劉 東 李 真 王保慶 王自全 王丙武 李慶妍

肺癌是男性和女性癌癥死亡的主要原因,占全球所有癌癥死亡人數(shù)的1/3,中國肺癌發(fā)生率和病死率也是居高不下。非小細(xì)胞肺癌(non small-cell lung cancer, NSCLC)占肺癌病例的80%以上,其5年生存率低至約18%[1]。而肺癌病死率和預(yù)后差的主要原因與肺癌發(fā)生的生物學(xué)機制有關(guān),且個體差異較大。EGFR突變是非小細(xì)胞肺癌發(fā)生的驅(qū)動基因之一,IPASS研究表明針對EGFR驅(qū)動基因陽性肺癌的患者使用吉非替尼,總體治療有效率可達(dá)71.2%,但仍有部分患者無效,可能與合并其他基因突變、擴(kuò)增和其他未知機制有關(guān),表明了肺癌靶向治療的異質(zhì)性[2]。

近年來不涉及DNA序列的表觀遺傳學(xué)改變,參與了肺癌的發(fā)生、發(fā)展,成為肺癌研究熱點[3]。有研究表明EGFR蛋白低表達(dá)合并EGFR高甲基化的非小細(xì)胞肺癌患者對EGFR靶向治療不敏感[4,5]。但EGFR驅(qū)動基因陽性肺癌的發(fā)生是否合并EGFR啟動子CpG島甲基化狀態(tài)目前存在爭議,且與肺癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的差異性甲基化CpG位點的研究目前尚未見報道[6～8]。MALDI-TOF MS技術(shù)是近年來的新興的甲基化檢測技術(shù),可實現(xiàn)DNA甲基化的定性、定量、定位分析,本研究利用MALDI-TOF MS技術(shù)檢測EGFR驅(qū)動基因陽性肺癌患者的EGFR基因CpG島內(nèi)甲基化位點狀態(tài),篩選肺癌發(fā)生的差異性甲基化CpG位點,探討其與臨床病理特征、EGFR突變亞型之間的關(guān)系,為驅(qū)動基因陽性肺癌發(fā)病機制、預(yù)后預(yù)測及靶向治療提供新的理論依據(jù)。

材料與方法

1.材料:隨機收集徐州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院2021年1月～2022年11月收治的32例肺腺癌患者,均經(jīng)肺穿刺活檢或手術(shù)切除,病理證實均為肺腺癌,EGFR 19del患者17例,EGFR 21 L858R患者15例,3個月內(nèi)未經(jīng)放化療。其中男性14例,女性18例,患者年齡范圍51～82歲,中位年齡63歲。以24例正常體檢健康人群作為正常對照組,肺癌患者及正常對照組均空腹采集外周靜脈血3ml,-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩１菊n題實施前所有研究對象均知曉并簽署知情同意書,并經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)后實施{倫理學(xué)審批號:[2020]121301}。

2.外周血DNA提取:采集肺癌患者及正常體檢人群外周血,運用DNA提取試劑盒(BioTeKe Corpration)提取DNA,具體操作嚴(yán)格按照試劑盒操作說明。運用Nanodrop ND-1000紫外分光光度儀檢測DNA濃度和純度進(jìn)行質(zhì)量鑒定,確保純度(A260/A280)為1.5～2.2,濃度>50ng/μl,-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.EGFR基因甲基化引物設(shè)計:查詢EGFR基因序列,位于7號染色體,位置:55014017～55020016(數(shù)據(jù)來源:NCBI,GRCh38.p13版本),選擇距離轉(zhuǎn)錄起始位點-5000bp～1000bp范圍為靶向區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計,利用CpG島在線預(yù)測網(wǎng)站,預(yù)測序列潛在的CpG島,發(fā)現(xiàn)1個CpG島。采用Agena EpiDesigner程序?qū)Π邢蛐蛄羞M(jìn)行引物方案設(shè)計。綜上因素評估,選擇#29和#30引物進(jìn)行擴(kuò)增,詳見圖1,具體引物信息詳見表1。

