曹家興 張 旺 劉九洋 吳高松

乳腺癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,也是女性癌性死亡的主要原因[1]。GLOBOCAN 2020年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,全球女性乳腺癌新發(fā)病例為226萬(wàn)例,死亡病例為68萬(wàn)例,分別占女性癌癥新發(fā)和死亡病例的24.5%和15.5%[2]。乳腺癌是一種高度異質(zhì)性疾病,基于分子表達(dá)差異可將其分為管腔上皮A型(Luminal A)、管腔上皮B型(Luminal B)、生長(zhǎng)因子受體(HER-2)過(guò)表達(dá)型(HER-2 enriched)、基底型(basal-like breast cancer, BLBC)和正常乳腺樣型(normal-like)5種類(lèi)型[3]。其中BLBC約占乳腺癌的15%,且具有發(fā)病年齡低、進(jìn)展快、易轉(zhuǎn)移和預(yù)后差的特點(diǎn)[4]。此外,BLBC多表達(dá)基底細(xì)胞角蛋白CK5/17,而激素受體(hormone receptor,HR)、HER-2表達(dá)較低,故對(duì)內(nèi)分泌治療、HER-2靶向治療反應(yīng)較差[4, 5]。因此,探索BLBC核心基因?qū)斫饽[瘤進(jìn)展、尋找新的治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。

加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(weighted correlation network analysis, WGCNA)是一種尋找高度相關(guān)的基因模塊并將模塊與性狀關(guān)聯(lián)的生物學(xué)方法,已廣泛用于篩選核心基因和治療靶點(diǎn)[6]。腫瘤免疫浸潤(rùn)數(shù)據(jù)庫(kù)TIMER2.0基于6種算法探索基因表達(dá)與免疫浸潤(rùn)的關(guān)系,為探索腫瘤免疫浸潤(rùn)提供了新思路[7]?；贕SE78958構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),篩選出在BLBC高表達(dá)并與生存相關(guān)的核心基因[8]。此外,利用多種生信工具分析了核心基因表達(dá)和免疫浸潤(rùn)、免疫檢查點(diǎn)的相關(guān)性。探索BLBC預(yù)后相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物并分析其潛在機(jī)制將有助于靶向藥物的開(kāi)發(fā)及提高患者的生存時(shí)間。

材料與方法

1.數(shù)據(jù)獲取與處理:首先,從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(gene expression omnibus, GEO)下載GSE78958芯片數(shù)據(jù),GSE78958由GPL571 [HG-U133A_2] Affymetrix Human Genome U133A 2.0 Array測(cè)序完成。然后對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行基因注釋以獲得基因表達(dá)譜。最后,根據(jù)基因表達(dá)差異按照標(biāo)準(zhǔn)差從大到小排序,并提取樣本中差異最大的前50%基因進(jìn)行下一步分析。

2.加權(quán)基因共表達(dá)分析:利用Sangerbox在線網(wǎng)站中的“WGCNA”工具剔除離群基因和樣本并構(gòu)建無(wú)尺度共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),高度協(xié)同的基因被劃分為同一模塊[9]。然后將各個(gè)模塊與乳腺癌分型相關(guān)聯(lián)。選擇與BLBC相關(guān)性強(qiáng)的模塊繼續(xù)分析。

3.模塊基因功能富集分析:用R軟件包“clusterProfiler(version 3.14.3)”探索黑色模塊基因的生物學(xué)功能和信號(hào)通路。具體而言,設(shè)置P<0.01,并利用R包“ggplot 2”進(jìn)一步篩選出前10個(gè)結(jié)果并對(duì)其進(jìn)行可視化。

4.PPI網(wǎng)絡(luò)分析和核心基因的識(shí)別:為了進(jìn)一步篩選核心基因,將黑色模塊基因上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)用于構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)[10]。然后,將評(píng)分(0.4的差異基因納入Cytoscape(v3.9.1)軟件進(jìn)行分析,利用插件cytohubba基于度算法提取黑色模塊中差異最大的10%基因[11]。根據(jù)cytohubba分析結(jié)果,黑色模塊中共80個(gè)基因作為候選基因繼續(xù)分析。接下來(lái),利用bc-GenExMiner對(duì)候選基因進(jìn)行生存分析和表達(dá)分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[12]。

5.免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析:TIMER2.0免疫相關(guān)模塊可探究BLBC乳腺癌核心基因表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性?！澳[瘤純度”是該分析中的主要混雜因素。由于大多數(shù)免疫細(xì)胞類(lèi)型與腫瘤純度呈負(fù)相關(guān),研究選擇了“純度調(diào)整”選項(xiàng),該選項(xiàng)使用Spearman偏相關(guān)性檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

