馮政軒, 樊子怡, 陳詩(shī)薇, 謝政廣, 陳凱陽(yáng), 周敏琪, 方 劍

(紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院, 浙江 紹興 312000)

腸纖維化是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)的一種嚴(yán)重并發(fā)癥,其以腸間質(zhì)細(xì)胞過(guò)度增殖、腸壁細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)過(guò)度沉積和腸道黏膜肌層過(guò)度生長(zhǎng)為特征,導(dǎo)致腸道狹窄、腸梗阻和瘺管形成等一系列進(jìn)展[1]。隨著生物制劑時(shí)代的到來(lái),對(duì)于腸纖維化治療手段的研究已有許多進(jìn)展,但腸道狹窄的發(fā)生率并未顯著降低。目前尚未找到針對(duì)腸纖維化的有效藥物的治療方法[2]。雖然手術(shù)治療已被證明對(duì)腸纖維化患者有益但無(wú)法根治,70%～90%的患者1年內(nèi)會(huì)出現(xiàn)內(nèi)鏡下復(fù)發(fā),高達(dá)35%的患者10年內(nèi)需再次行腸道切除手術(shù)[3]。為此,迫切需要有效減輕腸道纖維化的替代防治策略。

Omega-3多不飽和脂肪酸(ω-3 polyunsaturated fatty acids,ω-3 PUFAs)包括二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA),已在人群和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí),其誘導(dǎo)并維持IBD患者慢性炎癥癥狀緩解[4],特別是EPA及其衍生物resolvin E3(RvE3)在其他器官中還具有抗纖維化作用[5]。盡管ω-3 PUFAs在其他器官中抗纖維化作用已有報(bào)道,但在IBD中由于腸道微環(huán)境的嚴(yán)重紊亂,腸纖維化的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,因此需要進(jìn)一步研究。雖然慢性腸道炎癥是IBD患者腸纖維化的有利誘因,但僅僅控制腸道炎癥無(wú)法阻止疾病進(jìn)展,也不能逆轉(zhuǎn)已形成的纖維化[6]。慢性炎癥反復(fù)刺激腸道導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)過(guò)度積累和纖維化的形成。研究表明,來(lái)源于上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)的肌成纖維細(xì)胞是產(chǎn)生ECM的關(guān)鍵細(xì)胞,也是IBD患者腸纖維化的發(fā)病因素之一。本研究以2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)構(gòu)建IBD相關(guān)腸纖維化模型,比較DHA、EPA單獨(dú)干預(yù)以及DHA和EPA聯(lián)合干預(yù)對(duì)IBD小鼠腸纖維化的影響,并從腸黏膜屏障功能、ECM代謝平衡及自噬通路活化等方面深入挖掘DHA、EPA差異調(diào)節(jié)作用,為明確DHA、EPA在IBD相關(guān)腸道纖維化防治中的應(yīng)用價(jià)值提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

8周齡雄性BALB/C小鼠(20～22 g)共40只,購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,飼養(yǎng)于紹興文理學(xué)院附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室。溫度(25±3)℃,相對(duì)濕度(50±10)%,噪聲強(qiáng)度≤60 dB,光/暗循環(huán)12 h,期間小鼠自由攝水取食,隔日更換墊料、飼料和飲水瓶。所有動(dòng)物福利和實(shí)驗(yàn)程序均遵循國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理的法律、法規(guī)、技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)規(guī)定,并經(jīng)紹興文理學(xué)院附屬第一醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 材料

高純度DHA、EPA純化油脂和魚(yú)油訂購(gòu)于上?；ケ娝帢I(yè)有限公司,乙酯型DHA純化油脂DHA含量為99.20%,乙酯型EPA純化油脂EPA含量為98.92%。魚(yú)油中總ω-3 PUFAs含量為98.05%,其中DHA含量為47.25%,EPA含量為48.24%。TNBS(德國(guó)Sigma公司);糞便飲血試劑盒(南京建成生物工程研究所);小鼠ELISA試劑盒腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10,IL-10)、白細(xì)胞介素-17(interleukin-17,IL-17)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)購(gòu)于杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司;用于Western印跡和免疫組化檢測(cè)抗體購(gòu)自英國(guó)Proteintech公司。

1.3 動(dòng)物模型建立和治療方案

參考《Nature Protocols》的方法建立TNBS誘導(dǎo)IBD相關(guān)小鼠腸纖維化模型[7],將40只8周齡雄性BALB/C分為空白對(duì)照組、TNBS誘導(dǎo)腸纖維化小鼠模型組、DHA干預(yù)組、魚(yú)油干預(yù)組和EPA干預(yù)組,每組8只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,除空白對(duì)照組外,其他各組造模的小鼠禁食不禁水24 h,予腹腔注射4%的水合氯醛(200 μL/20 g)麻醉,將直徑約為2 mm的醫(yī)用聚乙烯管從肛門(mén)插入至距肛門(mén)邊緣約3～4 cm處。給予小鼠100 μL含1.0～2.5 mg的TNBS+45%乙醇溶液灌腸,然后將小鼠提住尾部倒置1～2 min,防止藥液流出,每周重復(fù)實(shí)驗(yàn),共7周。每周灌腸液中TNBS量為:1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5 mg。

