王琦琦, 孫 艷, 唐光輝,*

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院, 西部森林生物災(zāi)害治理國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 楊凌 712100;2. 中國科學(xué)院動(dòng)物研究所, 動(dòng)物進(jìn)化與系統(tǒng)學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100101)

核桃舉肢蛾Atrijuglanshetaohei又名核桃展足蛾、核桃黑,屬鱗翅目(Lepidoptera)織蛾科(Oecophoridae)黑展足蛾屬Atrijuglans,是對(duì)核桃果實(shí)危害最大的害蟲(Wangetal., 2016; 王琦琦等, 2016)。其幼蟲蛀食核桃青果,導(dǎo)致提前落果,核桃產(chǎn)量下降40%以上,嚴(yán)重影響核桃的品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值(田敏爵等, 2010)。每年,核桃舉肢蛾危害在我國河北、河南、山東、山西、陜西、四川、貴州等核桃產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生,嚴(yán)重影響核桃果實(shí)的品質(zhì)、產(chǎn)量和商業(yè)價(jià)值,給當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)帶來重大損失(田敏爵等, 2010; 武海斌等, 2020; 孟樹標(biāo), 2022; 王永平等, 2022)。目前,有關(guān)核桃舉肢蛾的研究主要集中于生物學(xué)特性(南小寧等, 2017; 劉桂湘等, 2018)、田間發(fā)生規(guī)律(武海斌等, 2020; 孟樹標(biāo), 2022)及防治技術(shù)(王相宏等, 2015; 陳邦清等, 2021)等方面,對(duì)核桃舉肢蛾種群遺傳結(jié)構(gòu)和種群擴(kuò)張歷史的研究卻未見報(bào)道。

微衛(wèi)星標(biāo)記(microsatellite marker)又稱簡單序列重復(fù)(simple sequence repeat, SSR),因其具有高多態(tài)性、共顯性、豐富性等特點(diǎn),可作為DNA分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物的系統(tǒng)發(fā)生、遺傳多樣性和地理譜系等方面的研究。微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)在農(nóng)林業(yè)害蟲的種群遺傳結(jié)構(gòu)和種群遺傳研究中應(yīng)用廣泛,如瓜實(shí)蠅Bactroceracucuribitae、棗食芽象Scythropusyasumatsui、灰飛虱Laodelphaxstriatellus、天鵝絨豆毛蟲Vespulapensylvanica和寄生蜂Anticarsiagemmatalis等(張亞楠等, 2018; 洪波等, 2019; 姜姍等, 2020; Huetal., 2023; Neivaetal., 2023; Rustetal., 2023)。

核桃種植已成為核桃產(chǎn)區(qū)的經(jīng)濟(jì)支柱產(chǎn)業(yè),然而,許多產(chǎn)區(qū)皆有核桃舉肢蛾危害,使當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)蒙受巨大損失,為深入了解核桃舉肢蛾的分布特點(diǎn)和擴(kuò)散途徑,本研究根據(jù)核桃舉肢蛾轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)獲取的大量微衛(wèi)星位點(diǎn),并對(duì)所選取的微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行篩選,獲得可用于核桃舉肢蛾地理種群遺傳多樣性分析的9個(gè)微衛(wèi)星分子標(biāo)記,對(duì)8個(gè)省/市16個(gè)核桃舉肢蛾地理種群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,分析其種群間的遺傳分化和基因流,并對(duì)核桃舉肢蛾種群擴(kuò)散途徑進(jìn)行綜合分析和探討,為提高核桃舉肢蛾的防控效率提供理論依據(jù)和參考資料,降低因核桃舉肢蛾危害而造成的經(jīng)濟(jì)損失。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源和總DNA提取