6.腫瘤免疫相關(guān)分析:腫瘤和免疫系統(tǒng)相互作用在癌癥的發(fā)生、發(fā)展和治療中起著至關(guān)重要的作用。TISIDB是腫瘤免疫系統(tǒng)相互作用的集成儲(chǔ)存庫(kù)門(mén)戶,可探索中樞基因表達(dá)和免疫抑制劑、免疫刺激劑和MHC分子及趨化因子之間的相關(guān)性[13]。

7.構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子-核心基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò):為了探索調(diào)節(jié)中樞基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor, TF)并揭示它們的調(diào)節(jié)關(guān)系,借助Cytoscape插件iRegulon預(yù)測(cè)核心基因上游TF并構(gòu)建基于核心基因和TF的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

結(jié) 果

1.共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和模塊的識(shí)別:對(duì)GSE78958進(jìn)行基因注釋后,獲得424例乳腺癌患者表達(dá)數(shù)據(jù)和分子分型信息,其中Luminal A 226例,Luminal B 43例,Her-2過(guò)表達(dá)50例,BLBC 99例,normal-like 6例。提取方差較大的前50%(6717)基因進(jìn)行WGCNA。通過(guò)平均連鎖聚類(lèi)將具有相似表達(dá)模式的差異基因劃分為不同的模塊。選擇相關(guān)系數(shù)為0.87時(shí)的軟閾值5,設(shè)置模塊最小基因數(shù)為30,合并閾值為0.5。最終確定了14個(gè)模塊,其中灰色模塊是無(wú)法分配給任何的模塊基因集合。通過(guò)計(jì)算模塊與乳腺癌亞型的相關(guān)性,結(jié)果顯示黑色模塊與BLBC呈正相關(guān)且相關(guān)性最強(qiáng)(圖1)。因此,選擇黑色模塊作為BLBC的關(guān)鍵模塊進(jìn)行下一步分析。

圖1 加權(quán)基因共表達(dá)分析

2.黑色模塊富集分析:接下來(lái)研究對(duì)黑色模塊基因進(jìn)行GO(gene ontology)富集和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析以探索其生物功能。就GO而言,生物過(guò)程(biological process, BP)主要富集于細(xì)胞周期、細(xì)胞分裂過(guò)程;細(xì)胞成分(cellular component, CC)多富集于染色質(zhì)、微管等區(qū)域,而分子功能(molecular function, MF)主要富集于核苷酸結(jié)合、酶結(jié)合等(圖2中A、B、C)。此外,KEGG通路結(jié)果表明黑色模塊基因通過(guò)細(xì)胞周期和腫瘤通路等發(fā)揮作用(圖2D)。

圖2 黑色模塊基因GO富集分析和KEGG通路分析圖

3.PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心基因的識(shí)別:基于STRING數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape軟件,黑色模塊中總共891個(gè)基因被映射到PPI網(wǎng)絡(luò)中,包括812個(gè)節(jié)點(diǎn)和12050條邊。隨后,使用Cytoscape軟件中的cytohubba插件基于度排序,選擇PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前10%的80個(gè)基因作為候選基因(圖3A)。為了進(jìn)一步縮小范圍并驗(yàn)證研究結(jié)果,使用bc-GenExMiner對(duì)候選基因進(jìn)行生存分析和表達(dá)分析。結(jié)果表明,80個(gè)候選基因中7個(gè)與無(wú)病生存期(disease free survival, DFS)相關(guān),僅ESPL1和CCNB2同時(shí)與BLBC總生存期(overall survival, OS)和DFS相關(guān)(圖3中B～E)。此外,表達(dá)分析表明,ESPL1和CCNB2在BLBC中表達(dá)高于其他分型(圖3中F、G)。研究還發(fā)現(xiàn),兩個(gè)核心基因在BLBC中的表達(dá)水平彼此呈正相關(guān),這表明兩者存在潛在的共同調(diào)劑網(wǎng)絡(luò)(圖3H)。因此,以上結(jié)果表明,ESPL1和CCNB2可作為BLBC的核心基因。

圖3 核心基因的識(shí)別和驗(yàn)證

4.核心基因免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析:為了確定核心基因表達(dá)和腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間是否存在相關(guān)性,通過(guò)TIMER分析了BLBC多種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)水平。在兩個(gè)核心基因的表達(dá)水平和Th2細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞正相關(guān),與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)(圖4)。此外,TISIDB被用于檢測(cè)核心基因和免疫調(diào)節(jié)劑之間相互作用關(guān)系。ESPL1和CCNB2均與趨化因子(CCL7、CCL18、CXCL10)及免疫調(diào)節(jié)劑的表達(dá)呈正相關(guān),包括免疫刺激因子(PVR、ULBP1)及MHC分子(TAP1、TAP2)和免疫抑制因子(LAG3),詳見(jiàn)圖5～圖7。