結(jié)合前期研究和文獻(xiàn)報(bào)道[8,9],確定DHA、EPA和魚(yú)油干預(yù)劑量為400 mg/kg·bw。為確保不增加小鼠的額外能量攝入,并且能夠與ω-3 PUFAs形成穩(wěn)定的水包油型乳化體系,本研究采用10%阿拉伯樹(shù)膠溶液作為配制ω-3 PUFAs的溶劑。在建模前,空白對(duì)照組和TNBS模型組小鼠每天給予10%阿拉伯膠灌胃,共4周;DHA干預(yù)組、魚(yú)油干預(yù)組和EPA干預(yù)組則給予400 mg/kg·bw的DHA、魚(yú)油或EPA灌胃。在建模期間,空白對(duì)照組和TNBS模型組小鼠繼續(xù)給予每天10%阿拉伯膠灌胃,共7周;DHA干預(yù)組、魚(yú)油干預(yù)組和EPA干預(yù)組則繼續(xù)給予400 mg/kg·bw的DHA、魚(yú)油或EPA灌胃,實(shí)驗(yàn)分組及治療方案見(jiàn)Fig.1A所示。在造模期間每日記錄小鼠體重,從小鼠體重下降、糞便性狀及便血情況進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)計(jì)算。結(jié)束實(shí)驗(yàn)時(shí),留取血清和結(jié)腸組織樣本,保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

Fig.1 ω-3 PUFAs attenuate intestinal fibrosis in TNBS mice model (n=8) (A) Schematic overview of the models. Mice were given 100 μL of TNBS+45% ethanol solution containing 1.0-2.5 mg by gavage, and the experiment was repeated weekly for 7 weeks. Before modelling, mice in the control and TNBS-induced IBD model groups were given 10% gum arabic by gavage daily for 4 weeks, while mice in the DHA group, fish oil group and EPA group were given 400 mg/kg·bw of DHA, fish oil or EPA respectively by gavage. During the modelling period, mice in the control and TNBS-induced IBD model groups continued to be given 10% gum arabic by gavage daily for 7 weeks, and mice in the DHA, fish oil and EPA groups were given 400 mg/kg·bw of DHA, fish oil or EPA respectively by gavage. (B) The change of body weight of mice was shown for each group. (C) Disease activity index of mice in each group were monitored. (D) Effect of ω-3 PUFAs on the levels of long chain polyunsaturated fatty acids in the colon of mice. (E) The representative images of macroscopic appearance of colons and the measurement of colon length and weight were shown (*P<0.05, **P<0.01, compared with the control group. #P<0.05, ##P<0.01, compared with the TNBS model group)

1.4 結(jié)腸組織標(biāo)本采集與處理

小鼠麻醉后采用眼眶取血法收集外周血于1.5 mL Eppendorf管中,靜置30 min,4 ℃,1 500 g,離心30 min,收集的血清用于檢測(cè)炎癥因子和促纖維化因子。小鼠行頸椎脫臼,消毒腹部,并沿腹中線充分暴露腹腔,獲得小鼠回盲部到肛門(mén)的完整結(jié)腸,測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度和重量。迅速放入預(yù)冷的生理鹽水中沖洗掉血液及污物,取靠近肛門(mén)處0.5～1.0 cm的結(jié)腸組織到10%福爾馬林溶液中固定,用于組織病理切片染色;剩余組織分裝至無(wú)菌無(wú)酶EP管中并放入-80 ℃冰箱保存,用于檢測(cè)脂肪酸含量、qRT-PCR和Western印跡分析。

1.5 氣相色譜法檢測(cè)小鼠結(jié)腸中脂肪酸含量

結(jié)腸組織中脂肪酸提取與檢測(cè)方法參考康景軒等人[10]發(fā)表的文章,實(shí)驗(yàn)步驟主要包括浸提、脂肪酸甲酯化和上機(jī)檢測(cè)三個(gè)過(guò)程。先將小鼠組織解凍,稱(chēng)取約50 mg結(jié)腸組織于離心管中,加入5 mL氯仿/甲醇溶液(2∶1,V/V),在4 ℃組織勻漿機(jī)中充分碾磨,旋渦后4 ℃過(guò)夜浸提。加1 mL 0.9% NaCl溶液,分層后保留氯仿層,加正己烷和14%三氟化硼/甲醇溶液各1 mL,在90～110 ℃金屬浴中加熱1 h。冷卻后,加1 mL去離子水,1 000 g離心5 min,取上清,用30 ℃的氮?dú)獯蹈?再加入200 μL正己烷溶解,上機(jī)檢測(cè)。

1.6 小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)分析

對(duì)充分固定的結(jié)腸組織進(jìn)行梯度脫水與透明、浸蠟與包埋、切片與撈片、脫蠟復(fù)水、H&E、Masson和天狼星紅染色、梯度脫水、透明和樹(shù)膠封片,委托臨床病理中心專(zhuān)業(yè)技師全盲閱片,并參考方劍等人的論文中小鼠結(jié)腸炎組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)H&E染色進(jìn)行評(píng)分[8],Theiss等人腸纖維化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)Masson及天狼星紅染色進(jìn)行結(jié)腸纖維化程度評(píng)分[11]。

1.7 qRT-PCR分析

按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第四版)》中的Trizol法提取小鼠結(jié)腸組織中的總RNA,按全式金EasyScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒獲得cDNA。以上步驟所得的cDNA按TransScript? II Multiplex Probe One-Step qRT-PCR SuperMix UDG操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,并定量PCR檢測(cè)目標(biāo)基因,所有引物均從Primer Bank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得(https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/index.html),并委托華大基因公司合成,GAPDH作為內(nèi)參,引物列表見(jiàn)Table 1。計(jì)算2-ΔΔCt來(lái)分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

