張恒 李康寧 董海峰 鄭英斌

結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是最常見(jiàn)的消化道腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均較高，目前仍缺乏有效的治療方法來(lái)改善患者預(yù)后[1]。我國(guó)CRC 的發(fā)病率和死亡率也逐年上升，給社會(huì)及患者帶來(lái)了巨大的負(fù)擔(dān)[2]。CRC 的臨床治療方式主要是手術(shù)治療、藥物治療及放射治療等，對(duì)于早期CRC 一般采用手術(shù)治療，為防止術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)、再發(fā)、轉(zhuǎn)移等，通常于術(shù)后周期性使用藥物治療；而對(duì)于中晚期患者，采取手術(shù)治療或在術(shù)前通過(guò)新輔助治療縮小腫瘤，以為進(jìn)一步手術(shù)提供可能，或是通過(guò)一系列藥物治療來(lái)減緩、控制病情發(fā)展[2，3]；因此，藥物在CRC 的治療中有極其重要的作用，而通過(guò)研究更有效的藥物制劑對(duì)于臨床診療意義重大。大量研究已證實(shí)PI3Ks 信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的過(guò)度激活是癌癥發(fā)展的標(biāo)志，尤其是I 類(lèi)PI3Ks，當(dāng)I 類(lèi)（p110α、p110β、p110γ 和p110δ）催化亞基與P85 調(diào)節(jié)亞基結(jié)合時(shí)，它們的激活導(dǎo)致Akt 的蘇氨酸（Thr308）和絲氨酸（Ser473）磷酸化，從而激活mTOR，進(jìn)而在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4，5]。因此，PI3K/Akt 通路在CRC 的研究中是不可忽視的；Bcl-2/Bax 是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要基因，而PI3K/Akt通路與Bcl-2/Bax 的表達(dá)關(guān)系密切[6]，需要進(jìn)一步探究CRC 中該通路是否顯著改變了Bcl-2/Bax 的表達(dá)量。本研究在CRC RKO 細(xì)胞中，采用LY294002抑制PI3K/Akt 通路的激活發(fā)現(xiàn)RKO 細(xì)胞的增殖能力削弱，基于此，作者對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究，為L(zhǎng)Y294002 在人CRC 的治療應(yīng)用方面提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)，并為其他藥物治療的可能性提供方向和指引。

1 材料與方法

1.1 材料本研究收集了2019 年1 月～2020 年12月期間我院收治并確診的CRC 并進(jìn)行手術(shù)的患者的癌組織（71 例）及癌旁組織（48 例）蠟塊標(biāo)本。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書(shū)。購(gòu)買(mǎi)人CRC RKO 細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所），DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液（Gibco 公司），10%胎牛血清（FBS，杭州四季青生物材料有限公司），LY294002（Gibco 公司），CCK-8 試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所公司），p-Akt、Akt、Bax、Bcl-2、GAPDH 一抗（Cell Signaling 公司），過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 及ECL 高靈敏度化學(xué)發(fā)光試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 HE 染色 標(biāo)本均經(jīng)福爾馬林液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，5μm 厚切片，將切片放置65℃烘烤30min。放置于二甲苯中脫蠟，5min/次，共操作3 次，依次放置于無(wú)水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75% 乙醇中，最后用清水沖洗，30s/次，時(shí)間控制在10min 內(nèi)進(jìn)行蘇木精染液染色，自來(lái)水洗，采用1%鹽酸乙醇分化液分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗，0.6%氨水反藍(lán)，15min 以上流水沖洗，細(xì)胞核顏色變?yōu)樗{(lán)色，放置伊紅液（1%）染色60s，自來(lái)水略洗，依次放置于85%乙醇、95%乙醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇中進(jìn)行脫水，30s/次，二甲苯透明，1min/次，共操作3 次，蓋片封片后于顯微鏡下觀(guān)察。

