摘要：目的 基于生物信息學(xué)分析和機(jī)器學(xué)習(xí)算法探究鐵死亡參與膿毒癥的機(jī)制及預(yù)測(cè)治療膿毒癥的潛在中藥，以期為膿毒癥的臨床治療提供新的治療方向及用藥思考。方法 從gene expression omnibus（GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)下載膿毒癥的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，利用R語(yǔ)言篩選差異表達(dá)基因（differentially expressed gene，DEG）。在FerrDb平臺(tái)收集與鐵死亡相關(guān)的靶點(diǎn)。采用weighted correlation network analysis（WCGNA）篩選關(guān)鍵模塊基因。得到DEG、WGCNA和鐵死亡基因數(shù)據(jù)集的交集基因，然后通過(guò)3種機(jī)器學(xué)習(xí)算法篩選出膿毒癥相關(guān)鐵死亡核心基因，利用GSE232753數(shù)據(jù)驗(yàn)證膿毒癥相關(guān)鐵死亡核心基因。通過(guò)CIBERSORT算法評(píng)估22種免疫細(xì)胞豐度進(jìn)而評(píng)估膿毒癥與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性。最后，通過(guò)核心基因預(yù)測(cè)潛在治療中藥，根據(jù)藥物性味歸經(jīng)拓展中醫(yī)理論。結(jié)果 利用隨機(jī)森林（random forest， RF）、支持向量機(jī)-遞歸特征消除（support vector machine-recursive feature elimination， SVM-RFE）和最小絕對(duì)收縮和選擇算法（the least absolute shrinkage and selection operator， LASSO）算法共篩選得到膿毒癥相關(guān)鐵死亡核心基因，進(jìn)一步利用GSE232753數(shù)據(jù)集進(jìn)行驗(yàn)證，最終確定TXN、NR1D2、PARP15為膿毒癥相關(guān)鐵死亡的核心基因，且其基因表達(dá)量均顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異（Plt;0.05），ROC分析顯示，3個(gè)潛在核心基因曲線下面積（area under curve， AUC）均大于0.9。免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析表明多種免疫細(xì)胞可能參與膿毒癥的發(fā)展，以上3個(gè)核心基因在不同程度上與免疫細(xì)胞有一定的相關(guān)性。利用本草圖鑒數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上述3個(gè)核心基因，通過(guò)《中華本草》和《中藥大辭典》篩選整理得到膿毒癥相關(guān)鐵死亡核心基因靶向中藥沙棘、蜂房等22味中藥，靶向中藥大多藥性偏平，藥味甘，歸經(jīng)入胃、肺。結(jié)論 鐵死亡參與膿毒癥的機(jī)制可能與TXN、NR1D2、PARP15基因的表達(dá)水平有關(guān)，同時(shí)預(yù)測(cè)了針對(duì)膿毒癥相關(guān)鐵死亡核心基因的靶向治療中藥，為膿毒癥的治療提供新的治療方向及用藥參考。

關(guān)鍵詞：膿毒癥；生物信息學(xué)；鐵死亡；機(jī)器學(xué)習(xí)；中藥預(yù)測(cè)

中圖分類號(hào)：R9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Exploring the mechanism of ferroptosis involved in sepsis and predicting traditional Chinese medicine based on bioinformatics analysis

Lu Wenting1， Li Bin2， Wu Lei2， Du Ye2， Liu Rihui2， Deng Mengyu2 and Liu Qian3

（1 School of Pharmacy， Western University of Chinese Medicine， Nanning 530000; 2 College of Pharmacy， Chengdu University， Chengdu 610106; 3 Guangxi Zhuang Yao Medicine Key Laboratory， Zhuang Yao Medicine Collaborative Innovation Center， Nanning 530000）