Table 1 Sequences of primers designed for qRT-PCR

1.8 Western免疫印跡檢測(cè)

稱(chēng)取約100 mg結(jié)腸組織于1.5 mL EP管中,加200 μL組織裂解液,用4 ℃組織勻漿機(jī)充分碾磨組織,經(jīng)漩渦振蕩,置于冰水浴30～60 min,20 000 g,4 ℃離心20 min,按照細(xì)胞核蛋白質(zhì)中與細(xì)胞漿蛋白質(zhì)中抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)(碧云天生物技術(shù)有限公司)提取蛋白質(zhì),用BCA法定量蛋白質(zhì)濃度,于95 ℃金屬浴變性5 min。按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第四版)》中的方法,根據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)分子量大小配制對(duì)應(yīng)的SDS-PAGE膠。利用化學(xué)發(fā)光底物處理后用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè),Image J軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.9 免疫組織化學(xué)染色

10%甲醛充分固定結(jié)腸組織,石蠟包埋、制成5 μm切片,用二甲苯脫蠟水化,用檸檬酸鈉(pH 6.0)高壓修復(fù)2.5 min,置于3% H2O2室溫孵育30 min,阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶,經(jīng)PBS洗滌30 min共3次,用5%二抗來(lái)源血清封閉60 min,按一抗說(shuō)明書(shū)稀釋抗體,在濕盒中4 ℃孵育過(guò)夜(12～16 h)。再與標(biāo)記有生物素的二抗室溫孵育30 min,經(jīng)PBS洗滌30 min共3次,滴加SABC-POD工作液,室溫孵育30 min,加新配制DAB顯色液顯色,之后行脫水、透明、封片和上機(jī)觀察,應(yīng)用AxioVision release 4.8軟件計(jì)算陽(yáng)性區(qū)域與總視野區(qū)域中的光密度比計(jì)算。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用IBM SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn),符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后,多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間兩兩比較采用事后檢驗(yàn)LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)量資料數(shù)據(jù)符合正態(tài)性并方差齊,則相關(guān)性分析使用Pearson檢驗(yàn),結(jié)果用R值表示相關(guān)性,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01表示差異有顯著性。使用Graphpad Prism 9.1.0繪制圖片。

2 結(jié)果

2.1 二十碳五烯酸對(duì)腸纖維化小鼠的抗炎作用優(yōu)于DHA

2.1.1 TNBS誘導(dǎo)腸纖維化小鼠模型構(gòu)建的鑒定 通過(guò)每日監(jiān)測(cè)各組小鼠體重變化和疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index,DAI),實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)結(jié)腸長(zhǎng)度與水腫程度評(píng)估,確認(rèn)造模是否成功,結(jié)果正如Fig.1所示。與空白對(duì)照組相比,TNBS模型組小鼠體重逐漸下降,結(jié)合Table 1可知,造模開(kāi)始前1 d(0 d)各組小鼠體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,在實(shí)驗(yàn)周期第20 d時(shí)TNBS模型組小鼠體重(19.44 ± 0.07)達(dá)到最低點(diǎn)(P<0.01)。相較于空白對(duì)照組,TNBS模型組小鼠在實(shí)驗(yàn)周期第20 d [4 (3.71, 4.04)]和第48 d DAI評(píng)分[3 (1.93, 4.76)]顯著升高(P<0.01),見(jiàn)Fig.1和Table 2。實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束時(shí),與空白對(duì)照組相比,TNBS模型組結(jié)腸充血縮短、結(jié)腸重量/長(zhǎng)度比值均高于空白對(duì)照組(P<0.01)。根據(jù)小鼠結(jié)腸組織的H&E染色組織病理學(xué)評(píng)分顯示(Fig.2),相比于空白對(duì)照組,TNBS模型組小鼠組織病理學(xué)評(píng)分顯著提高(P<0.01)。血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果同樣證實(shí),TNBS模型組中促炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-17表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01),Treg特異性細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)水平明顯低于空白對(duì)照組(P<0.01),結(jié)果正如Fig.2和Table 3所示。對(duì)小鼠結(jié)腸組織的Masson及天狼星紅染色進(jìn)行腸纖維化程度分析發(fā)現(xiàn)(Fig.3),與空白對(duì)照組相比,TNBS模型組小鼠組織腸纖維化評(píng)分顯著提高(P<0.01)?？梢?jiàn),已成功構(gòu)建TNBS腸纖維化小鼠模型。

Fig.3 ω-3 PUFAs attenuate intestinal fibrosis in TNBS mice model was evaluated by histology and fibrosis degree (n=8) (A, B) Representative images of Masson, and Sirus red stained sections of distal colon specimens were shown (×40, scale bar 500 μm; ×100, scale bar 200 μm). Fibrotic alterations were reflected by the fibrosis score. The absolute thickness of the submucosa in each group. (C) The concentrations of serum TGF-β, IGF-1, and hydroxyproline were quantified by ELISA kits at the end of the experiment. (D) Correlation analysis of EPA content in the colon with intestinal fibrosis score. (*P<0.05, **P<0.01, compared with the control group. #P<0.05, ##P<0.01, compared with the TNBS model group)