圖4 兩個(gè)核心基因表達(dá)水平與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)關(guān)系

圖6 乳腺癌中ESPL1的表達(dá)與免疫調(diào)節(jié)劑的關(guān)系

圖7 乳腺癌中CCNB2的表達(dá)與免疫調(diào)節(jié)劑的關(guān)系

5.核心基因上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò):最后,利用Cytoscape插件iRegulon構(gòu)建了基于核心基因和上游TF的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。共有56個(gè)TF參與了ESPL1和CCNB2的調(diào)節(jié)。值得注意的是,其中22個(gè)TF參與兩者的共同調(diào)控。關(guān)注共同TF有助于理解BLBC進(jìn)展中的激活表達(dá)模式(圖8)。

圖8 上游轉(zhuǎn)錄因子與兩個(gè)核心基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

討 論

由于缺乏有效的治療靶點(diǎn),BLBC極易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā),在所有亞型中預(yù)后最差[4, 5, 14]。目前BLBC的治療主要包括手術(shù)和放化療,迫切需要探索新的分子標(biāo)志物和靶向藥物[14]。因此,本研究應(yīng)用WGCNA、TIMER及TISDB等在線網(wǎng)站證實(shí)ESPL1和CCNB2在BLBC中高表達(dá)且與預(yù)后密切相關(guān),并初步探索了兩者共同的潛在作用機(jī)制。

外紡錘體極體1(extra spindle poles-like 1, ESPL1)基因編碼的分離酶可切割姐妹染色體間的粘連蛋白R(shí)AD21促進(jìn)染色體分離,此外,分離酶還參與 DNA損傷修復(fù)和包膜運(yùn)輸過(guò)程[15,16]。ESPL1過(guò)表達(dá)導(dǎo)致基因突變和染色體錯(cuò)誤分裂從而促使惡性腫瘤的發(fā)生[15,17]。近年來(lái)研究顯示,ESPL1與膠質(zhì)瘤、子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后相關(guān)[16,18]。分離酶抑制物Sepins可通過(guò)非競(jìng)爭(zhēng)性的方式抑制分離酶活性以及癌細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞遷移和傷口愈合[19]。

細(xì)胞周期蛋白2(cyclins B2, CCNB2)通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶CDC2的活性調(diào)節(jié)有絲分裂G2/M周期轉(zhuǎn)變[20, 21]。CCNB2高表達(dá)與多種腫瘤的直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期呈顯著正相關(guān)[22]。此前研究證實(shí),CCNB2過(guò)表達(dá)與多種惡性腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)[23～25]。

有研究表明,細(xì)胞周期調(diào)控通路還與代謝重塑和免疫浸潤(rùn)有關(guān)。筆者的分析結(jié)果也提示兩個(gè)核心基因表達(dá)與多種腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)呈正相關(guān),包括Th2細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。此外,兩個(gè)核心基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平均與趨化因子如CCL7、CCL10和CCL18呈正相關(guān),其由腫瘤細(xì)胞分泌并將免疫細(xì)胞募集到腫瘤免疫微環(huán)境。免疫細(xì)胞成分很大程度上決定了微環(huán)境的炎性環(huán)境,并能調(diào)節(jié)腫瘤的進(jìn)展。Th1/Th2比值升高提示著較好的預(yù)后,而Th2細(xì)胞升高與腫瘤轉(zhuǎn)移與較高的病死率有關(guān)[26]。Th2細(xì)胞可分泌IL-4、IL-5和IL-13促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[27]。此外,Th2細(xì)胞還與腫瘤免疫逃逸相關(guān)[28]。相似的,調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory cell,Treg)也可通過(guò)調(diào)節(jié)免疫監(jiān)視并抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[27]。Treg水平升高與乳腺癌腫瘤患者疾病進(jìn)展和生存期縮短有關(guān)[29]?？傊?兩個(gè)核心基因可能通過(guò)BLBC免疫細(xì)胞浸潤(rùn)過(guò)程調(diào)控腫瘤的進(jìn)展及預(yù)后。

上游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析提示22種TF同時(shí)靶向調(diào)節(jié)兩個(gè)核心基因,其中大多數(shù)TF在乳腺癌中高表達(dá)。這些上調(diào)的TF可能通過(guò)激活兩個(gè)核心基因調(diào)控BLBC細(xì)胞周期及免疫反應(yīng)。借助生物信息學(xué),初步證實(shí)ESPL1和CCNB2是BLBC潛在預(yù)后和治療靶點(diǎn)。同時(shí),兩個(gè)基因受共同的上游TF的調(diào)控并與BLBC患者免疫狀態(tài)相關(guān)。