于2016年8月上、中旬分別在我國北京、河北、河南、山東、陜西、甘肅、四川等8個(gè)省/市核桃舉肢蛾的主要發(fā)生區(qū)采集核桃舉肢蛾危害蟲果,蟲果采集距離保證50 m以上,且每個(gè)蟲果中取出1頭核桃舉肢蛾幼蟲作為供試樣本,以保證其為來自不同父母本的后代個(gè)體,然后浸泡于無水乙醇中,帶回西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院,-20 ℃保存?zhèn)溆?共計(jì)16個(gè)地理種群,319頭個(gè)體,詳細(xì)采集信息見表1。

表1 核桃舉肢蛾幼蟲采集信息

將每個(gè)供試樣本分別置于1.5 mL滅菌離心管中,使用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒[天根生化(北京)有限公司]進(jìn)行總DNA提取。使用Q3000核酸測定儀(Quawell,美國)檢測所提取的核桃舉肢蛾基因組DNA的濃度和吸光值,檢測合格的DNA樣品保存于-20 ℃冰箱中。

1.2 RNA提取、cDNA文庫的制備和測序

利用從陜西鎮(zhèn)安采集的核桃舉肢蛾危害蟲果中獲得的新鮮核桃舉肢蛾幼蟲,將15頭幼蟲的胸部組織置于1個(gè)1.5 mL離心管中,采用RNAisoPlus總RNA提取試劑盒(TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司)提取總RNA并構(gòu)建cDNA文庫,由陜西博瑞德生物科技有限公司采用Illumina高通量測序平臺(tái)(Hiseq 2000)進(jìn)行測序(Lietal., 2020)。

1.3 微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選和擴(kuò)增

使用SSR軟件MISA(MicroSAtellite)對(duì)核桃舉肢蛾轉(zhuǎn)錄組45 696條unigene進(jìn)行分析查找,共獲得SSR位點(diǎn)2 586個(gè)。根據(jù)SSR重復(fù)單元長度和重復(fù)次數(shù)的不同(羅純等, 2015),選出40個(gè)SSR位點(diǎn),并使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以1.1節(jié)提取的16個(gè)地理種群的核桃舉肢蛾幼蟲DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(20 μL): 2×Taq PCR MasterMix 10 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1 μL, 模板DNA(50～100 ng/μL)1 μL, ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)程序: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 退火 30 s, 72 ℃ 30 s, 共35個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物用1%凝膠電泳檢測以判斷引物的穩(wěn)定性和特異性。然后經(jīng)6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)對(duì)擴(kuò)增片段的大小和多態(tài)性進(jìn)行檢測,最終篩選出具有高多態(tài)性且易于擴(kuò)增的微衛(wèi)星位點(diǎn)并對(duì)所有樣本進(jìn)行擴(kuò)增,送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司經(jīng)ABI3700自動(dòng)測序儀(賽默飛, 美國)進(jìn)行毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis, STR)檢測,檢測結(jié)果使用GeneMarker軟件進(jìn)行基因分型,并對(duì)位點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行人工校對(duì)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1數(shù)據(jù)整理與遺傳參數(shù)統(tǒng)計(jì):(1)數(shù)據(jù)整理:將基因分型數(shù)據(jù)按照種群和位點(diǎn)的順序進(jìn)行整理并儲(chǔ)存在Excel中;(2)遺傳參數(shù)統(tǒng)計(jì):使用GenAlex version 6.5(Peakall and Smouse, 2005, 2012)和Popgene version 1.32(Yehetal., 1999)軟件統(tǒng)計(jì)各種群和各位點(diǎn)的遺傳參數(shù),包括等位基因數(shù)(number of alleles,Na)、有效等位基因數(shù)(effective number of alleles,Ne)、觀測雜合度(observed heterozygosity,Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity,He)、非偏差期望雜合度(unbiased expected heterozygosity,uHe)、Shannon’s指數(shù)(Shannon’s index,I)、近交系數(shù)(inbreeding coefficient,FIS)和基因流(gene flow,Nm)等。使用PIC_CALC version 0.6軟件(Nagyetal., 2012)計(jì)算多態(tài)信息含量(polymorphism information content,PIC)。