2.1.2 ω-3 PUFAs對(duì)腸纖維化小鼠結(jié)腸組織脂肪酸構(gòu)成存在差異 用氣相色譜(gas chromatography,GC)法分析各組小鼠結(jié)腸組織中脂肪酸的構(gòu)成,結(jié)果見(jiàn)Fig.1D。空白對(duì)照組和TNBS模型組整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期均無(wú)ω-3 PUFAs干預(yù),故2組小鼠結(jié)腸中ω-3 PUFAs組成均處于基線水平,且無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。相較于TNBS模型組,DHA、EPA和魚(yú)油干預(yù)組ω-3 PUFAs含量差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),表現(xiàn)為EPA干預(yù)組小鼠結(jié)腸中ω-3 PUFAs含量最高,DHA干預(yù)組最低。與TNBS模型組相比,DHA、魚(yú)油和EPA干預(yù)組結(jié)腸中的DHA和EPA富集程度均提高(P<0.05),其中EPA干預(yù)組小鼠結(jié)腸中EPA含量高于DHA和魚(yú)油干預(yù)組(P<0.05),值得注意的是DHA、魚(yú)油和EPA干預(yù)組小鼠結(jié)腸中DHA含量維持在同一水平。與TNBS模型組相比,EPA干預(yù)組小鼠結(jié)腸中花生四烯酸(arachidonic acid,AA)含量最低(P<0.01),其次是魚(yú)油干預(yù)組,DHA干預(yù)組則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。可見(jiàn),DHA、魚(yú)油和EPA干預(yù)均可提高小鼠結(jié)腸中ω-3 PUFAs水平,但EPA干預(yù)組對(duì)提高腸纖維化小鼠結(jié)腸組織中ω-3 PUFAs、DHA和EPA水平效果最好,同時(shí)還能有效降低小鼠結(jié)腸組織中AA水平。

2.1.3 從疾病活動(dòng)指數(shù)分析ω-3 PUFAs緩解腸纖維化小鼠結(jié)腸組織炎癥存在差異 根據(jù)各組小鼠體重變化典型時(shí)間點(diǎn)評(píng)定疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI),結(jié)果正如Fig.1C和Table 2所示。與體重丟失變化趨勢(shì)一樣,各組小鼠DAI評(píng)分在第20 d達(dá)到最高峰,其中DHA和魚(yú)油干預(yù)組評(píng)分最高,EPA干預(yù)組最低。與TNBS模型組DAI評(píng)分[4 (3.71, 4.04)]相比,EPA干預(yù)組DAI評(píng)分[2 (2.00, 2.37)]顯著降低(P<0.01),DHA干預(yù)組DAI評(píng)分[3.5 (3.46, 3.78)]和魚(yú)油干預(yù)組DAI評(píng)分[3.5 (3.13, 3.62)]無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。第36 d后DAI評(píng)分進(jìn)一步回升,但仍表現(xiàn)為EPA干預(yù)組DAI評(píng)分[1.5 (2.88, 2.43)]最低,DHA [3 (1.81, 5.40)]和魚(yú)油干預(yù)組[2.75 (1.97, 4.66] DAI評(píng)分有所下降,但兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)EPA干預(yù)組小鼠DAI評(píng)分與DHA、魚(yú)油干預(yù)組有差異(P<0.01),結(jié)合圖Fig.1C所示,DAI評(píng)分呈現(xiàn)TNBS模型組>DHA干預(yù)組>魚(yú)油干預(yù)組>EPA干預(yù)組,EPA干預(yù)組小鼠腸炎程度最輕。結(jié)果正如圖Fig.1E所示,空白對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織顏色正常,無(wú)充血和水腫;而TNBS模型組結(jié)腸組織腸道充血、水腫,結(jié)腸長(zhǎng)度短于空白對(duì)照組(P<0.01),而結(jié)腸重量/長(zhǎng)度比值高于空白對(duì)照組(P<0.01);DHA干預(yù)組、魚(yú)油干預(yù)組和TNBS模型組類(lèi)似,小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度、結(jié)腸重量/長(zhǎng)度比值與TNBS模型組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;EPA干預(yù)組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度、結(jié)腸重量/長(zhǎng)度比值與空白對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示,EPA干預(yù)能明顯減輕腸纖維化小鼠結(jié)腸水腫、充血等炎癥癥狀,其效果優(yōu)于DHA和魚(yú)油干預(yù)。

Table 2 The body weight changes of mice (n=8)

Table 3 The disease activity index changes of mice (n=8)

2.1.4 從組織病理學(xué)分析ω-3 PUFAs緩解腸纖維化小鼠結(jié)腸組織炎癥存在差異 根據(jù)各組小鼠結(jié)腸組織中隱窩結(jié)構(gòu)、炎細(xì)胞浸潤(rùn)和黏膜厚度等方面進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)分,結(jié)果正如Fig.2和Table 3所示。與空白對(duì)照組相比,TNBS模型組小鼠結(jié)腸隱窩結(jié)構(gòu)嚴(yán)重變形或扭曲,杯狀細(xì)胞大量耗竭,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)到漿膜層,上皮多處糜爛或潰瘍,黏膜層厚度顯著抬高。相較于TNBS模型組,魚(yú)油干預(yù)組的組織學(xué)評(píng)分下降(P<0.05),EPA干預(yù)組評(píng)分最低(P<0.01),而DHA干預(yù)組則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與空白對(duì)照組相比,TNBS誘導(dǎo)后血清和組織中TNF-α(96.75±3.70),Th17細(xì)胞誘導(dǎo)分化因子IL-6(118.38±3.58)和特異性細(xì)胞因子IL-17(836.88±7.70)表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.01)。相反,TNBS模型組Treg細(xì)胞特異性細(xì)胞因子IL-10(112.00±1.20)分泌顯著減少(P<0.01)。相較于TNBS模型組,EPA干預(yù)顯著提高了TNBS誘導(dǎo)的腸纖維化小鼠結(jié)腸中IL-10(386.14±3.73)表達(dá)水平(P<0.01),明顯下調(diào)促炎因子IL-17(445.14±9.03)、IL-6(38.43±1.51)和TNF-α(24.14±1.83)的表達(dá)水平,其次為魚(yú)油干預(yù)組(P<0.05),然而DHA干預(yù)組與TNBS模型組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。通過(guò)分析各組小鼠第20 d、第48 d DAI評(píng)分、組織病理學(xué)評(píng)分和血清、組織中各炎癥因子間的相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)第20 d DAI評(píng)分與血清中IL-6呈正相關(guān)(R= 0.64,P<0.05),與IL-17呈正相關(guān)(R= 0.41,P<0.05),與IL-10呈負(fù)相關(guān)(R=-0.57,P<0.05),與組織學(xué)評(píng)分呈正相關(guān)(R= 0.42,P<0.05)。由此可見(jiàn),EPA干預(yù)能恢復(fù)Th17/Treg細(xì)胞在TNBS誘導(dǎo)的腸纖維化中的平衡,維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)。