Abstract Objective Based on bioinformatic analysis and machine learning algorithms， to explore the mechanism of ferroptosis involved in sepsis and predict potential traditional Chinese medicine for the treatment of sepsis， and provide a new treatment direction and medication thinking for the clinical treatment of sepsis. Methods Gene expression data of sepsis were downloaded from GEO database， and differentially expressed genes （DEGs） were screened by R language. Targets related to ferroptosis were collected on the FerrDb platform. WCGNA was used to screen key module genes. The intersection genes of DEG， WGCNA and ferroptosis gene data sets were obtained， and then the core genes of sepsis-related ferroptosis were screened by three machine learning algorithms. The core genes of sepsis-related ferroptosis were verified by GSE232753 data. The abundance of 22 immune cells was evaluated by the CIBERSORT algorithm to evaluate the correlation between sepsis and immune cell infiltration. Finally， the core gene was used to predict the potential treatment of traditional Chinese medicine， and the theory of traditional Chinese medicine was expanded according to the nature and taste of the drug. Results The core genes of sepsis-related ferroptosis were screened by RF， SVM and LASSO algorithms， and further verified by GSE232753 data set. Finally， TXN， NR1D2 and PARP15 were determined as the core genes of sepsis-related ferroptosis， and their gene expression levels showed statistically significant differences （Plt;0.05）. ROC analysis showed that the area under the curve （AUC） of the three potential core genes was greater than 0.9. Immune cell infiltration analysis showed that a variety of immune cells may be involved in the development of sepsis， and the above three core genes had a certain correlation with immune cells to varying degrees. The above three core genes were screened and sorted by the herbal database， such as “Chinese Materia Medica” and “Dictionary of Traditional Chinese Medicine”. The core genes of sepsis-related ferroptosis were targeted at 22 traditional Chinese medicines， such as sea buckthorn， beehive， and so on. Most of the targeted traditional Chinese medicines had a relatively mild nature， a sweet taste， and entered the stomach and lungs through the meridians. Conclusion The mechanism by which ferroptosis was involved in sepsis may be related to the expression levels of the TXN， NR1D2， and PARP15 genes. At the same time， it was predicted that traditional Chinese medicine for targeted therapy of sepsis-related ferroptosis core genes could provide new treatment directions and medication references for the treatment of sepsis.

Key words Sepsis; Bioinformatics; Ferroptosis; Machine learning; Traditional Chinese medicine prediction

膿毒癥（sepsis）是由感染引起的全身炎性反應(yīng)綜合征，是第十大死亡原因，不僅可引起休克、導(dǎo)致多器官功能障礙或衰竭，且對(duì)人類生命構(gòu)成嚴(yán)重威脅[1-3]。由于其高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率，膿毒癥一直是急危重癥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[4-5]。研究表明，膿毒癥新發(fā)病例每年都在不斷增加，全球每年有180多萬(wàn)例嚴(yán)重膿毒癥，其在嬰幼兒、老年人和免疫缺陷等人群中發(fā)病率較高[6]，此外，發(fā)現(xiàn)有些膿毒癥存活的患者還存在一定的認(rèn)知功能障礙[7]。目前，膿毒癥的治療方法[8]主要包括抗菌藥物治療、機(jī)械通氣、液體復(fù)蘇等，但這些治療方法不能達(dá)到根治，且過(guò)度使用抗菌藥會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥的產(chǎn)生[9]。因此，探索膿毒癥新治療策略和尋找有效治療藥物具有重要意義。

鐵死亡是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡方式，其主要由脂質(zhì)過(guò)氧化物誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，且其在形態(tài)學(xué)、基因和生物學(xué)等方面不同于細(xì)胞凋亡、焦亡和自噬等其他形式的細(xì)胞死亡[10-12]。研究表明，鐵死亡在多種疾病的病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，包括缺血性中風(fēng)、缺血性再灌注損傷、癌癥、骨關(guān)節(jié)炎、阿爾茨海默病等疾病[13-16]?？梢?jiàn)，鐵死亡已逐漸成為治療多種疾病的研究熱點(diǎn)。此外，有研究表明，CD8+T細(xì)胞增強(qiáng)了機(jī)體中鐵死亡特異性脂質(zhì)過(guò)氧化[17]。B細(xì)胞增殖受鐵離子調(diào)控[18]。巨噬細(xì)胞主要通過(guò)toll樣受體2（TLR2）識(shí)別細(xì)胞表面的氧化磷脂清除鐵死亡細(xì)胞[19]。然而，鐵死亡與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)在膿毒癥發(fā)病機(jī)制中的相互作用尚不清楚。

近年來(lái)隨著高通量測(cè)序技術(shù)迅速發(fā)展和機(jī)器學(xué)習(xí)理論體系的成熟，高通量測(cè)序技術(shù)和機(jī)器學(xué)習(xí)算法被廣泛運(yùn)用于疾病診斷和確定、預(yù)后評(píng)估等[20-21]。本研究基于生物信息學(xué)分析方法和機(jī)器學(xué)習(xí)算法探究鐵死亡參與膿毒癥的機(jī)制。通過(guò)CIBERSORT算法評(píng)估每個(gè)樣本中22種免疫細(xì)胞的比例，進(jìn)一步明確膿毒癥與免疫浸潤(rùn)細(xì)胞之間的關(guān)系，最后，通過(guò)膿毒癥相關(guān)鐵死亡核心基因篩選出具有調(diào)節(jié)鐵死亡、治療膿毒癥的相關(guān)中藥，為尋找膿毒癥新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