1.4.2遺傳平衡檢驗(yàn)和遺傳距離-地理距離相關(guān)性分析:(1)使用GenePop version 3.4軟件(Rousset, 2008)對(duì)核桃舉肢蛾各種群和各位點(diǎn)進(jìn)行哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinbergequilibrium, HWE)和連鎖不平衡(linkage disequilibrium)的顯著性分析,結(jié)果經(jīng)過Bonferroni校正;(2)用Google Earth version 7.1.8軟件測算各種群間的地理距離,并使用Excel分析種群間的遺傳分化系數(shù)[FST/(1-FST)]與地理距離(km)自然對(duì)數(shù)間的相關(guān)性。

1.4.3種群遺傳結(jié)構(gòu)分析:(1)使用STRUCTURE version 2.3.4軟件(Pritchardetal., 2000; Hubiszetal., 2009)根據(jù)貝葉斯聚類方法基于蒙特卡羅馬爾可夫算法分析核桃舉肢蛾的種群遺傳結(jié)構(gòu)。K值范圍1-16,每個(gè)取值重復(fù)計(jì)算10次,利用Evanno的ΔK法確定最佳K值(Evannoetal., 2005; Earl and Vonholdt, 2011)。使用CLUMPP version 1.1.2軟件(Jakobsson and Rosernberg, 2007)進(jìn)行比對(duì)整合并使用Distruct軟件(Rosenberg, 2004)繪圖;(2)基于非空間模型和貝葉斯方法,使用BAPS(Bayesian analysis of population structure)軟件(Coranderetal., 2008)將每個(gè)種群視為1個(gè)遺傳整體進(jìn)行種群遺傳結(jié)構(gòu)分析,設(shè)定K值取值范圍1-16,各取值重復(fù)計(jì)算10次;(3)基于種群間的Nei氏遺傳距離(Nei, 1978)構(gòu)建遺傳距離矩陣進(jìn)行主坐標(biāo)分析(principal coordinates analysis, PCoA)。

1.4.4分子變異分析(analysis of molecular variance, AMOVA):使用Arlequin version 3.52軟件包(Excoffieretal., 2007)計(jì)算種群內(nèi)和種群間的分子遺傳變異以及各種群間的遺傳分化系數(shù)(FST)和基因流(Nm), 1 000次隨機(jī)重復(fù)抽樣。其中,以‘Sum of squared size difference (RST)’代替‘Number of different alleles(FST)’以獲取更多的位點(diǎn)信息。

2 結(jié)果

2.1 核桃舉肢蛾SSR位點(diǎn)的篩選

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果選取的40對(duì)微衛(wèi)星引物中,通過1%凝膠電泳檢測出可穩(wěn)定擴(kuò)增的特異性引物后,經(jīng)6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)進(jìn)行檢測,共篩選出9個(gè)高多態(tài)性的SSR位點(diǎn)用于核桃舉肢蛾遺傳多樣性分析,其位點(diǎn)編號(hào)分別為SSR05, SSR08, SSR12, SSR21, SSR23, SSR28, SSR32, SSR33和SSR38(表2)。

表2 核桃舉肢蛾地理種群9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)引物序列及位點(diǎn)特征

2.2 基于9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的核桃舉肢蛾地理種群遺傳多樣性

在16個(gè)地理種群中共檢測到46個(gè)等位基因(表3),各位點(diǎn)等位基因數(shù)(Na)在3～7之間,有效等位基因數(shù)(Ne)變化范圍是1.019～2.286。其中,SSR05的Na和Ne值分別為4和1.019,在所有位點(diǎn)中均為最低,SSR28的Na最高為7,而Ne值最高的位點(diǎn)是SSR08(2.286)。Shannon’s指數(shù)(I)為0.063～0.931,平均值為0.557;觀測雜合度(Ho)為0.019～0.627,平均值為0.268;期望雜合度(He)為0.018～0.509,除SSR05, SSR23和SSR32外其他位點(diǎn)的觀測雜合度均低于期望雜合度,即雜合缺失。多態(tài)信息含量(PIC)為0.019～0.469?？傮w上,核桃舉肢蛾各位點(diǎn)等位基因的多態(tài)性相對(duì)中等,可提供一定的遺傳信息。