Table 4 Inflammatory cytokines content in serum of mice (n=8)

2.2 二十碳五烯酸對(duì)腸纖維化小鼠的抗纖維化作用優(yōu)于DHA

2.2.1 從纖維化程度分析ω-3 PUFAs緩解腸纖維化小鼠纖維化存在差異 上述分析結(jié)果提示,ω-3 PUFAs對(duì)腸纖維化小鼠抗炎效果存在差異,EPA的抗炎作用優(yōu)于DHA。為了進(jìn)一步確認(rèn)ω-3 PUFAs的抗纖維化作用,從TNBS誘導(dǎo)建立腸纖維化模型開(kāi)始,繼續(xù)給予各組小鼠不同類(lèi)型的ω-3 PUFAs干預(yù)(Fig.1A)。通過(guò)Masson和天狼星染色發(fā)現(xiàn)(Fig.3),空白對(duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜下存在少量膠原沉積;ELISA法檢測(cè)組織中膠原主要成分羥脯氨酸,以及血清和組織中的促纖維化因子TGF-β、IGF-1表達(dá)水平均最低。與空白對(duì)照組相比,TNBS模型組大量膠原蛋白沉積在黏膜及黏膜下層,測(cè)量黏膜下層的最大及最小厚度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01,P<0.05),腸纖維化評(píng)分最高(P<0.01),組織中膠原主要成分羥脯氨酸,以及血清和組織中的促纖維化因子TGF-β、IGF-1表達(dá)水平均最高。DHA和魚(yú)油干預(yù)組與TNBS模型組無(wú)差異;EPA干預(yù)組小鼠腸纖維化減輕,羥脯氨酸水平顯著降低(P<0.01),腸纖維化評(píng)分和黏膜下層的最大及最小厚度與空白對(duì)照組無(wú)差別。接著分析結(jié)腸中EPA含量與腸纖維化評(píng)分之間的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)兩者存在負(fù)相關(guān)(R2= 0.7383,P<0.0004;R2= 0.4608,P<0.0152),結(jié)果見(jiàn)Fig.3D。以上結(jié)果提示,EPA干預(yù)能明顯減輕小鼠腸黏膜纖維化癥狀,其作用效果優(yōu)于DHA。

2.2.2 ω-3 PUFAs抑制腸纖維化小鼠結(jié)腸組織ECM沉積存在差異 MMPs/TIMPs失衡介導(dǎo)ECM產(chǎn)生和降解之間的不平衡,從而加劇IBD患者的腸道纖維化。為進(jìn)一步了解ω-3 PUFAs對(duì)腸纖維化小鼠結(jié)腸組織ECM沉積發(fā)揮的差異作用,將各組小鼠結(jié)腸組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)和qRT-PCR分析,結(jié)果見(jiàn)Fig.4。相較于空白對(duì)照組,TNBS模型組小鼠結(jié)腸組織中TIMP-1表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01),MMP-2、9表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01);qRT-PCR和免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)一步顯示,TNBS模型組小鼠結(jié)腸黏膜和黏膜下層Col1a2和Col3a2表達(dá)量高于空白對(duì)照組(P<0.01),這與Masson和天狼星染色結(jié)果相一致。與其相反,EPA干預(yù)組能有效減少小鼠結(jié)腸黏膜和黏膜下層中Col1a2和Col3a2的表達(dá)水平,而DHA和魚(yú)油干預(yù)組則與模型對(duì)照組無(wú)差異。以上結(jié)果顯示,EPA干預(yù)可以通過(guò)調(diào)節(jié)TIMPs/MMPs之間的平衡來(lái)減弱腸纖維化小鼠黏膜中ECM沉積。

Fig.4 ω-3 PUFAs alleviate fibrotic deposition by promoting ECM metabolic homeostasis in TNBS mice (n=8) (A, B) The expression of Col1a2, and Col3a2 was detected by immunohistochemical staining of distal colon specimens (×40, scale bar 500 μm; ×100, scale bar 200 μm). (C) For quantitative analysis of the results of immunohistochemistry, the average optical density was calculated as IOD/total area. (D) The mRNA expression of ECM metabolic-related proteins was determined using quantitative real-time PCR. (*P<0.05, **P<0.01, compared with the control group. #P<0.05, ##P<0.01, compared with the TNBS model group)

2.3 二十碳五烯酸抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化并減少膠原沉積作用優(yōu)于DHA