表1 EGFR#29、EGFR#30PCR擴(kuò)增引物信息

圖1 EGFR基因CpG島靶向區(qū)域引物設(shè)計

3.MALDI-TOF MS技術(shù)進(jìn)行DNA甲基化定量檢測分析:MALDI-TOF MS技術(shù)基于MassARRAY系統(tǒng)平臺,是一種新型高通量甲基化定量檢測方法,可完成特定位置甲基化位點的定量、定性、定位的高通量甲基化檢測。提取后達(dá)標(biāo)的DNA嚴(yán)格按照EZ-96 DNA甲基化試劑盒(Zymo Research)亞硫酸氫鹽處理流程和美國Sequenom公司的推薦方式操作。經(jīng)PCR擴(kuò)增,蝦堿性磷酸酶處理PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(SAP)、體外轉(zhuǎn)錄及T裂解、樹脂樣本純化,由MassARRAY Nanodispenser 點樣機(美國Agena公司)進(jìn)行384-well SpectroCHIP?bioarray芯片(美國Agena公司)點樣,Massy array質(zhì)譜儀(美國Agena公司)進(jìn)行質(zhì)譜檢測得出質(zhì)譜圖,最后經(jīng)MassARRAY EpiTYPERTM軟件(美國Agena公司)分析質(zhì)譜圖從而得出所檢測基因具體CpG位點的甲基化數(shù)據(jù),具體檢測步驟嚴(yán)格按照制造商的說明操作。

圖2 EGFR#29、EGFR#30PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

4.統(tǒng)計學(xué)方法:應(yīng)用GraphPad 8.0及SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。GraphPad 8.0繪制肺癌患者及正常對照組外周血中EGFR位點甲基化比較直方圖;EGFR甲基化位點在肺癌與正常對照組之間的比較采用Mann-WhitneyU檢驗分析;EGFR甲基化與臨床資料、EGFR突變亞型組間或多組間的比較采用Mann-Whitney檢驗和Kruskal-Wallis檢驗分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.DNA質(zhì)量鑒定結(jié)果及EGFR甲基化PCR擴(kuò)增結(jié)果:對肺癌及正常對照組外周血提取DNA運用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行完整性檢測。濃度和純度達(dá)標(biāo)的DNA用于亞硫酸氫鹽修飾,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,在目的區(qū)域出現(xiàn)擴(kuò)增片段詳見圖2。

2.EpiTYPER 軟件甲基化分析結(jié)果:運用EpiTYPER甲基化分析軟件分析樣本質(zhì)譜圖,顯示EGFR#29擴(kuò)增子包含20個CpG位點,T裂解為15個CpG單位,包含20個CpG位點,覆蓋率為100%(20/20)。EGFR#30擴(kuò)增子中包含47個CpG位點,T裂解為23個CpG單位,其中2個單位(包含8個CpG位點)即CpG_30.31.32.33和CpG_34.35.36.37不可被分析,因此21個CpG單位可分析,實際包含39個CpG位點,覆蓋率達(dá)83.0%(39/47)。EGFR#29和EGFR#30部分位點甲基化水平詳見圖3。

圖3 EGFR#29(A)、EGFR#30(B) CpG位點甲基化情況

3.EGFR甲基化在肺癌與正常對照組中平均甲基化率對比:比較肺癌及正常對照患者外周血中EGFR CpG位點甲基化差異,詳見圖4。EGFR#29 15個CpG位點中除了4個位點CpG_3、CpG_7、8,CpG_10,CpG_20,11個CpG位點在肺癌組中甲基化率均低于正常對照組,其中EGFR#29 CpG_2在肺癌平均甲基化率(25.7%±2.1%)低于正常對照組(36.5%±4.6%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而EGFR#30 21個可分析CpG單位中有11個在肺癌組中甲基化率均低于正常對照組,其中CpG_8.9.10.11、CpG_25、CpG_40.41.42在肺癌組中甲基化率(4.6%±0.4%、2.8%±0.7%、4.4%±0.4%)低于正常對照組(6.0%±0.6%、4.8%±0.9%、7.1%±0.4%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 肺癌患者及正常對照組外周血中EGFR#29(A)、EGFR#30(B)CpG平均甲基化率比較Mann-Whitney U檢驗分析與正常組比較,*P<0.05