表3 核桃舉肢蛾地理種群9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性

由表4可以看到,核桃舉肢蛾16個(gè)地理種群的微衛(wèi)星位點(diǎn)特征較為一致,各地理種群均存在一定程度的多態(tài)性。其中,山西陽城種群(YC)的等位基因數(shù)最高為3.000,其I(0.594)和北京懷柔區(qū)種群(BJ)的uHe(0.360)均高于其他種群的,表現(xiàn)出相對(duì)較豐富的種群多樣性,而陜西山陽種群(SY)的多樣性水平則較低,各個(gè)參數(shù)(Na,Ne,I,Ho,He和uHe)值都是最低的。此外,北京懷柔區(qū)種群(BJ)、河北平山種群(HP)、河南安陽種群(AY)、河南三門峽種群(LB)、山東濟(jì)南種群(LC)、山西陽城種群(YC)、陜西洛南種群(LN)、陜西商南種群(SN)和陜西山陽種群(SY)的觀測雜合度Ho皆小于期望雜合度He,且各種群的FIS范圍在-0.153(NJ)～0.202(LB),說明群體內(nèi)的雜合子不足,種群內(nèi)近交機(jī)會(huì)更多,這可能與核桃舉肢蛾本身的飛行能力不足所導(dǎo)致的活動(dòng)范圍受限有關(guān)。

表4 基于9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的核桃舉肢蛾16個(gè)地理種群的遺傳多樣性

2.3 核桃舉肢蛾地理種群微衛(wèi)星位點(diǎn)的哈迪-溫伯格平衡和連鎖不平衡

如表5所示,各地理種群在大多數(shù)位點(diǎn)均未偏離哈迪-溫伯格平衡(P>0.05)。在位點(diǎn)SSR08上顯著偏離哈迪-溫伯格平衡(P<0.05)的種群有8個(gè),其中,河南三門峽種群(LB)、山西陽城種群(YC)、陜西商南種群(SN)和陜西寧陜種群(NS)在該位點(diǎn)呈極顯著偏離哈迪-溫伯格平衡(P<0.01)。此外,河南安陽種群(AY)在位點(diǎn)SSR21也表現(xiàn)為極顯著偏離哈迪-溫伯格平衡(P<0.001)。

表5 核桃舉肢蛾16個(gè)地理種群9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的哈迪-溫柏格平衡

9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因連鎖不平衡檢測結(jié)果(表6)顯示,除位點(diǎn)對(duì)SSR08和SSR12(P=0.022), SSR12和SSR21(P=0.039)以及SSR38和SSR33(P=0.003)外,其他成對(duì)位點(diǎn)間不存在連鎖不平衡的情況,為完全獨(dú)立遺傳。

表6 核桃舉肢蛾16個(gè)地理種群在各成對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)間的基因連鎖不平衡

2.4 核桃舉肢蛾地理種群遺傳分化和基因流

16個(gè)地理種群的遺傳分化(FST)及其基因流(Nm)計(jì)算結(jié)果(表7)表明,各地理種群間的遺傳分化指數(shù)最高為0.142,表明各種群間的遺傳分化處于中等或較低水平。山東濟(jì)南種群(LC)與其他種群間遺傳分化系數(shù)皆大于0.05,表明存在中等水平的遺傳分化。陜西鎮(zhèn)安種群(ZA)和陜西安康種群(AK)的種群間基因流最大為23.800,山東濟(jì)南種群(LC)與陜西太白種群(TB)的種群間基因流最小,為1.514,但與陜西眉縣種群(YG)、陜西商南種群(SN)、陜西寧陜種群(NS)和甘肅成縣種群(CX)的種群間的基因流皆小于2。因此,LC與上述5個(gè)種群間存在較大的遺傳分化,而其他種群間的遺傳分化并不明顯。