2.3.1 ω-3 PUFAs抑制腸纖維化小鼠腸上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化存在差異 EMT是指在特定病理、生理以及免疫等因素作用下,具有極性的上皮細(xì)胞失去細(xì)胞特性,細(xì)胞間連接遭到破壞,而獲得間質(zhì)細(xì)胞的表型特征,在形態(tài)學(xué)上發(fā)生由上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變的過(guò)程。表現(xiàn)為上皮細(xì)胞的表面標(biāo)志物例如閉合蛋白(claudins)、咬合蛋白(occludin)、閉合小環(huán)蛋白(zonula occludens-1,ZO1)、E-鈣黏著蛋白(E-cadherin)和細(xì)胞角蛋白(cytokeratin-8、20,CK-8/20)等表達(dá)逐漸減少或者消失,而間質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志物例如波形蛋白(vimentin)、成纖維細(xì)胞特異蛋白1(ferroptosis suppressor protein 1,FSP1)、平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)等逐漸增多。結(jié)果正如Fig.5所示,與空白對(duì)照組相比,TNBS模型組小鼠結(jié)腸中閉合蛋白1、咬合蛋白、閉合小環(huán)蛋白和E-鈣黏著蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯下降(P<0.01);qRT-PCR同樣證實(shí)E-鈣黏著蛋白、細(xì)胞角蛋白-8/20的相對(duì)表達(dá)量低于空白對(duì)照組(P<0.01)。與其相反,TNBS模型組小鼠結(jié)腸中平滑肌肌動(dòng)蛋白、成纖維細(xì)胞特異蛋白1和波形蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.01)。值得注意的是,EPA干預(yù)組能恢復(fù)上皮細(xì)胞緊密連接標(biāo)志蛋白質(zhì)的表達(dá),同時(shí)顯著抑制間質(zhì)細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的表達(dá),但DHA及魚(yú)油干預(yù)效果不明顯。我們推測(cè),EPA干預(yù)可拮抗TNBS破壞小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白質(zhì)的表達(dá),增強(qiáng)腸纖維化小鼠腸黏膜機(jī)械屏障功能,防止腸上皮細(xì)胞脫離上皮層聚集到間質(zhì)組織中轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞,進(jìn)而抑制EMT的發(fā)生。

2.3.2 ω-3 PUFAs抑制EMT并減少膠原沉積存在差異 自噬是一種高度保守的分解代謝過(guò)程,它在細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用,也是EMT過(guò)程的重要調(diào)節(jié)因子。結(jié)果正如Fig.5所示,TNBS模型組小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白質(zhì)p62和LC3表達(dá)量均顯著低于空白對(duì)照組(P<0.01),提示自噬活性降低,DHA和魚(yú)油干預(yù)組也明顯下調(diào),兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;EPA干預(yù)組p62和LC3表達(dá)量有所上調(diào),與空白對(duì)照組接近。由此可見(jiàn),EPA干預(yù)能有效緩解腸纖維化小鼠結(jié)腸自噬活性,恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡。mTOR是自噬的主要負(fù)調(diào)節(jié)器,通過(guò)抑制ULK1(Unc-51-like kinase 1)來(lái)抑制自噬過(guò)程;然而,AMP依賴(lài)的蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK)是自噬的主要正調(diào)節(jié)器,其激活有助于促進(jìn)細(xì)胞的自噬作用。相較于空白對(duì)照組,TNBS模型組小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞中mTOR表達(dá)水平明顯升高(P<0.01),而p-AMPK和ULK1表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.01)。相較于TNBS模型組,EPA干預(yù)組增強(qiáng)了p-AMPK和ULK1的表達(dá)量,下調(diào)了mTOR的表達(dá)量,與空白對(duì)照組接近;值得注意的是,DHA和魚(yú)油干預(yù)組中p-AMPK和ULK1表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.01),其中DHA干預(yù)組下調(diào)更明顯,而mTOR的表達(dá)量則相反,與TNBS模型組接近。

EMT的啟動(dòng)受多種EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(EMT-associated transcription factor,EMT-TF)例如Snail2、Slug和Twist的調(diào)控。相較于空白對(duì)照組,TNBS模型組小鼠結(jié)腸組織中Snail2、Twist表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.01);這與ECM沉積關(guān)鍵標(biāo)志蛋白纖連蛋白(fibronectin)、膠原蛋白Ⅰ(collagenⅠ)和膠原蛋白Ⅲ(collagen Ⅲ)的表達(dá)結(jié)果相一致(Fig.5A)。與其相反,EPA干預(yù)組能有效減少小鼠結(jié)腸黏膜中Snail2、Twist、纖連蛋白、膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅲ的表達(dá)水平,而DHA和魚(yú)油干預(yù)組則與模型對(duì)照組無(wú)差異。以上結(jié)果表明,EPA干預(yù)可抑制腸上皮細(xì)胞EMT,進(jìn)而緩解腸纖維化小鼠結(jié)腸ECM沉積,而自噬途徑對(duì)p62/snail2信號(hào)通路的抑制可能參與其中。

3 討論

目前對(duì)腸纖維化的機(jī)制研究有了更深入了解,但針對(duì)腸道狹窄的治療方法有限,導(dǎo)致大部分患者需要進(jìn)行內(nèi)窺鏡干預(yù)甚至外科手術(shù),然而應(yīng)用這些治療方法后的疾病復(fù)發(fā)率較高[1, 12]。針對(duì)IBD的抗炎療法并不能預(yù)防、減輕或逆轉(zhuǎn)腸纖維化[3]。新近研究指出,慢性炎癥可能是啟動(dòng)纖維化過(guò)程的必要條件,并在調(diào)節(jié)腸纖維化進(jìn)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[13]。因此,尋求有效減輕腸纖維化的替代防治策略成為臨床的未滿足需求。本研究發(fā)現(xiàn):(1)EPA在小鼠體內(nèi)對(duì)TNBS誘導(dǎo)的腸纖維化具有顯著的保護(hù)作用,其效果優(yōu)于DHA和魚(yú)油干預(yù)。這一效果與EPA有效的抗炎和抗纖維化作用密切相關(guān)。(2)EPA干預(yù)能恢復(fù)腸纖維化小鼠Th17/Treg平衡,促進(jìn)腸道免疫穩(wěn)態(tài)。(3)EPA干預(yù)通過(guò)抑制腸上皮細(xì)胞EMT,調(diào)節(jié)TIMPs/MMPs平衡,進(jìn)而緩解腸纖維化小鼠結(jié)腸ECM沉積,而自噬途徑對(duì)p62/snail2信號(hào)通路的抑制可能參與其中。

