陳 廣 李 彬 文 英 蔣學俊

我國正面臨人口老齡化和代謝危險因素持續(xù)流行的雙重壓力,心血管疾病負擔仍在持續(xù)增加,心肌梗死(myocardial infarction, MI)是導致我國患者死亡的重要原因[1]。除了缺血和缺氧引起的心肌損傷,局部過度炎性反應會加重損傷,促進細胞凋亡和加速細胞外基質(zhì)降解,導致心肌纖維化,負性心室重塑和心力衰竭[2]。鑒于炎癥在MI中重要作用,MI的抗炎治療正日益受研究者們關注。

作為經(jīng)典抗炎藥物,秋水仙堿是從秋水仙的球莖中提取的一種親脂性三環(huán)生物堿,可以阻止有絲分裂紡錘體的形成,阻止微管聚合并抑制關鍵的炎癥信號通路,如炎性小體、促炎性細胞因子以及黏附分子的表達,具有強大的抗炎作用[3]。近年來,隨著臨床試驗COLCOT和LoDoCo2結果的陸續(xù)公布,揭示了秋水仙堿對于急性冠狀動脈綜合征及慢性冠狀動脈疾病患者再發(fā)心血管事件的良好預防作用,激發(fā)了人們對于秋水仙堿在冠心病抗炎治療中的研究熱情[4,5]。然而由于秋水仙堿治療窗窄,不良反應十分常見,超過20%的秋水仙堿使用者可能出現(xiàn)胃腸道反應,包括腹瀉、嘔吐和惡心,以及對肝腎功能的影響,嚴重限制了其臨床上的使用[6,7]。因此,迫切需要尋找一種新的用藥方法,在保證其對冠心病良好獲益的同時提高患者的耐受性。

隨著醫(yī)學技術的迅速發(fā)展及精準醫(yī)療的提出,疾病診療新技術不斷涌現(xiàn)。我國首例經(jīng)導管心內(nèi)膜注射水凝膠治療慢性心力衰竭已于2022年取得圓滿成功[8],使得心肌內(nèi)注射技術進一步走近臨床,為我們提供了一種能夠減輕全身毒性不良反應的全新用藥思路。然而目前秋水仙堿心肌內(nèi)注射在MI的治療中鮮有報道,故本實驗通過比較秋水仙堿心肌內(nèi)注射和常規(guī)口服用藥在大鼠MI模型中的療效及不良反應,探究秋水仙堿心肌內(nèi)注射治療MI的安全性及可行性。

材料與方法

1.實驗動物的準備:研究中的所有動物程序均經(jīng)武漢大學人民醫(yī)院實驗動物福利倫理審查委員會批準(倫理學審批號: WDRM 20211008)。動物使用過程嚴格按照北京大學制定的《動物保護與使用指南》執(zhí)行。由武漢大學人民醫(yī)院實驗動物中心提供40只SPF級雄性Sprague Dawley(SD)大鼠,體質(zhì)量為200±20g,動物合格證編號:00270753。在SPF環(huán)境中適應性飼養(yǎng)1周,給予標準飼料和飲水。

2.動物模型制備和干預流程:SD大鼠隨機分為4組,即假手術組(Sham組,n=10)、MI+0.9%氯化鈉溶液處理組(MI組,n=10)、MI+Col灌胃組(MI+Col/i.g組,n=10)和MI+Col心肌內(nèi)注射組(MI+Col/i.m組,n=10)。大鼠術前12h禁食,稱重后腹腔內(nèi)注射1%戊巴比妥(40mg/kg),前胸部備皮消毒后,切開前頸部皮膚,鈍性分離頸前肌肉暴露氣管,氣管插管后連接小動物呼吸機。切開胸前皮膚組織,暴露肋骨,斷開心前肋骨,利用開胸器撐開胸壁,暴露大鼠心臟,結扎前降支。心前區(qū)迅速變白提示結扎成功。Sham組前降支只穿線不結扎。MI組及MI+Col/i.g組結扎冠脈后即刻在MI大鼠梗死周邊3、6、9、12點鐘方向分別注射15μl 0.9%氯化鈉溶液。MI+Col/i.m組于同樣的位置分別注射15μl秋水仙堿溶液(濃度為2mg/ml),依次縫合各層胸壁,待大鼠蘇醒后撤去呼吸機。MI+Col/i.g組給予秋水仙堿[10μg/(kg·d)]灌胃,剩余3組給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃治療,術后觀察4周,記錄大鼠體質(zhì)量變化及死亡情況。

3.超聲心動圖采集:MI后28天,每組隨機抽取5只大鼠,戊巴比妥麻醉后將其固定于檢測臺上,于胸骨旁左心室短軸和胸骨旁左心室長軸切面觀察,并以乳頭肌水平進行M型超聲心動圖分析。取M型超聲圖像測量以下指標:射血分數(shù)(ejection fraction,EF,%)、短軸縮短率(fraction shortening,FS,%)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at end-systole,LVIDs,cm)、左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at end-diastole,LVIDd,cm)。