表7 基于9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的核桃舉肢蛾16個(gè)地理種群間成對(duì)固定系數(shù)FST (下三角)和基因流Nm (上三角)

2.5 核桃舉肢蛾地理種群遺傳距離與地理距離間的相關(guān)性

以16個(gè)地區(qū)的核桃舉肢蛾種群間的遺傳距離和地理距離進(jìn)行相關(guān)性分析,如圖1所示,回歸方程y=0.0209x-0.0707,R2=0.226,P<0.01,表明核桃舉肢蛾種群遺傳距離與地理距離間存在顯著的相關(guān)性。

圖1 基于9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的核桃舉肢蛾不同地理種群間遺傳分化系數(shù)與地理距離(km)的自然對(duì)數(shù)間的相關(guān)性

2.6 核桃舉肢蛾地理種群遺傳結(jié)構(gòu)

使用STRUCTURE軟件對(duì)16個(gè)核桃舉肢蛾地理種群進(jìn)行聚類分析(圖2),當(dāng)K為2時(shí)分組最佳(圖2: A),即16個(gè)核桃舉肢蛾地理種群分為2個(gè)分支:分支1由北京懷柔區(qū)種群(BJ)、河北平山種群(HP)、河南三門峽種群(LB)、山東濟(jì)南種群(LC)、山西陽城種群(YC)、陜西商南種群(SN)和陜西山陽種群(SY)組成;分支2由河南安陽種群(AY)、陜西洛南種群(LN)、陜西眉縣種群(YG)、陜西太白種群(TB)、陜西寧陜種群(NS)、陜西鎮(zhèn)安種群(ZA)、陜西安康種群(AK)、甘肅成縣種群(CX)和四川南江種群(NJ)組成(圖2: B)。

圖2 基于9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的核桃舉肢蛾地理種群遺傳結(jié)構(gòu)

同時(shí),使用BAPS軟件分析核桃舉肢蛾種群的遺傳結(jié)構(gòu),結(jié)果如圖2(C),山東濟(jì)南種群(LC)個(gè)體分歧過大,不參與分組,其他15個(gè)地理種群分為兩個(gè)分支,分支1由北京懷柔區(qū)種群(BJ)、河北平山種群(HP)、河南三門峽種群(LB)、山西陽城種群(YC)和陜西商南種群(SN)種群組成,分支2由河南安陽種群(AY)、陜西洛南種群(LN)、陜西眉縣種群(YG)、陜西太白種群(TB)、陜西寧陜種群(NS)、陜西鎮(zhèn)安種群(ZA)、陜西山陽種群(SY)、陜西安康種群(AK)、甘肅成縣種群(CX)和四川南江種群(NJ)組成。

主坐標(biāo)分析結(jié)果如圖3所示,第1和第2坐標(biāo)因子的貢獻(xiàn)率分別為108.7%和19.6%;北京懷柔區(qū)種群(BJ)、河北平山種群(HP)、河南三門峽種群(LB)、山西陽城種群(YC)和陜西商南種群(SN)的核桃舉肢蛾相距較近,占據(jù)第3和第4象限,說明其具有相似的主要成分;河南安陽種群(AY)、陜西洛南種群(LN)、陜西眉縣種群(YG)、陜西太白種群(TB)、陜西寧陜種群(NS)、陜西鎮(zhèn)安種群(ZA)、陜西安康種群(AK)、甘肅成縣種群(CX)和四川南江種群(NJ)集中在第二象限;而山東濟(jì)南種群(LC)和陜西山陽種群(SY)位于第一象限并與前兩組相距較遠(yuǎn),表明這兩個(gè)種群與前兩組差異較大,尤其是山東濟(jì)南種群(LC)。