慢性炎癥是腸纖維化進(jìn)程中的強(qiáng)烈激活因子[14]。在多種促炎因子的長(zhǎng)期誘導(dǎo)下,間充質(zhì)細(xì)胞增多,ECM沉積加劇纖維化。課題組之前的研究發(fā)現(xiàn),EPA在結(jié)腸炎小鼠中具有抗炎和保護(hù)腸道黏膜屏障的作用。相較于低劑量(100 mg/kg·bw)或高劑量DHA(400 mg/kg·bw)干預(yù),高劑量EPA(400 mg/kg·bw)干預(yù)能夠更有效地緩解葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠,表現(xiàn)為提高結(jié)腸組織中EPA含量,降低AA水平,顯著降低促炎因子IFN-γ、TNF-α和IL-6的表達(dá)水平,增加抗炎細(xì)胞因子IL-10水平[8]。目前認(rèn)為,Th1和Th17細(xì)胞在腸道炎癥期間參與纖維化進(jìn)程,主要?dú)w因于它們產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子[15]。更多證據(jù)表明,IL17誘導(dǎo)上皮細(xì)胞發(fā)生EMT,并對(duì)成纖維細(xì)胞和結(jié)腸肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生多種促炎作用[16]。報(bào)道顯示,抗IL-17A抗體通過(guò)抑制EMT進(jìn)而抑制腸道纖維化的發(fā)展[17]。此外,IL-17A敲除小鼠在炎癥皮膚模型中表現(xiàn)出抗纖維化作用[18]。本研究發(fā)現(xiàn),TNBS顯著增加結(jié)腸中Th17細(xì)胞分化,同時(shí)抑制Treg細(xì)胞分化,可能導(dǎo)致免疫反應(yīng)增強(qiáng)。與DHA和魚(yú)油干預(yù)組相比,EPA干預(yù)顯著下調(diào)腸纖維化小鼠血清和組織中IL-6和IL-17的表達(dá)水平,同時(shí)增加Treg細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)。因此,本文認(rèn)為EPA協(xié)同調(diào)控Th17和Treg有助于改善腸道免疫微環(huán)境,進(jìn)而緩解腸道纖維化。

已有充足的證據(jù)表明,存在與炎癥無(wú)關(guān)的腸道纖維化機(jī)制。即使去除炎癥刺激并采取抗腫瘤壞死因子治療等措施,腸道纖維化仍可能發(fā)生[19]。提示腸纖維化也是一個(gè)主動(dòng)的、自我維持的過(guò)程,而非完全被動(dòng)。腸纖維化以ECM沉積為特征,ECM由活化的腸間充質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生,包括肌成纖維細(xì)胞(myofibroblasts)、成纖維細(xì)胞(fibroblasts)和平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cells)。所有產(chǎn)生腸道內(nèi)ECM的細(xì)胞之間具有協(xié)同作用,并受多種分子介質(zhì)調(diào)控,其中TGF-β是最有效的介質(zhì)。本研究中發(fā)現(xiàn),EPA干預(yù)能有效抑制腸纖維化小鼠中TGF-β、IGF和α-SMA等促纖維化介質(zhì)的表達(dá),從而阻止腸纖維化。由于MMPs活性降低和/或TIMPs表達(dá)增加可能導(dǎo)致ECM過(guò)度沉積,進(jìn)而導(dǎo)致IBD的纖維化。本研究利用qRT-PCR和Western免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在TNBS誘導(dǎo)的腸纖維化小鼠模型中,相較于DHA和魚(yú)油干預(yù)組,EPA干預(yù)能有效上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平,使TIMP-1表達(dá)下調(diào)。隨著正常腸組織被ECM蛋白所取代,ECM的過(guò)量積聚是腸纖維化的重要病理特征。ECM的成分包括膠原蛋白、彈性蛋白和纖維連接蛋白。本研究顯示,EPA干預(yù)通過(guò)降低小鼠結(jié)腸黏膜中Col1a2和Col3a1的表達(dá)量進(jìn)而減輕ECM積聚作用。

