劉冬梅 郭夢(mèng)雨 費(fèi)冰 李永偉 劉瑩 任彥穎 劉心偉

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是一種重要的機(jī)會(huì)性和醫(yī)源性感染病原體，通常會(huì)在醫(yī)療器械和物體表面形成生物膜，生物膜使細(xì)菌抗性增加，臨床分離的KP 高耐藥率與之密切相關(guān)，給診療帶來(lái)了一定的壓力[1]。黃連素是從三顆針、黃柏、黃連等植物中提取的一種重要生物堿，是公認(rèn)的“中藥抗菌藥物”[2]。我國(guó)是植物藥大國(guó)，研究發(fā)現(xiàn)[3]，多種植物藥對(duì)KP 均有良好的抗菌活性。其中黃連素是一種具有低毒、不易耐藥、在抗炎抗菌方面作用顯著等特點(diǎn)的植物性抗菌藥物。常用鹽酸黃連素又稱鹽酸小檗堿，已被證實(shí)對(duì)銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、白色念珠菌等多種細(xì)菌/真菌具有抗生物膜作用[4～6]。國(guó)內(nèi)也有其他學(xué)者證實(shí)，聯(lián)合使用黃連素可使左氧氟沙星和亞胺培南西司他丁對(duì)KP 發(fā)揮更優(yōu)的抑菌活性[7，8]。但目前黃連素是否能影響KP 生物膜的機(jī)制尚不清晰。本研究通過(guò)測(cè)定黃連素對(duì)KP 的最低抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC），評(píng)估黃連素對(duì)KP的體外抑菌效果。采用結(jié)晶紫半定量法觀察不同濃度黃連素對(duì)KP 生物膜形成過(guò)程的影響，利用實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)高、中、低劑量黃連素對(duì)KP 的Ⅰ型和Ⅲ型菌毛fimA、fimH、mrkA、mrkD、fimK、mrkH基因表達(dá)的影響，分析生物膜相關(guān)基因與生物膜形成能力之間的關(guān)系，初步探討生物膜形成的相關(guān)機(jī)制，以期為黃連素抗KP 生物膜相關(guān)感染提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源KP NTUH-K2044 菌株由國(guó)立臺(tái)灣大學(xué)某教授饋贈(zèng)。

1.2 儀器與試劑哥倫比亞血瓊脂平板（鄭州安圖生物工程股份有限公司），NS-100B 臺(tái)式空氣浴恒溫?fù)u床，鹽酸小檗堿、二甲基亞砜、MH 液體培養(yǎng)基、LB 液體培養(yǎng)基、結(jié)晶紫、總RNA 提取試劑（Trizol）、MightyScript 第一鏈cDNA 合成混液（生工生物工程上海股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 測(cè)定黃連素對(duì)KP 的MIC 采用微量肉湯稀釋法測(cè)定MIC，具體操作按臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)M100-S27 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。肉眼觀察MH 液體培養(yǎng)基中細(xì)菌渾濁程度，以完全抑制細(xì)菌可見(jiàn)生長(zhǎng)的藥物濃度作為MIC。

1.3.2 結(jié)晶紫染色法半定量檢測(cè)生物膜 將細(xì)菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期（OD600約為0.5），用LB 液體培養(yǎng)基稀釋100 倍，分別加入96 孔板實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中。實(shí)驗(yàn)組再加入黃連素，終濃度分別為1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC，對(duì)照組再加入等體積LB 液體培養(yǎng)基。根據(jù)KP 生物膜形成的周期特點(diǎn)，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜態(tài)培養(yǎng)24h、72h、120h，各組結(jié)晶紫染色后，使用酶標(biāo)儀在 570nm 處測(cè)定OD 值。

1.3.3 RT-PCR 測(cè)定 ①總RNA 提?。菏褂肨rizol試劑提取總RNA，具體操作按試劑說(shuō)明書進(jìn)行。②RT-PCR 反應(yīng)測(cè)定：使用MightyScript 第一鏈cDNA 合成Master Mix，按照說(shuō)明書完成逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。設(shè)計(jì)KP 生物膜形成相關(guān)基因和管家基因16sRNA 特異性引物，以16sRNA 為內(nèi)參，LB 組為對(duì)照，檢測(cè)不同濃度黃連素對(duì)上述基因表達(dá)的影響，引物見(jiàn)表1，按2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 KP 生物膜形成相關(guān)基因和管家基因引物信息

