲霉菌嚴(yán)重，造成血管阻塞和梗死者也較多，壞死和膿腫也較常見；有的病變轉(zhuǎn)為慢性后，其間有大量中性和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)纖維結(jié)締組織增生，毛細(xì)血管壁增厚。曲霉菌菌絲為透明、有隔菌絲，約45°分枝，鹿角樣[4]；毛霉菌菌絲較曲霉菌和念珠菌菌絲大而粗，壁厚，不分隔，或少隔，分支少而無規(guī)則，常呈鈍角或直角分支。巨噬細(xì)胞和異物巨細(xì)胞胞漿內(nèi)可見吞噬的菌絲。隱球菌為透明的大小不等的圓形、空泡狀結(jié)構(gòu)，中央空亮，邊緣肥厚[5，6]。

3.3.2 特殊染色特點(diǎn) PAS 染色效果示毛霉菌不及曲霉菌，呈紫紅色，著色均較淡，如果真菌量少則不易辨別。六胺銀染色呈黑色，但組織染色中彈力纖維染色也呈黑色，故如果真菌量少亦不易明確分辨，要結(jié)合病理常規(guī)HE 染色及免疫熒光染色鏡下所見。

3.3.3 免疫熒光染色特點(diǎn) 該方法是通過免疫熒光技術(shù)，與樣本中相應(yīng)抗原結(jié)合后在熒光顯微鏡特定波段激發(fā)光下呈現(xiàn)特異性熒光成像，UV 波段下真菌呈現(xiàn)亮白色，B 波段下細(xì)菌呈現(xiàn)橘黃色，極易分辨，因此真菌菌絲、孢子都呈現(xiàn)出亮白色，其他組織不顯色或著色暗淡，故可明顯區(qū)分真菌與周圍組織。在熒光顯微鏡下，根據(jù)菌體的形態(tài)、大小，很容易區(qū)分真菌的種、屬。曲霉菌菌絲為透明、有隔菌絲，約45°分枝，鹿角樣；毛霉菌菌絲寬大，壁厚，不分隔，或少隔，分支較少，?！?0°；隱球菌菌體呈現(xiàn)為中央亮白，折光性強(qiáng)，周邊藍(lán)白色莢膜包裹，輪廓清晰。

3.4 鑒別診斷肺部真菌性感染性疾病需要與血管炎和其他肉芽腫性病變相鑒別。著名病理學(xué)家Liebow 提出把肺血管炎和肉芽腫病作為一類疾病，他認(rèn)為這些病變具有相當(dāng)?shù)耐葱?，因?yàn)槠渚哂邢嗨频慕M織學(xué)特點(diǎn)，即肉芽腫形成和血管炎[7]。這類病變常見以下病變。

3.4.1 Wegener 肉芽腫（WG）典型WG 是由壞死性血管類、累及上呼吸道和肺的非化膿性壞死以及局灶性腎小球腎炎組成的三聯(lián)征[8]。影像學(xué)表現(xiàn)為多發(fā)的、有邊緣的、大小不一的不透光結(jié)節(jié)或團(tuán)塊，常伴空洞形成，洞壁厚而不規(guī)則。病變大多發(fā)生于下葉。病理以血管彌漫性壞死性肉芽腫性炎為特征。有的患者會(huì)出現(xiàn)鏡下血尿，臨床表現(xiàn)與真菌性肺炎不同，病理鏡下無真菌結(jié)構(gòu)檢出。

3.4.2 犬惡絲蟲肉芽腫 寄生蟲亦可引起肺部反應(yīng)，在肺組織內(nèi)產(chǎn)生伴血管炎的壞死性肉芽腫性炎性反應(yīng)。這種血管炎中可見類似壞死性結(jié)節(jié)病樣肉芽腫（NSG）或WG 中的巨細(xì)胞，經(jīng)常在壞死性肉芽腫內(nèi)見到著色不佳的、弱嗜酸性的死亡蟲體輪廓，為主要鑒別之處[8]。這種疾病在人體為自限性，多數(shù)患者無明顯癥狀，只是在X 線檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)肺周邊區(qū)孤立性結(jié)節(jié)狀影。

3.4.3 NSG 組織學(xué)上可見多發(fā)的非干酪樣壞死性肉芽腫，可互相融合形成大的結(jié)節(jié)。有些病例可見典型的結(jié)節(jié)病樣肉芽腫形成，伴有血管炎和大片凝固性壞死，有的形成以血管為中心的梗死[9]，罕見肺外病變。影像學(xué)缺乏特異性，可見大片實(shí)變影及空洞形成，肺內(nèi)單發(fā)或多發(fā)的結(jié)節(jié)影。PAS 及抗酸染色陰性。NSG 是一種排除性診斷，均須仔細(xì)排除其他診斷。

3.4.4 淋巴瘤樣肉芽腫?。↙YG）目前有人認(rèn)為L(zhǎng)YG 是淋巴瘤的變形，表現(xiàn)為壞死性肉芽腫和血管炎，伴有異形性淋巴樣細(xì)胞浸潤(rùn)。浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞為具有漿細(xì)胞樣特征的非典型性淋巴網(wǎng)狀細(xì)胞及少量中性粒細(xì)胞或嗜酸性細(xì)胞[9]。部分患者有皮膚損害。該病變主要累及結(jié)外器官，以肺部為主。真菌性肺炎的淋巴細(xì)胞無異形性，這是兩者最重要的鑒別之處。

3.4.5 肺結(jié)核病 典型病變?yōu)楦衫覙訅乃佬匀庋磕[性炎[6]，抵抗力強(qiáng)的患者會(huì)出現(xiàn)增生性病變，形成大而扁平的巨細(xì)胞（Langerhans 細(xì)胞），與巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞形成結(jié)核性肉芽腫；抵抗力弱者、結(jié)核桿菌數(shù)量過多者則出現(xiàn)干酪樣壞死，壞死組織排出體外后肺內(nèi)會(huì)形成空洞。鑒別要點(diǎn)為抗酸陽性，而真菌性肺炎為非干酪樣壞死性肉芽腫性炎，抗酸陰性。

總之，肺深部真菌感染的病例在臨床比較少見，但有不斷增長(zhǎng)的趨勢(shì)，臨床及影像學(xué)缺乏明顯特征，而常規(guī)HE 染色+特殊染色+免疫熒光染色方法的聯(lián)合應(yīng)用可以明確真菌的種、屬，尤其是免疫熒光染色將組織內(nèi)的真菌形態(tài)清晰的顯現(xiàn)在鏡下，為病理醫(yī)生作出明確診斷及臨床針對(duì)性治療提供了可靠依據(jù)。