1.2.2 免疫組化 標(biāo)本均經(jīng)福爾馬林液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，5μm 厚切片，將切片放置65℃烘烤30min。放置于二甲苯中脫蠟，5min/次，共操作3次，依次放置于無(wú)水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇中，最后用清水沖洗，30s/次。經(jīng)抗原修復(fù)后，置于3%過(guò)氧化氫室溫孵育20min 以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。清洗后，將切片置于5%BSA中，37℃，封閉2h。一抗、二抗及DAB 染色劑均按說(shuō)明書(shū)配置。蘇木精染液染色采用1%鹽酸乙醇分化液分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗，0.6%氨水反藍(lán)，15min以上流水沖洗，細(xì)胞核顏色變?yōu)樗{(lán)色后，再次透明化，樹(shù)膠封存。免疫組化評(píng)估：陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0 分，陽(yáng)性細(xì)胞1%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，76%～100%為4 分。染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)染色為0 分，弱染色為1 分（+），中等強(qiáng)度染色為2分（++），強(qiáng)染色為3分（+++）?？傇u(píng)分=陽(yáng)性細(xì)胞百分比×染色強(qiáng)度評(píng)分，0～4 分為p-Akt 低表達(dá)，5～12 分為p-Akt 高表達(dá)。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 采用DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)RKO 癌細(xì)胞株（含10% 胎牛血清和1% 青霉素-鏈霉素溶液），待RKO 細(xì)胞在生長(zhǎng)到大約90%后傳代。

1.2.4 細(xì)胞分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞1×105個(gè)/mL接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶。參照細(xì)胞學(xué)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取藥物濃度及分組，將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為3 組：①空白對(duì)照組（Blank 組），僅有DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；②陰性對(duì)照組（DMSO 組）：向DMEM 完全培養(yǎng)基中加入二甲基亞砜（DMSO）；③陽(yáng)性對(duì)照組(LY294002 組)：向DMEM 完全培養(yǎng)基中加入終濃度為20μmol/L的LY294002。

1.2.5 對(duì)細(xì)胞增殖的影響 將RKO 細(xì)胞（3×103細(xì)胞/孔）接種于96 孔板，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組處理或不處理24、48、72h。每孔加入10μL CCK-8 溶液至96 孔板，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2h，于入射光波長(zhǎng)450nm 處測(cè)定吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.6 凋亡實(shí)驗(yàn) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行不同處理，將各組的RKO 細(xì)胞消化離心（1 000r/min，4℃，10min）后收集至15mL 離心管中。每管加入約2mL PBS 緩沖液輕輕洗滌管內(nèi)細(xì)胞，洗去雜質(zhì)，再次離心，棄去上清，每管加入500μL 結(jié)合液，于避光條件下加入FITC 和PI 染料混勻后立即上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。采用Flowjo 10.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.7 Western blot 檢測(cè)Akt、p-Akt、Bax 和Bcl-2 表達(dá) 將各組細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h 后分別收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，以GAPDH 為內(nèi)參，BCA 定量分別得出樣品蛋白濃度。配制分離膠和濃縮膠，調(diào)整蛋白上樣濃度一致，先將電壓調(diào)至80V使蛋白樣品下沉至分離膠起始部，隨后調(diào)整電壓至120V（觀(guān)察電泳時(shí)確認(rèn)電壓是否穩(wěn)定，條帶是否整齊下壓），當(dāng)樣品臨近底部時(shí)終止電泳，將PVDF 膜浸泡在含5%脫脂奶粉的TBST 中，在小搖床中封閉1h 后，加一抗4℃孵育過(guò)夜，按說(shuō)明書(shū)比例室溫孵育二抗2h，隨后用凝膠成像儀進(jìn)行顯影曝光并記錄灰度值，蛋白相對(duì)含量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用 SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)，連續(xù)變量的多組間比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，非連續(xù)變量的多組間比較采用單因素方差分析，用表示；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，用率表示。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p-Akt 在人CRC 組織中的表達(dá)情況我們對(duì)納入的CRC 患者的組織進(jìn)行HE 染色和免疫組化分析。p-Akt 陽(yáng)性定位在CRC 細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中，結(jié)果如圖1 所示，71 例CRC 患者RKO 細(xì)胞中p-Akt 蛋白高表達(dá)者60例（84.51%），低表達(dá)者1例（15.49%）；48 例CRC 患者癌旁組織細(xì)胞中p-Akt 蛋白高表達(dá)者10 例（20.83%），低表達(dá)者38 例（79.17%）；患者CRC 組織中p-Akt 高表達(dá)率較癌旁組織顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=47.937，P＜0.0001）。

