張曉靜 經(jīng) 莉 魏 敏 陸曉媛

宮頸癌發(fā)生率居于婦科惡性腫瘤首位,發(fā)生機制仍不明確,從分子水平角度對宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展進行研究更易于明確宮頸正常組織惡變過程,對于臨床有效治療宮頸癌意義重大。Kinesin家族成員11(kinesin family member 11, KIF11)是有絲分裂中必需的分子運動蛋白,促進細胞有絲分裂雙極紡錘體形成,并在間期介導細胞質(zhì)的各種運輸過程[1]。研究表明,KIF11是一種Wnt相關(guān)蛋白。Pei等[2]研究發(fā)現(xiàn),KIF11可通過激活Wnt/β-catenin信號通路增強乳腺癌細胞的自我更新,從而增強乳腺癌干細胞的特性。Wu等[3]研究發(fā)現(xiàn),KIF11通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路的活性促進肝細胞癌的惡性進展。β-catenin、GSK-3β作為此通路的主要調(diào)控因子發(fā)揮著重要作用。對于KIF11是否通過Wnt/β-catenin通路在宮頸癌中發(fā)揮作用,相關(guān)報道較少。本研究利用免疫組化法初步探究KIF11與Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)分子在宮頸癌中的表達及臨床意義,旨在探討三者聯(lián)合檢測對于宮頸癌診斷的臨床價值及潛在的治療靶點。

資料與方法

1.一般資料:收集2013年12月～2017年5月在徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院病理科存檔的宮頸組織蠟塊。標本中宮頸癌患者102例,患者年齡26～69歲,中位年齡為48歲。年齡<50歲55例,≥50歲47例;病理類型為鱗癌86例,腺癌16例;根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics, FIGO)分期,FIGO Ⅰ期69例,Ⅱ期24例,Ⅲ期9例;分化程度為高分化66例,中、低分化36例;無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移53例,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例(102例宮頸癌患者中,83例接受了手術(shù)治療,術(shù)中行淋巴結(jié)清掃術(shù);19例患者接受了放化療等抗腫瘤治療)。同期收集慢性宮頸炎組織40例,患者年齡30～58歲,中位年齡為46歲。低級別鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesion, LSIL)組織46例,高級別鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesion, HSIL)組織52例,患者年齡28～55歲,中位年齡為45歲。宮頸癌患者納入標準:①病理確診為宮頸癌;②臨床病理資料完整;③患者可進行術(shù)后長期隨訪。排除標準:①合并其他系統(tǒng)的惡性腫瘤;②合并其他內(nèi)外科疾病。本研究經(jīng)徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準(倫理學審批號:XYFY2022-KL224),樣本收集取得患者知情同意。

2.主要試劑與儀器:兔抗人多克隆抗體KIF11購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司,兔抗人多克隆抗體β-catenin、兔抗人多克隆抗體GSK-3β均購自武漢賽維爾生物科技有限公司,組化筆、試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine,DAB)顯色劑購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

3.實驗方法:采用免疫組化法檢測KIF11、β-catenin、GSK-3β在不同宮頸組織中的表達情況,具體實驗操作步驟如下:將組織蠟塊4μm厚度連續(xù)切片;切片脫臘至水化;枸櫞酸抗原修復緩沖液(pH 6.0)進行抗原修復;切片放入3%過氧化氫溶液,室溫避光孵育25min,以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性;膜封閉液(3%BSA)中封閉30min;滴加KIF11、β-catenin、GSK-3β一抗,4℃孵育過夜;滴加二抗,室溫孵育50min;DAB顯色;蘇木精復染細胞核3min;脫水封片;顯微鏡鏡檢,圖像采集分析。

4.結(jié)果判定:病理切片由兩名高年資病理科醫(yī)師采用雙盲法進行閱片。在高倍鏡(×400)下隨機選取10個視野,每個視野觀察100個細胞。染色強度評分如下:無著色記為0分,淡黃色記為1分,棕黃色記為2分,棕褐色記為3分。陽性細胞百分比評分如下:陽性細胞<5%記為0分,5%～25%記為1分,25%～50%記為2分,50%～75%記為3分,≥75%為4分,根據(jù)染色強度×陽性細胞百分比的結(jié)果作為最終得分:<3分判為陰性,≥3分判為陽性。