圖3 基于9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的核桃舉肢蛾16個(gè)地理種群基于Nei氏遺傳距離矩陣的主坐標(biāo)分析(PCoA)

2.7 AMOVA分子方差分析

基于STRUCTURE和BAPS分析結(jié)果,根據(jù)山東濟(jì)南種群(LC)和陜西山陽種群(SY)分組的不同分別將16個(gè)地區(qū)的核桃舉肢蛾種群分為2組(表8)或3組,并對(duì)種群的分子遺傳變異進(jìn)行比較分析。在不同分組條件下,各參數(shù)結(jié)果呈現(xiàn)一定程度的一致性,FST值都小于0.1,說明群體內(nèi)個(gè)體間存在中等甚至很小的遺傳分化。同時(shí),種群內(nèi)部的遺傳變異占比都在90%以上(STRUCTURE中為95.42%,BAPS中分別為95.33%和92.71%),而種群間遺傳變異則較小。此外,考慮到其他可能影響種群分布的因素,包括地理阻隔和氣候差異等,進(jìn)一步的分子變異分層分析結(jié)果可以看到,不同分組方式下的遺傳分化FCT值在0.03941～0.06449之間,說明地理阻隔和氣候差異不是影響核桃舉肢種群遺傳結(jié)構(gòu)和地理分布格局的主要因素。

表8 基于9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的核桃舉肢蛾16個(gè)地理種群的AMOVA分析

3 討論

本研究根據(jù)核桃舉肢蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行微衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì),使用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和毛細(xì)管電泳篩選出9個(gè)多態(tài)性較高的微衛(wèi)星位點(diǎn),并對(duì)核桃舉肢蛾的種群遺傳多樣性進(jìn)行分析,同時(shí)對(duì)核桃舉肢蛾的種群分布和種群擴(kuò)散途徑進(jìn)行探討,為鱗翅目昆蟲的微衛(wèi)星位點(diǎn)開發(fā)提供了參考資料,也為核桃舉肢蛾的防治提供理論參考。

3.1 核桃舉肢蛾的種群遺傳多樣性

在種群遺傳多樣性研究中,等位基因數(shù)、觀測雜合度和期望雜合度等參數(shù)是衡量種群遺傳多樣性水平的重要指標(biāo),其值的大小可反映基因的豐富程度和研究對(duì)象對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力(謝麗等, 2009)。利用9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)核桃舉肢蛾16個(gè)地理種群的遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn),平均每個(gè)標(biāo)記的等位基因數(shù)在3～7個(gè),所有位點(diǎn)的平均Ho為0.268,平均He為0.274(表3),表明各種群的遺傳多樣性較低。所有位點(diǎn)的平均PIC為0.260,除SSR05, SSR33和SSR12外,其余6個(gè)位點(diǎn)的PIC均大于0.25,為中度多態(tài)性位點(diǎn),可以提供一定的多態(tài)信息對(duì)核桃舉肢蛾的遺傳多樣性進(jìn)行分析,這與我們前期基于線粒體基因和核基因的核桃舉肢蛾種群遺傳多樣性分析結(jié)果(Wangetal., 2022)是一致的。16個(gè)種群的平均Ho和平均He分別為0.268和0.274,其中,北京懷柔區(qū)種群(BJ)、河北平山種群(HP)、河南安陽種群(AY)、河南三門峽種群(LB)、山東濟(jì)南種群(LC)、山西陽城種群(YC)、陜西洛南種群(LN)、陜西商南種群(SN)和陜西山陽種群(SY)的平均期望雜合度高于平均觀測雜合度(表4),且近交系數(shù)FIS為正,皆表明這些種群內(nèi)有不同程度的近交。然而,陜西眉縣種群(YG)、陜西太白種群(TB)、陜西寧陜種群(NS)、陜西鎮(zhèn)安種群(ZA)、陜西安康種群(AK)、甘肅成縣種群(CX)和四川南江種群(NJ)的種群平均Ho高于平均He且各種群的FIS為負(fù),表明其近交程度很低,可能有大量外來個(gè)體補(bǔ)充到當(dāng)?shù)胤N群中,或種群經(jīng)歷了瓶頸效應(yīng)或奠基者效應(yīng)(Stoneetal., 2002),這可能與核桃舉肢蛾起源單一,種群擴(kuò)張歷史較短,尚未積累到足夠的遺傳變異有關(guān),另一個(gè)可能的原因則是經(jīng)濟(jì)林木害蟲的種群擴(kuò)散受人為因素影響更大。