4.血清標本處理:心臟超聲圖像采集完畢后,采集大鼠頸靜脈血,置于促凝管,室溫放置30min后離心[3000r/min(離心半徑:10cm)×15min],收集血清,凍存于-80℃。根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒說明書,檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine amino transferase,ALT)、肌酐(creatinine,CREA)、IL-1β及腫瘤壞死因子-α(trmor necrosis facter,TNF-α)水平。

5.心肌病理學檢查:完成上述操作后,腹腔注射過量戊巴比妥鈉注射液安樂死處死大鼠,隨后迅速開胸摘取心臟,4%多聚甲醛固定液固定后,梯度乙醇脫水,石蠟包埋,切片,Masson染色后拍照,使用Image Pro Plus 6.0軟件測量分析,分別測量纖維化面積和心肌細胞面積,計算出纖維化及心肌細胞比率。

結 果

1.秋水仙堿治療對MI后大鼠存活率的影響:大鼠MI術后,觀察28天內(nèi)生存情況,Sham組無死亡大鼠,MI組、MI+Col/i.g組、MI+Col/i.m組分別累計死亡了4、2、2只,3組之間比較差異無統(tǒng)計學意義,但較Sham組生存率明顯下降(P<0.01,圖1)。

圖1 各組大鼠生存率比較

2.秋水仙堿對MI大鼠心功能影響:術后第28天行超聲心動圖檢查結果顯示,與Sham組比較,MI組EF、FS顯著降低(P<0.001),LVIDs、LVIDd顯著升高(P<0.001),提示MI后28天大鼠心臟功能及結構收到嚴重損害。與MI組比較,MI+Col/i.g及MI+Col/i.m組EF、FS顯著升高(P<0.001),MI+Col/i.g組LVIDs較之有所減低(P<0.05),MI+Col/i.m組LVIDs、LVIDd均較之明顯減低(P<0.001、P<0.01),但MI+Col/i.g和MI+Col/i.m兩組之間比較,EF、FS、LVIDs及LVIDd差異均無統(tǒng)計學意義(圖2)。

圖2 各組大鼠超聲心動圖結果

3.秋水仙堿對MI大鼠體質(zhì)量影響:記錄大鼠28天體質(zhì)量增長情況,4組大鼠在28天內(nèi)體質(zhì)量均持續(xù)增長,且體質(zhì)量增長速率由大到小依次為Sham組、MI+Col/i.m組、MI組、MI+Col/i.g組。與Sham組比較,MI、MI+Col/i.g及MI+Col/i.m組體質(zhì)量增長均顯著降低(P<0.001);與MI組比較,MI+Col/i.m組體質(zhì)量增長較快(P<0.05),而MI+Col/i.g組體質(zhì)量增長較慢(P<0.01)。與MI+Col/i.g組比較,MI+Col/i.gm組體質(zhì)量增長更快(P<0.001,圖3)。

圖3 MI后各組大鼠體質(zhì)量變化

4.秋水仙堿對MI大鼠肝、腎功能影響:4組大鼠均未見明顯肝功能受損,與Sham組比較, MI組、MI+Col/i.g及MI+Col/i.m組CREA均顯著升高(P<0.05)。與MI組比較,MI+Col/i.g及MI+Col/i.m組CREA明顯降低,但MI+Col/i.g和MI+Col/i.m組間CREA比較,差異無統(tǒng)計學意義(表1)。

表1 各組大鼠肝、腎功能

5.秋水仙堿對MI大鼠血清炎癥標志物影響:與Sham組比較,MI組、MI+Col/i.及MI+Col/i.m組IL-1β、TNF-α血清濃度均明顯上升(P<0.05);與MI組比較,MI+Col/i.g及MI+Col/i.m組血清IL-1β、TNF-α濃度顯著下降(P<0.05),但MI+Col/i.g和MI+Col/i.m組間比較,差異無統(tǒng)計學意義(表2)。

表2 各組大鼠血清炎癥指標

6.秋水仙堿對MI大鼠心肌結構的影響:光學顯微鏡下閱片,大鼠心臟Masson染色Sham組室壁厚度正常,無明顯室壁變薄及心肌纖維化現(xiàn)象,未見瘢痕組織形成;MI各組梗死壁厚度明顯變薄,可見大量纖維瘢痕形成。高倍鏡下可見,Sham組室壁心肌細胞結構完整,排列規(guī)則,細胞之間無明顯膠原纖維沉積,無瘢痕形成。MI各組梗死區(qū)僅殘存極少量心肌細胞,可見大量膠原纖維沉積。定量分析結果,MI+Col/i.g及MI+Col/i.m組心肌細胞存活數(shù)量較MI組顯著增多(P<0.001),纖維化程度也較MI組明顯減低(P<0.001,圖4)。