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 25 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)近似正態(tài)分布以統(tǒng)計(jì)，文中用柱狀圖表示；組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用GraphPaid Prism 9.0 軟件繪制圖片。

2 結(jié)果

2.1 黃連素對(duì)KP 的MIC 值結(jié)果顯示，當(dāng)黃連素濃度低于2 048μg/mL 時(shí)，MH 液體培養(yǎng)基中細(xì)菌呈現(xiàn)不同程度生長(zhǎng)；當(dāng)黃連素濃度為2 048μg/mL和4 096μg/mL 時(shí)，培養(yǎng)基中無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。即黃連素對(duì)KP 的MIC 值為2 048μg/mL。

2.2 黃連素對(duì)KP 生物膜形成總量的作用培養(yǎng)24h 后，各組細(xì)菌均有生物膜形成，生物膜形成量在第72h 達(dá)到最大值，進(jìn)入成熟期；在第120h 有所下降，進(jìn)入分散期。與對(duì)照組相比，1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC 黃連素組細(xì)菌生物膜形成量在24h、72h、120h 均有所降低（P＜0.05）；生物膜形成的各時(shí)期，黃連素濃度越高，生物膜形成量越低，不同濃度黃連素組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

2.3 黃連素對(duì)KP 的Ⅰ型和Ⅲ型菌毛相關(guān)基因表達(dá)的作用采用RT-PCR 法檢測(cè)黃連素對(duì)KP 的Ⅰ型和Ⅲ型菌毛相關(guān)基因表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，不同濃度黃連素對(duì)KP 的Ⅰ型和Ⅲ型菌毛結(jié)構(gòu)基因fimA、fimH、mrkA、mrkD及調(diào)控基因fimK、mrkH表達(dá)均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用（P＜0.05），并且隨著黃連素濃度的增加，抑制作用呈上升趨勢(shì)。見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度黃連素對(duì)KP 的Ⅰ型和Ⅲ型菌毛相關(guān)基因mRNA 表達(dá)的影響

3 討論

KP 是臨床分離病原菌中常見(jiàn)的一種革蘭陰性桿菌，因較強(qiáng)的生物膜形成能力而在一定程度上增強(qiáng)其耐藥性，隨著中醫(yī)藥的不斷發(fā)展和研究的逐步深入，大量具有抗菌作用的中藥被發(fā)現(xiàn)，這些中藥因其成分復(fù)雜，既有抗感染的作用，又有調(diào)節(jié)機(jī)體的綜合作用，使細(xì)菌不易產(chǎn)生耐藥性而被廣泛研究，黃連素是其中一種抗菌作用明顯且應(yīng)用廣泛的中藥[10]。本研究中測(cè)得黃連素對(duì)KP 的MIC 值為2 048μg/mL，細(xì)菌生長(zhǎng)幾乎被完全抑制，表明黃連素對(duì)KP 的生長(zhǎng)具有抑制作用。

研究表明，黃連素對(duì)多種細(xì)菌/真菌的生物膜均具有抑制作用，其作用機(jī)制主要包括減少白色念珠菌菌絲形成，抑制生物膜中多糖胞間黏附素的合成和eDNA 的釋放，以及抑制多藥耐藥沙門氏菌生物膜形成相關(guān)基因luxS、rpoE和ompR的表達(dá)等[16，17]。本課題組的前期研究也表明，黃連素能夠抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成和生物膜成分藻酸鹽的合成[4]。本研究中，結(jié)晶紫半定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在生物膜形成的各個(gè)階段，不同濃度黃連素均顯著抑制KP 生物膜形成總量，且抑制作用呈劑量依賴性增加，說(shuō)明黃連素能抑制KP 生物膜的形成。結(jié)合生物膜形成的階段性特征，我們推測(cè)，在生物膜形成時(shí)，相較于對(duì)KP 生長(zhǎng)與增殖的抑制作用，黃連素對(duì)KP 表面黏附的抑制作用可能更明顯。在生物膜形成初期，黃連素主要依靠抑制KP 的表面黏附發(fā)揮作用，使得黏附于介質(zhì)表面的細(xì)菌數(shù)量明顯減少；隨著生物膜的不斷成熟，已經(jīng)黏附的細(xì)菌不斷增殖并分泌細(xì)胞外聚合物，此時(shí)黃連素對(duì)生物膜內(nèi)細(xì)菌的作用主要表現(xiàn)為對(duì)其生長(zhǎng)增殖的抑制；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，生物膜進(jìn)入分散期，生物膜的主動(dòng)分散使得其強(qiáng)度相較于成熟期有所下降，對(duì)黃連素的耐受作用也相對(duì)降低，導(dǎo)致黃連素對(duì)膜內(nèi)細(xì)菌的抑制作用在一定程度上增加。