2.2 LY294002 對(duì)CRC RKO 細(xì)胞增殖的影響CCK-8法對(duì)各組進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表1 所示，LY294002 組RKO 細(xì)胞的增殖較其他兩組受限，活力下降，且隨著LY294002 作用時(shí)間的延長(zhǎng)，LY294002 組的RKO 細(xì)胞活力持續(xù)低下，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組中RKO 細(xì)胞的增殖情況

2.3 LY294002 對(duì)CRC RKO 細(xì)胞凋亡的影響根據(jù)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2，與Blank 組及DMSO組相比，LY294002 組的RKO 細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001）。

圖2 LY294002 對(duì)CRC RKO 細(xì)胞凋亡的影響注：與Blank 組和DMSO 組比較，****P＜0.0001

2.4 LY294002 對(duì)CRC RKO 細(xì)胞PI3K/Akt 信號(hào)通路的影響為了進(jìn)一步驗(yàn)證各組RKO 細(xì)胞的PI3K/Akt 信號(hào)通路的表達(dá)情況，采用 Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中p-Akt、Akt、Bax 和Bcl-2 的蛋白表達(dá)變化，結(jié)果顯示，LY294002 組與其他兩組相比，Akt 的總蛋白無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；p-Akt、Bcl-2 明顯降低，Bax 表達(dá)水平顯著增高，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 各組RKO 細(xì)胞Akt、p-Akt、Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

3 討論

CRC 發(fā)病率居全球惡性腫瘤第3 位，且不斷提高。近年來(lái)，雖然臨床醫(yī)學(xué)水平發(fā)展迅速，CRC 的早期篩查及臨床治療方案多樣化并快速發(fā)展，但CRC 患者的生存率卻未得到顯著提高；現(xiàn)今CRC 臨床治療以手術(shù)及化學(xué)治療為主，據(jù)相關(guān)研究顯示，CRC 患者對(duì)相關(guān)化學(xué)藥物耐藥是生存率降低的主要因素之一[7～9]；相關(guān)藥物治療在CRC 治療方案中扮演著重要角色，這些藥物大多通過(guò)調(diào)控癌細(xì)胞生物學(xué)行為而發(fā)揮作用，因此關(guān)于某些生物學(xué)標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的研究就顯得尤為重要[10]。LY294002是第一種人工合成的PI3K/Akt 通路特異性抑制劑，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制PI3K 的ATP 結(jié)合位點(diǎn)來(lái)阻礙PI3K 表達(dá)[11]，其作為PI3K 的廣譜抑制劑，許多研究表明其對(duì)食管癌、腫瘤相關(guān)血管內(nèi)皮細(xì)胞及干細(xì)胞，卵巢癌、肝細(xì)胞癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等腫瘤細(xì)胞有抑制及減滅作用[12～16]。對(duì)某些臨床聯(lián)合用藥（降糖藥物，化療藥物、靶向藥物等抗腫瘤藥物）及一些提取物（從某些植物、動(dòng)物、細(xì)菌等中提?。┭芯堪l(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)使用各種藥物相比，聯(lián)合用藥能夠增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用。在CRC 方向的LY294002 與PI3K/Akt 通 路相關(guān)研究中，少有關(guān)于PI3K/Akt 通路與其密切相關(guān)的Bcl-2/Bax 蛋白表達(dá)情況相聯(lián)合的研究與思考，本研究探索LY294002 通過(guò)PI3K/Akt 通路抑制CRC RKO 細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡的機(jī)制。