圖4 秋水仙堿對MI大鼠心肌結構的影響

討 論

秋水仙堿作為經(jīng)典抗炎藥物,是臨床上治療痛風的一線用藥,近期的一系列研究揭示了其對于MI的心肌保護作用[9]。然而秋水仙堿口服用藥存在治療窗窄及不良反應大的問題,制約了其更好地臨床應用。本研究中通過對大鼠急性心梗模型的實驗研究,設計了秋水仙堿口服及心肌內(nèi)局部注射兩種治療方式,發(fā)現(xiàn)MI組心肌梗死后28天內(nèi)生存率明顯下降,心功能顯著惡化?？诜靶募?nèi)局部注射秋水仙堿抗炎治療可降低大鼠血清炎性細胞因子水平,保護尚存心肌細胞,抑制梗死后纖維結締組織增生,并顯著改善大鼠心功能,對MI后28天生存率略有改善但差異無統(tǒng)計學意義。關于該實驗中秋水仙堿引發(fā)的不良反應,MI+Col/i.g組表現(xiàn)出明顯的體質(zhì)量減低,考慮與秋水仙堿所導致的胃腸道反應(如腹瀉)相關。相比之下,MI+Col/i.m組大鼠未出現(xiàn)腹瀉情況,且體質(zhì)量較MI組顯著增加。與Sham組比較,實驗組中腎功能的損害考慮心腎綜合征所致,故本實驗中未發(fā)現(xiàn)秋水仙素相關的肝腎功能惡化。目前關于秋水仙堿的臨床研究大多將嚴重腎功能不全患者排除在外[10]。鑒于冠心病人群中腎功能不全患者常見,且秋水仙堿部分通過腎臟代謝,因此針對冠心病合并腎功能不全患者用藥的安全性尤為重要。

作為古老抗炎藥物,秋水仙堿主要通過抑制炎癥小體、干擾中性粒細胞功能、干擾中性粒細胞-血小板相互作用3個方面起作用[11～13]。Toll樣受體信號通路TLR4/NF-κB在缺血心肌中顯著增強,于MI后的炎性反應中起著關鍵作用。當發(fā)生急性心梗時,TLR4受到刺激,導致NF-κB的活化,通過NLRP3、ASC和procaspase-1的寡聚化促進NLRP3炎癥體的形成,NLRP3炎癥體激活caspase-1,一方面導致IL-1β和IL-18等促炎性細胞因子的產(chǎn)生和分泌,另一方面誘發(fā)凋亡[14]。已有相關研究闡明秋水仙堿可以通過調(diào)節(jié)M1/M2巨噬細胞極化,抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路以及caspase-1蛋白,明顯抑制MI后炎性反應[15,16]。

本實驗中雖然通過心肌內(nèi)注射秋水仙堿達到了改善MI后心功能的作用,同時減少了口服用藥耐受性。然而尚有諸多不足之處,例如在研究藥物不良反應時,沒能對大鼠腹瀉做量化統(tǒng)計分析。在對于秋水仙堿治療MI作用機制的探討暫引用目前已知的觀點,未能進性更深入的研究。此外治療效果上心肌內(nèi)注射與灌胃治療沒有顯著差異,考慮與缺乏有效的藥物釋放載體導致秋水仙堿在梗死周邊區(qū)滯留時間過短相關?？勺⑸渌z作為優(yōu)良的藥物釋放載體,具有疏松多孔的三維結構以及良好的生物相容性,已在MI后心肌內(nèi)注射的多個臨床研究中展現(xiàn)出了優(yōu)異的療效[17,18]。未來將探究以可注射水凝膠為載體,通過心肌內(nèi)注射的方式來達到秋水仙堿心肌局部緩慢釋放的效果,實現(xiàn)更持久的抗炎療效;同時將進一步探索秋水仙堿MI局部應用最適劑量,實現(xiàn)療效與不良反應之間的最佳平衡。

綜上所述,秋水仙堿用于MI的抗炎治療安全可行,能明顯緩解MI后的炎性反應,抑制心肌纖維化,改善心室重構,顯著緩解心功能的惡化,且心肌內(nèi)注射能有效提升對藥物耐受性。作為冠心病治療的新興研究方向,目前關于秋水仙堿治療冠心病的研究已取得諸多進展。鑒于低劑量秋水仙堿可廣泛降低冠心病患者主要心血管不良事件風險[9]。2021年歐洲心臟學會指南建議將秋水仙堿用于心血管疾病的二級預防[19]。因此,秋水仙堿對于冠心病的治療具有良好的應用前景,本實驗為進一步研究MI抗炎治療提供了可行的理論依據(jù)。