KP 在生物或非生物介質(zhì)表面的黏附主要由Ⅰ型菌毛和Ⅲ型菌毛介導(dǎo)，Ⅰ型菌毛存在于大腸桿菌、沙門菌、KP 等多種革蘭氏陰性細(xì)菌表面，呈絲狀結(jié)構(gòu)，由fim基因簇編碼，其頂端主要由FimA 亞基和FimH 亞基組成，F(xiàn)imH 可以與膀胱細(xì)胞表面的甘露糖殘基結(jié)合，有助于KP 對(duì)膀胱細(xì)胞的侵襲和泌尿道感染膀胱中生物膜的形成[18，19]。fimA編碼具有DNA 結(jié)合域的調(diào)控子，通過(guò)與fimA上游啟動(dòng)子區(qū)特異性地結(jié)合而激活fimA的轉(zhuǎn)錄作用[20]。Ⅲ型菌毛呈螺旋狀結(jié)構(gòu)，由mrk基因簇編碼，主要結(jié)構(gòu)為MrkA 亞基，末端連接MrkD 亞基，MrkA 可直接結(jié)合到非生物體如醫(yī)療器械表面，而MrkD 可與暴露在受損組織和植入裝置上的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合。MrkH 是一種c-di-GMP 依賴型轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，可直接與RNA 聚合酶相互作用來(lái)激活mrkA表達(dá)[21]。Wang等[22]研究證明，Ⅲ型菌毛缺陷菌株形成生物膜的能力明顯低于野生株。Stahlhut 等[23]研究表明，KP的Ⅰ型和Ⅲ型菌毛均能促進(jìn)導(dǎo)管上生物膜的形成，并且二者的促進(jìn)作用相互協(xié)同，當(dāng)Ⅰ型和Ⅲ型菌毛都不存在時(shí)，KP 形成生物膜的能力嚴(yán)重減弱。本研究通過(guò)RT-PCR 檢測(cè)不同濃度黃連素對(duì)KP 的Ⅰ型和Ⅲ型菌毛相關(guān)基因表達(dá)的影響，1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC 黃連素均不同程度抑制KP Ⅰ型和Ⅲ型菌毛結(jié)構(gòu)基因fimA、fimH、mrkA、mrkD和調(diào)控基因fimK、mrkH的表達(dá)，并且隨黃連素濃度增加，抑制作用越明顯，說(shuō)明黃連素可通過(guò)下調(diào)fimA、fimH、fimK、mrkA、mrkD和mrkH的表達(dá)，減少KP的Ⅰ型和Ⅲ型菌毛形成，但黃連素調(diào)控這些基因表達(dá)的相關(guān)機(jī)制需進(jìn)一步研究。

綜上所述，我們認(rèn)為黃連素可通過(guò)下調(diào)KP 的Ⅰ型和Ⅲ型菌毛結(jié)構(gòu)基因fimA、fimH、mrkA、mrkD以及調(diào)控基因fimK、mrkH的表達(dá)減少Ⅰ型和Ⅲ型菌毛表達(dá)量，降低KP 的表面黏附能力，進(jìn)而有效抑制KP 生物膜形成，為KP 感染的相關(guān)診療提供理論依據(jù)。