3.2 核桃舉肢蛾的遺傳分化、基因流和遺傳結(jié)構(gòu)

群體間的遺傳分化指數(shù)FST又稱為固定系數(shù),反映了種群間的遺傳分化程度。FST越大,表明兩種群間的差異越大,分化程度越高。本研究中,不同地區(qū)的核桃舉肢蛾都具有中等程度的遺傳分化,其遺傳分化系數(shù)在0.010～0.142之間(表7)。遺傳分化程度與種群間的基因流呈負(fù)相關(guān),陜西鎮(zhèn)安種群(ZA)和陜西安康種群(AK)之間的遺傳分化最低,基因流最大。而山東濟(jì)南種群(LC)與大多數(shù)群體間的遺傳分化系數(shù)大于0.1,表明該種群較其他種群有一定程度的遺傳分化。

綜合STRUCTURE和BAPS聚類分析以及主坐標(biāo)分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn),雖然不同分析結(jié)果存在一定的差異,但不同方法獲得的核桃舉肢蛾的種群遺傳結(jié)構(gòu)具有一定的共性,即將所有種群大致分為兩組:分組1包括北京懷柔區(qū)種群(BJ)、河北平山種群(HP)、河南三門峽種群(LB)、山西陽城種群(YC)和陜西商南種群(SN),分組2包括河南安陽種群(AY)、陜西洛南種群(LN)、陜西眉縣種群(YG)、陜西太白種群(TB)、陜西寧陜種群(NS)、陜西鎮(zhèn)安種群(ZA)、陜西安康種群(AK)、甘肅成縣種群(CX)和四川南江種群(NJ),但在山東濟(jì)南種群(LC)和陜西山陽種群(SY)的歸屬問題上出現(xiàn)分歧(圖2)。從主坐標(biāo)分析圖(圖3)可以看到,相對(duì)于陜西山陽種群(SY),山東濟(jì)南種群(LC)與前述兩組間距離都是最遠(yuǎn)的,而在BAPS分析中,當(dāng)將所有種群分為兩組時(shí),該種群被排除在外,表明其不屬于任何一組,而若將所有種群分為3組時(shí),山東濟(jì)南種群則單獨(dú)為一組。與此相異的是,在STRUCTURE分析中,最佳分組K取值為2時(shí),山東濟(jì)南種群(LC)歸屬于分組1。另一方面,BAPS和STRUCTURE分析在陜西山陽種群(SY)的分組上也存在分歧:在BAPS分析中,山陽種群屬于分組2,而在STRUCTURE中K=2時(shí)又屬于分組1,但在K=3時(shí),陜西山陽種群(SY)又和分組1的大部分種群形成一個(gè)分組。因此,陜西山陽種群(SY)可能與分組2更相似,這與PCoA分析結(jié)果是一致的。綜上所述,排除山東濟(jì)南種群(LC),其他15個(gè)地區(qū)的核桃舉肢蛾種群可分為兩組,組1包括北京懷柔區(qū)種群(BJ)、河北平山種群(HP)、河南三門峽種群(LB)、山西陽城種群(YC)和陜西商南種群(SN)共5個(gè)種群,分組2則由河南安陽種群(AY)、陜西洛南種群(LN)、陜西眉縣種群(YG)、陜西太白種群(TB)、陜西寧陜種群(NS)、陜西鎮(zhèn)安種群(ZA)、陜西山陽種群(SY)、陜西安康種群(AK)、甘肅成縣種群(CX)和四川南江種群(NJ)共10個(gè)種群組成。