PI3K/Akt 通路是重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，已被廣泛證明參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡和分化調(diào)控等多種代謝過(guò)程。PI3K 作用于Akt，使其發(fā)生磷酸化從而被激活，磷酸化的Akt 能夠調(diào)控c-myc 等促進(jìn)細(xì)胞增殖，也能促進(jìn)細(xì)胞成熟、腫瘤血管生成等；此外，PI3K/Akt 是多條信號(hào)通路中的中心位點(diǎn)之一，還可被EGFR、RAS、IRS1、JAK、FAK、c-met等多種上游分子激活[17，18]。這種信號(hào)的異常激活已在包括食管癌、腫瘤相關(guān)血管內(nèi)皮細(xì)胞及干細(xì)胞，卵巢癌、肝細(xì)胞癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等在內(nèi)的人類(lèi)癌癥中廣泛報(bào)道[19，20]；且有報(bào)道稱(chēng)，一些抗癌藥物可以通過(guò)阻斷PI3K/Akt 通路抑制腫瘤細(xì)胞增殖[21]。Bcl-2/Bax 為人體內(nèi)各種細(xì)胞凋亡因子，調(diào)控著細(xì)胞的凋亡過(guò)程，線(xiàn)粒體是人體細(xì)胞中一個(gè)細(xì)胞器，也是內(nèi)在凋亡途徑的中心，其受Bcl-2/Bax 的調(diào)控；Bax 是促凋亡因子，在調(diào)控細(xì)胞凋亡方面有極其重要的作用，是Bcl-2 基因家族的一種，其編碼翻譯的Bax 蛋白為凋亡啟動(dòng)程序的一個(gè)上游蛋白，促使細(xì)胞凋亡；Bcl-2 是抗凋亡因子，可與Bax 拮抗，從而抑制細(xì)胞凋亡；蛋白Bax 可結(jié)合Bcl-2 蛋白并拮抗Bcl-2 蛋白，Bcl-2 與Bax 在調(diào)控凋亡方面相互拮抗，相互制約，共同維護(hù)細(xì)胞正常更替、凋亡的過(guò)程，故可通過(guò)調(diào)整兩者強(qiáng)弱關(guān)系打破平衡，控制凋亡進(jìn)程[22，23]。本研究發(fā)現(xiàn)CRC 組織較癌旁組織的p-Akt 水平顯著升高；根據(jù)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，LY294002 影響下的RKO 細(xì)胞活力較另外兩組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；根據(jù)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)，LY294002 影響下的RKO 細(xì)胞凋亡數(shù)量較對(duì)照組明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)，根據(jù)Western blot 檢測(cè)結(jié)果，各組Akt 總蛋白結(jié)果無(wú)明顯差異，LY294002 組p-Akt 蛋白較另外兩組明顯降低，表明LY294002 抑制了PI3K/Akt 通路，LY294002 組Bax 表達(dá)水平顯著增高，Bcl-2 表達(dá)水平顯著降低，并抑制了CRC RKO 細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡；因此，LY294002 是通過(guò)促進(jìn)Bax、抑制Bcl-2 的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究中Bcl-2/Bax 所受調(diào)控唯一性以及力度大小還無(wú)法完全確認(rèn)，LY294002是否通過(guò)其他途徑影響CRC RKO 細(xì)胞的增殖、凋亡也無(wú)法確認(rèn)；對(duì)于藥物敏感強(qiáng)弱的機(jī)制也仍不清楚，有待于進(jìn)一步的研究探索。

綜上所述，本研究探討了LY294002 作用于CRC RKO 細(xì)胞后其增殖與凋亡表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)LY294002 明顯抑制CRC RKO 細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，顯著殺滅了CRC RKO 細(xì)胞，這與其能抑制PI3K/Akt 通路有關(guān)，也體現(xiàn)了Bcl-2/Bax 的重要性，表明LY294002 用于CRC 治療具有一定的價(jià)值，為CRC 的臨床用藥及藥理方向研究提供了思路。