間充質(zhì)樣細(xì)胞的局部增加也是腸纖維化的重要特征。膠原合成由活化的成纖維細(xì)胞驅(qū)動(dòng),這些細(xì)胞存在于所有正常組織和器官的間質(zhì)中,是纖維形成的主要介質(zhì)。除了常駐成纖維細(xì)胞外,還可以通過(guò)EMT將上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為活化的成纖維細(xì)胞,成纖維細(xì)胞的局部增加促進(jìn)了纖維化進(jìn)程。在EMT過(guò)程中,上皮細(xì)胞失去了其上皮特性,例如極性和黏附性,且降低了上皮標(biāo)志物的表達(dá),如E-鈣黏著蛋白和細(xì)胞角蛋白-8/20。隨后,這些細(xì)胞獲得間質(zhì)表型,包括梭形細(xì)胞形態(tài)、可塑性、運(yùn)動(dòng)性、ECM產(chǎn)生能力同時(shí)間標(biāo)志物表達(dá)增加,如N-鈣黏著蛋白、波形蛋白、FSP1和α-SMA。Scharl等人[20]證實(shí)了EMT在IBD相關(guān)腸纖維化發(fā)病機(jī)制中的作用。考慮到EMT過(guò)程可能是可逆的,抑制局部間質(zhì)樣細(xì)胞的增加,可能成為治療腸纖維化的潛在有效策略。本研究證實(shí),相較于DHA和魚(yú)油干預(yù),EPA能更有效上調(diào)E-鈣黏著蛋白表達(dá),降低N-鈣黏著蛋白和波形蛋白水平,恢復(fù)腸上皮細(xì)胞表型。本文推測(cè),EPA干預(yù)可能恢復(fù)TNBS模型鼠中結(jié)腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá),增強(qiáng)腸纖維化小鼠的腸黏膜機(jī)械屏障,防止腸上皮細(xì)胞從上皮層脫離并聚集到間質(zhì)組織中轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞,從而抑制EMT。

自噬體的形成由ULK1復(fù)合體和Beclin1復(fù)合體共同啟動(dòng),而后由LC3進(jìn)一步加工延伸。貨物受體p62將自噬靶點(diǎn)招募到自噬體中,最終與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體,降解細(xì)胞內(nèi)容物[21]。研究顯示,mTOR通過(guò)抑制ULK1復(fù)合物的活性作為自噬起始的主要抑制劑[22];而AMPK是自噬的主要正調(diào)節(jié)器,通過(guò)激活ULK1復(fù)合物促進(jìn)細(xì)胞自噬。自噬與EMT之間存在相互作用,它們共同促進(jìn)腸纖維化。Snail與Twist作為重要的EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子[23],激活自噬途徑可以下調(diào)Snail與Twist的表達(dá),進(jìn)而抑制EMT進(jìn)程[24]。本研究發(fā)現(xiàn),相較于DHA和魚(yú)油干預(yù),EPA干預(yù)對(duì)自噬通路激活有積極作用,可上調(diào)ULK1、LC3和p62的表達(dá)量;同時(shí),EPA通過(guò)激活A(yù)MPK磷酸化和抑制mTOR表達(dá),活化ULK1,促發(fā)自噬通路。相反,EPA干預(yù)組能顯著降低小鼠結(jié)腸黏膜中Snail2、Twist、纖連蛋白、膠原蛋白 I和膠原蛋白III的表達(dá)水平,而DHA和魚(yú)油干預(yù)組與模型對(duì)照組無(wú)差異。根據(jù)以上結(jié)果本文推測(cè),EPA干預(yù)可能通過(guò)促進(jìn)自噬途徑抑制p62/snail2信號(hào)通路介導(dǎo)上皮細(xì)胞的EMT,從而緩解腸纖維化小鼠腸道ECM的沉積。在一項(xiàng)利用異位移植模型進(jìn)行的腸纖維化研究中,植入的結(jié)腸組織在7 d后表現(xiàn)出自噬缺陷和膠原沉積[25],而誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞發(fā)生自噬途徑則顯著降低膠原蛋白質(zhì)表達(dá)水平[25]。此外,在自噬抑制劑處理的小鼠的結(jié)腸組織中,發(fā)現(xiàn)促炎介質(zhì)的表達(dá)增加和促腸纖維化的CD16+-M2巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)[26]。同時(shí),也有研究發(fā)現(xiàn),刺激自噬途徑會(huì)阻礙EMT,從而減輕DSS誘導(dǎo)的腸道纖維化[27];誘導(dǎo)自噬可抑制與TNBS慢性結(jié)腸炎相關(guān)的腸纖維化[26]。在其他器官的纖維化研究中也有相關(guān)報(bào)道:抑制自噬能介導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞的p62/SQSMT1-NF-κB-Snail2通路導(dǎo)致EMT,并通過(guò)旁分泌信號(hào)促進(jìn)局部肌成纖維細(xì)胞分化[28]。肺泡上皮細(xì)胞中mTOR的過(guò)度激活和肺中受損的自噬參與了肺纖維化的發(fā)病機(jī)制[29]。然而,新近的研究顯示,對(duì)于DSS誘導(dǎo)的腸纖維化模型,抑制自噬通路可以阻止成纖維細(xì)胞的活化并抑制ECM分泌,從而緩解與UC相關(guān)的腸纖維化,而在CCD-18Co腸纖維化細(xì)胞的人原代結(jié)腸成纖維細(xì)胞中,抑制自噬通路能有效阻止腸成纖維細(xì)胞的活化[30]。由此可見(jiàn),自噬在IBD相關(guān)腸纖維化發(fā)展中的作用是復(fù)雜且有爭(zhēng)議的,自噬的上調(diào)和下調(diào)都被認(rèn)為與腸纖維化的進(jìn)展有關(guān),本研究推測(cè),EPA可能促進(jìn)自噬途徑進(jìn)而有效緩解腸纖維化。

以上研究提示,EPA和DHA差異性地抑制上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和減少膠原沉積,緩解腸道炎癥和纖維化,而自噬途徑可能在抑制EMT中發(fā)揮作用。EPA有望成為防治腸纖維化的新型食源性候選物質(zhì),但腸纖維化的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,EPA通過(guò)調(diào)控自噬緩解腸纖維化的具體分子機(jī)制亟待進(jìn)一步闡明。