4.EGFR甲基化與肺癌患者臨床病理特征、EGFR突變亞型的關(guān)系:本研究將EGFR差異性甲基化CpG單位與肺癌臨床特征等進(jìn)行相關(guān)性分析,詳見表2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGFR#29 CpG_2,EGFR#30 CpG_8.9.10.11、CpG_25、CpG_40.41.42甲基化與肺癌患者患者年齡、分化程度、發(fā)病位置、TNM分期均無相關(guān)性(P>0.05)。在性別比較中發(fā)現(xiàn),4個CpG位點在女性肺癌組較男性呈低甲基化狀態(tài),其中EGFR#30 CpG_2在性別組中比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在吸煙史對比中,2個CpG位點CpG_8.9.10.11、CpG_25、CpG_40.41.42在吸煙組肺癌患者中呈甲基化率升高趨勢,其中CpG_25在兩組中的甲基化差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而EGFR#30 CpG_8.9.10.11在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中甲基化水平要低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.01)。在EGFR甲基化與EGFR突變類型的相關(guān)性分析研究中,4個CpG位點在EGFR 19del和21 L858突變組中的甲基化比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 EGFR 差異性甲基化CpG單位與肺癌臨床病理特征、EGFR突變亞型的關(guān)系

討 論

肺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素參與的過程,可能包括環(huán)境因素、遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)共同作用的結(jié)果。而肺癌的異質(zhì)性在一定程度上決定了肺癌患者的治療療效和預(yù)后[9]。隨著基因檢測技術(shù)的進(jìn)步,肺癌中EGFR 驅(qū)動基因的發(fā)現(xiàn),針對EGFR靶點的精準(zhǔn)治療使得非小細(xì)胞肺癌治療有效率明顯提高,提高了患者生存期[10]。EGFR 酪氨酸激酶抑制劑奧希替尼的應(yīng)用目前已成為 EGFR突變的晚期或可切除NSCLC患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法,但即使這樣,仍然有部分患者治療無效,預(yù)后差,推測可能合并其他突變或新的機制。不涉及DNA序列變化的表觀遺傳學(xué)改變,近年來成為肺癌研究的熱點,且與肺癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[11～16]。而目前關(guān)于EGFR驅(qū)動基因陽性是否合并表觀遺傳學(xué)的改變,國內(nèi)外也進(jìn)行了一系列探討,但目前仍存在爭議[6～8]。

MALDI-TOF MS技術(shù)可檢測全基因組甲基化水平和特定CpG位點的甲基化,實現(xiàn)了甲基化定性、定量及定位的檢測。它比亞硫酸氫鹽測序PCR能更有效地反映低甲基化區(qū)域的真實甲基化水平,可以檢測到低至5%的甲基化水平[17]。因此,課題組利用MALDI-TOF MS技術(shù)檢測驅(qū)動基因陽性肺癌患者及正常對照組外周血中EGFR基因甲基化狀態(tài)。研究選取了EGFR基因CpG島的兩個擴(kuò)增區(qū)域,檢測后發(fā)現(xiàn)EGFR基因在驅(qū)動基因肺癌患者較正常健康對照組中存在差異,且在肺癌中呈現(xiàn)廣泛低甲基化狀態(tài),這與既往的研究一致,并篩選出4個差異性甲基化CpG單位EGFR#29 CpG_2,EGFR#30 CpG_8.9.10.11、CpG_25、CpG_40.41.42[7,8]。推測在EGFR驅(qū)動基因陽性肺癌發(fā)生機制中,DNA低甲基化可能使得原癌基因EGFR激活參與肺癌的發(fā)生,且EGFR突變合并EGFR低甲基化改變可能在局晚期及晚期肺癌發(fā)生中存在協(xié)同效應(yīng)。