3.3 影響核桃舉肢蛾種群遺傳結(jié)構(gòu)的因素

已有許多研究報(bào)道,季風(fēng)、氣流和擴(kuò)散能力等其他因素也可促進(jìn)種群擴(kuò)散并形成特定的種群遺傳結(jié)構(gòu)(Weietal., 2013; Xunetal., 2016)。例如夏季亞熱帶季風(fēng)有助于許多小型有翅昆蟲通過氣流由東南向西北擴(kuò)散。然而,核桃舉肢蛾一年1代以幼蟲結(jié)繭越冬,次年春季孵化并蛀食核桃果實(shí),羽化后成蟲壽命較短,僅約1周左右(田敏爵等, 2010)。核桃舉肢蛾成蟲過短的壽命和特殊的生活史使其無法借助上述力量進(jìn)行傳播。此外,核桃舉肢蛾也不具備遠(yuǎn)距離遷飛的能力。因此,地理阻隔(河流和山川)尤其是大型河流,可能對(duì)其種群擴(kuò)散的阻礙作用則更為明顯(Wangetal., 2022)。AMOVA分析的群體變異分析和分層變異分析中較高的種群內(nèi)變異(92.71%和90.05%)也證實(shí)了這一點(diǎn)。

結(jié)合種群遺傳結(jié)構(gòu)及地理分布來看,核桃舉肢蛾可以分為西部種群和東部種群兩大分支。西部種群主要分布于秦嶺山脈和大巴山一帶,包括河南安陽種群(AY)、陜西洛南種群(LN)、陜西眉縣種群(YG)、陜西太白種群(TB)、陜西寧陜種群(NS)、陜西鎮(zhèn)安種群(ZA)、陜西山陽種群(SY)、陜西安康種群(AK)、甘肅成縣種群(CX)和四川南江種群(NJ);東部種群則主要覆蓋太行山及其東部和南部平原地區(qū),由北京懷柔區(qū)種群(BJ)、河北平山種群(HP)、河南三門峽種群(LB)、山西陽城種群(YC)和陜西商南種群(SN)組成。核桃栽培歷史悠久,核桃舉肢蛾作為核桃的專食性害蟲,其種群分布與宿主植物具有一定程度的一致性。胡昳恒等(2014)利用核基因ITS對(duì)秦嶺地區(qū)和四川的核桃種群遺傳結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),秦嶺南北坡核桃群體與東北和四川地區(qū)核桃群體存在明顯的差異,并進(jìn)一步確定秦嶺核桃自然種群在歷史上并未經(jīng)歷種群擴(kuò)張,表明山系對(duì)核桃自然種群的分布影響不大。

此外,陜西山陽種群(SY)與西部秦嶺地區(qū)種群處于同一分組內(nèi),而山東濟(jì)南種群(LC)又與其他種群差異較大?？赡茉蚴墙鼛资陙?核桃果仁較高的營養(yǎng)價(jià)值被廣泛認(rèn)可,經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使我國甚至世界核桃種植面積快速擴(kuò)張,促進(jìn)核桃種苗的遠(yuǎn)距離運(yùn)輸和移植,進(jìn)一步促進(jìn)了核桃舉肢蛾的長距離傳播和擴(kuò)散,即核桃舉肢蛾種群的地理分布可能受到了人為因素等的干擾,這也是農(nóng)林害蟲種群遺傳結(jié)構(gòu)表現(xiàn)異常的主要原因。