5.隨訪:對所有患者進行長期隨訪,采用門診復診、電話等方式隨訪患者的生存狀況,以患者開始治療的時間作為隨訪開始時間,隨訪時間截至2022年7月31日。

6.統(tǒng)計學方法:應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用χ2檢驗分析不同宮頸組織中KIF11、β-catenin、GSK-3β的表達情況及其與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系,采用Spearman相關(guān)分析法分析KIF11、β-catenin與GSK-3β三者之間的相關(guān)性,采用Kaplan-Meier法對宮頸癌患者進行生存分析,COX比例風險模型分析影響宮頸癌患者的獨立預后因素,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.不同宮頸組織中KIF11、β-catenin、GSK-3β表達情況:KIF11在細胞質(zhì)中以棕褐色顆粒形式表達,陽性率在慢性宮頸炎組、LSIL組、HSIL組和宮頸癌組分別為12.50%、32.60%、44.23%、60.78%,呈逐漸遞增趨勢;β-catenin在細胞質(zhì)和細胞核中以棕黃色顆粒形式表達,陽性率在4組中分別為15.00%、28.26%、48.08%、62.75%,呈逐漸遞增趨勢;GSK-3β在細胞質(zhì)和細胞核中以棕黃色顆粒形式表達,陽性率在4組中分別為67.50%、47.83%、36.54%、24.51%,呈逐漸遞減趨勢(P<0.05),詳見表1。

表1 不同宮頸組織中KIF11、β-catenin、GSK-3β陽性率比較[n(%)]

2. KIF11、β-catenin、GSK-3β表達情況與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系:在宮頸癌患者組織中,KIF11、β-catenin、GSK-3β陽性表達在FIGO分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),在不同年齡及病理類型方面比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),詳見表2。

表2 宮頸癌組織中KIF11、β-catenin、GSK-3β表達與臨床病理特征的關(guān)系(n)

3. 宮頸癌組織中KIF11、β-catenin、GSK-3β表達相關(guān)性分析:在宮頸癌組織中,KIF11與β-catenin的表達水平呈正相關(guān)(r=0.461,P<0.05),β-catenin與GSK-3β的表達水平呈負相關(guān)(r=-0.692,P<0.05),KIF11與GSK-3β的表達水平呈負相關(guān)(r=-0.336,P<0.05)。

4. KIF11、β-catenin、GSK-3β的表達與宮頸癌患者預后的關(guān)系:對102例宮頸癌患者進行長期隨訪,其中失訪患者15例,死亡患者20例,隨訪率為85.30%。Kaplan-Meier生存分析曲線顯示,KIF11陽性表達患者的平均生存時間短于陰性表達患者,β-catenin陽性表達患者的平均生存時間短于陰性表達患者,GSK-3β陽性表達患者的平均生存時間長于陰性表達患者(P<0.05),詳見圖1～圖3。

圖1 KIF11陽性和陰性宮頸癌患者生存曲線

圖2 β-catenin陽性和陰性宮頸癌患者生存曲線

圖3 GSK-3β陽性和陰性宮頸癌患者生存曲線

5.影響宮頸癌患者預后的單因素及多因素分析:單因素分析結(jié)果顯示,FIGO分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、KIF11、β-catenin和GSK-3β的表達與患者預后相關(guān)(P<0.05)。多因素分析結(jié)果顯示,FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、KIF11、β-catenin為宮頸癌患者預后的獨立危險因素,GSK-3β為獨立保護因素,詳見表3。

表3 COX回歸分析宮頸癌患者的預后影響因素

討 論

正常宮頸組織到惡變是一個受多因素調(diào)控的復雜過程。Wnt/β-catenin信號通路是調(diào)節(jié)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵通路[4]。Wnt/β-連環(huán)蛋白信號轉(zhuǎn)導途徑由細胞外Wnts啟動,并通過配體與細胞膜上存在的各種受體和輔受體結(jié)合轉(zhuǎn)導,激活細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄或非轉(zhuǎn)錄反應(yīng)[5]。研究表明,Wnt信號通路在宮頸癌的發(fā)生和侵襲中具有重要作用[6]。已有相關(guān)研究表明,KIF11可以調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路[2,3]。

KIF11是一種高度保守的運動蛋白,其結(jié)構(gòu)域通過將ATP的化學能轉(zhuǎn)化為機械力來結(jié)合并跨越微管[1]。由于KIF蛋白(如KIF11)的過表達,在有絲分裂過程中產(chǎn)生額外的力,導致姐妹染色單體過早分離,染色體分布不均,進一步導致子代細胞的非整倍性[7]。有研究發(fā)現(xiàn),KIF11在有絲分裂期間的G2/M期轉(zhuǎn)變和細胞周期檢查點中發(fā)揮重要作用,隨后調(diào)節(jié)腫瘤進展[8]。鑒于此,收集宮頸癌患者組織中KIF11蛋白表達情況并進行相關(guān)研究具有重要意義。Cheng等[9]研究發(fā)現(xiàn),KIF11在宮頸癌中表達增加,并且在宮頸癌進展過程中KIF11介導了胞質(zhì)分裂。