Hu等[18]研究表明,在大多數(shù)肺腺癌早期癌癥進(jìn)展期,DNA遺傳學(xué)改變以及DNA甲基化的變化也可能同時發(fā)生。但EGFR突變與EGFR甲基化在肺腺癌進(jìn)展演變過程中存在何種協(xié)同表達(dá)模式,目前仍無定論。而強少盈等[6]研究出現(xiàn)相反的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)在EGFR-TKI敏感突變的11例肺癌患者中未見檢測到甲基化,而在無EGFR-TKI敏感突變的29例肺癌患者甲基化率為34.5%,究其原因可能與甲基化檢測的方法不同有關(guān)。探討差異性甲基化CpG位點與EGFR驅(qū)動基因陽性肺癌患者臨床特征的相關(guān)性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGFR甲基化與肺癌患者患者年齡、分化程度、發(fā)病位置、TNM分期均無明顯相關(guān)性。而EGFR 4個CpG單位在女性肺癌患者中呈現(xiàn)更低的甲基化,其中EGFR#30 CpG_25的差異更明顯。EGFR4個CpG單位中有3個在吸煙組肺癌患者中呈甲基化率升高趨勢,其中CpG_25甲基化差異更為明顯,推測長期吸煙的患者可能使得EGFR CpG位點發(fā)生甲基化改變,這與既往的研究結(jié)果大致一致,細(xì)胞長期暴露于香煙煙霧會導(dǎo)致進(jìn)行性表觀遺傳變化參與肺癌的發(fā)生,并已篩選出部分與肺癌患者吸煙相關(guān)的甲基化CpG位點作為肺癌發(fā)生風(fēng)險的預(yù)測因子,但這與Li得出的研究結(jié)果不同,究其原因可能與檢測方法及CpG島擴(kuò)增區(qū)域不同有關(guān)[19～21]。

在淋巴轉(zhuǎn)移比較中發(fā)現(xiàn),EGFR#30 CpG_8.9.10.11在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的甲基化水平要明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,提示出現(xiàn)EGFR#30 CpG_8.9.10.11低甲基化的肺癌患者更容易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,并可能作為預(yù)后預(yù)測的分子標(biāo)志物。作為一種重要的化學(xué)修飾,DNA甲基化狀態(tài)可能和染色體不穩(wěn)定性增加以及癌癥突變率有關(guān)[18,19]。有研究表明,DAPL1基因的高甲基化可能與非小細(xì)胞肺癌19外顯子缺失突變亞型有關(guān)。而EGFR CpG位點甲基化與EGFR突變亞型是否存在相關(guān)性未見報道。本研究也進(jìn)行了探討,發(fā)現(xiàn)在EGFR 19del和21 L858突變組中EGFR位點存在不同程度的甲基化,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

本研究通過MALDI-TOF MS技術(shù)檢測驅(qū)動基因陽性肺腺癌患者及正常人群外周血中EGFR CpG島甲基化狀態(tài),發(fā)現(xiàn)肺腺癌患者在發(fā)生EGFR突變的同時合并了EGFR的低甲基化改變,推測EGFR低甲基化改變與EGFR突變在晚期肺癌發(fā)生中可能存在協(xié)同效應(yīng),并篩選出與驅(qū)動基因陽性肺癌患者發(fā)生顯著相關(guān)的差異性甲基化CpG位點,因此,通過肺癌患者外周血檢測可能作為肺癌診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。同時本研究還篩選出與性別、吸煙以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)的CpG位點,可能作為肺癌患者發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后預(yù)測的重要分子標(biāo)志物。限于樣本量較少,結(jié)果可能存在一定局限性,仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究,而精準(zhǔn)篩選與EGFR表達(dá)密切相關(guān)的差異性甲基化CpG位點也是課題組后續(xù)的研究方向。DNA甲基化是可逆的過程,針對驅(qū)動基因陽性肺癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的特異性甲基化CpG位點進(jìn)行去甲基化藥物干預(yù),可能為肺癌的靶向治療和聯(lián)合治療提供了新的思路。