本研究中,隨著宮頸病變進展,KIF11陽性率呈上升趨勢,推測KIF11高表達預示宮頸癌組織惡化進程。此外,KIF11陽性患者生存時間低于陰性患者,認為KIF11在宮頸癌中充當癌基因,與患者預后不良相關(guān)。眾所周知,HPV感染是宮頸癌的危險因素。研究表明,HPV相關(guān)性宮頸癌的發(fā)病機制與病毒癌蛋白E6和E7的高表達相關(guān),通過抑制多種細胞蛋白(如p53、pRb、p21和p27),從而影響細胞增殖、細胞周期和凋亡等生物學過程[9]。由此可見,HPV和KIF11均可通過影響細胞增殖及細胞周期過程參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展,且兩者表現(xiàn)為協(xié)同作用,均是宮頸組織惡變的危險因素。

β-catenin是Wnt信號通路中重要的蛋白質(zhì)分子,其在宮頸癌組織中的表達水平直接影響Wnt/β-catenin信號通路的激活程度。β-catenin主要涉及兩種細胞活動:細胞-細胞黏附和信號轉(zhuǎn)導[10]。研究表明,HPV16 E6激活Wnt/β-catenin通路,對HPV轉(zhuǎn)化、上皮細胞永生、平衡組織穩(wěn)態(tài)和病理表型至關(guān)重要[11]。本研究中,隨著宮頸病變進展,β-catenin陽性率上升,表明β-catenin高表達預示宮頸癌的發(fā)生。本研究將患者按照β-catenin表達情況進行分組發(fā)現(xiàn),β-catenin陽性患者生存時間顯著低于陰性患者,這與相關(guān)研究認為HPV可通過誘導Wnt/β-catenin通路活化并促進宮頸癌惡性進展的結(jié)論具有相似之處,由此認為β-catenin在宮頸癌中充當癌基因作用,并影響患者預后[12]。Bulut等[13]研究發(fā)現(xiàn),在雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型中,HPV16 E7和組成型活性β-catenin的共表達可加速宮頸癌的發(fā)生。Wnt/β-catenin通路參與HPV相關(guān)性宮頸癌的發(fā)生,且β-catenin高表達可與HPV共同參與宮頸癌患者的癌變過程。

GSK-3β作為一種細胞內(nèi)絲氨酸-蘇氨酸激酶,其活性可以通過底物特異性的方式調(diào)節(jié)[14]。磷酸化作為GSK-3β最重要的調(diào)控機制,可影響參與DNA修復的相關(guān)信號通路的因子,以促進DNA修復。在DNA損傷的研究中,細胞核和線粒體中GSK-3β的不斷激活促進腫瘤抑制蛋白p53的表達,并與p53形成復合物,增強p53誘導的凋亡反應(yīng)[15]。作為β-連環(huán)蛋白的上游基因,GSK-3β通過控制Wnt信號轉(zhuǎn)導,在細胞增殖、遷移、轉(zhuǎn)移和分化中擔負重要作用[17]。在不同類型的腫瘤中,GSK-3β作為腫瘤抑制因子或腫瘤啟動因子仍具有爭議[16]。

本研究發(fā)現(xiàn),隨著宮頸病變進展,GSK-3β陽性率減低,這可能與GSK-3β異常表達通過使細胞內(nèi)代謝調(diào)控異常、延緩組織惡化過程有關(guān)。Abudula等[17]研究發(fā)現(xiàn),宮頸癌發(fā)生及HPV感染伴有腫瘤組織內(nèi)糖脂和氨基酸分解代謝加劇,能量代謝增強,處于物質(zhì)代謝紊亂的病理狀態(tài),與HPV陰性對照比較,GSK-3β在HPV16陽性宮頸癌或癌前病變中表達減少,由此認為,通過影響GSK-3β表達參與宮頸組織病變過程,可能是HPV促進宮頸癌發(fā)生的重要因素之一。此外,GSK-3β陽性患者生存時間高于陰性患者,推測GSK-3β可能在宮頸癌中充當抑癌基因作用,在臨床病例中此類患者預后更好。

本研究中宮頸癌患者組織中KIF11、β-catenin、GSK-3β陽性表達顯著影響FIGO分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,而不受年齡及病理類型影響,三者不僅在宮頸組織向惡化轉(zhuǎn)變過程中擔負重要作用,而且有助于評估腫瘤惡性程度進展及預后;其中KIF11及β-catenin陽性表達互為影響,兩者共同參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展,在宮頸組織惡變進程中發(fā)揮協(xié)同作用,GSK-3β分別與KIF11、β-catenin起相互抑制作用,在宮頸癌中發(fā)揮負性作用,推測三者可作為宮頸癌的有效預測指標。β-catenin、GSK-3β作為Wnt信號通路的重要分子,KIF11可能通過激活該信號通路來調(diào)控宮頸癌的惡性進展。但本研究受研究樣本量限制,且為單中心研究,今后將收集更大樣本量,采用多中心研究予以驗證本實驗結(jié)論。

綜上所述,KIF11、β-catenin與GSK-3β異常表達與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及預后相關(guān),三者聯(lián)合檢測為宮頸癌的診斷及預后提供了新的參考。