以“sepsis”為關(guān)鍵詞在基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）檢索了膿毒癥患者的mRNA表達(dá)譜，下載GSE95233數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集包括124個(gè)樣本（102名膿毒癥患者和22名健康人）。選擇GSE232753數(shù)據(jù)集（包括8名健康人和20名膿毒癥患者）作為驗(yàn)證集。從FerrDb數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.zhounan.org/ferrdb/index.html）中下載鐵死亡基因集，共得到484個(gè)鐵死亡相關(guān)基因。

1.2 差異表達(dá)基因（DEG）的鑒定

使用R軟件中“l(fā)imma”包對(duì)GSE9522數(shù)據(jù)中的膿毒癥患者和正常樣本進(jìn)行差異分析，設(shè)置閾值為P lt; 0.05，|log2FC|gt;1，并使用R語(yǔ)言“ggplot2”包繪制火山圖可視化。

1.3 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）是通過(guò)對(duì)基因進(jìn)行聚類，形成模塊，用于分析模塊與特定特征（患者的臨床信息）之間的關(guān)系[22]。近年來(lái)，WGCNA分析在鑒定各種疾病生物標(biāo)志物方面被廣泛應(yīng)用，并顯示出巨大的潛力。這種分析方法可以幫助我們更深入地了解疾病的發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)，并為疾病的預(yù)防和治療提供重要的指導(dǎo)。使用R包“WGCNA”對(duì)GSE95233數(shù)據(jù)集膿毒癥患者和正常樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。對(duì)樣品進(jìn)行聚類處理，并檢測(cè)和剔除可能存在的明顯異常值。選擇適當(dāng)?shù)能涢撝狄苑相徑泳仃嚨臒o(wú)標(biāo)度拓?fù)錁?biāo)準(zhǔn)，進(jìn)而將鄰接矩陣轉(zhuǎn)化為拓?fù)渲丿B矩陣，并運(yùn)用自動(dòng)化網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。將模塊與臨床特征相關(guān)聯(lián)，并分析模塊成員（module membership， MM）和基因顯著性（gene significance， GS）之間的相關(guān)性。在樞紐基因模塊中滿足|MM|gt;0.8且|GS|gt;0.2的基因，將其定義為樞紐基因（hub基因）。利用Venn圖提取hub基因、鐵死亡基因和DEGs基因的交集，即膿毒癥相關(guān)鐵死亡基因， 然后將其進(jìn)行功能富集分析、機(jī)器學(xué)習(xí)。

1.4 功能富集分析

基因本體（gene ontology， GO）是將基因進(jìn)行注釋并分析基因的生物學(xué)過(guò)程，主要包括細(xì)胞組分（cellular component， CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物過(guò)程（biological process， BP）等3個(gè)類別。京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）是一種廣泛應(yīng)用的基因通路注釋數(shù)據(jù)庫(kù)。KEGG能夠分析基因的高級(jí)功能及其相關(guān)的信號(hào)通路信息，提供對(duì)基因在生物系統(tǒng)中的作用和相互關(guān)系的深入理解。使用R語(yǔ)言中的“ClusterProfiler”包和Metascape平臺(tái)對(duì)膿毒癥相關(guān)鐵死亡基因進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，設(shè)置Plt;0.05。

1.5 鐵死亡核心基因篩選

本研究以是否患有膿毒癥為二分類變量，使用3種機(jī)器學(xué)習(xí)算法[23-25]對(duì)膿毒癥相關(guān)鐵死亡基因進(jìn)行分析，包括隨機(jī)森林（random forest， RF）、支持向量機(jī)-遞歸特征消除（support vector machine-recursive feature elimination， SVM-RFE）和最小絕對(duì)收縮和選擇算法（the least absolute shrinkage and selection operator， LASSO）邏輯回歸法。本研究使用R包中“random forest”構(gòu)建RF模型。使用R包“glmnet”進(jìn)行LASSO邏輯回歸研究。使用R包中“caret”進(jìn)行SVM-RFE分析。最后，選擇3種機(jī)器學(xué)習(xí)算法所得的重疊基因作為膿毒癥相關(guān)鐵死亡核心基因。

1.6 鐵死亡核心基因驗(yàn)證

在GSE232753驗(yàn)證集中，采用雙側(cè)t檢驗(yàn)判斷膿毒癥相關(guān)鐵死亡核心基因在膿毒癥患者與健康人之間的顯著性水平，然后采用受試者工作特征（ROC）曲線和箱相圖來(lái)評(píng)估其診斷效能，分析膿毒癥相關(guān)鐵死亡核心基因是否與其研究結(jié)果一致。

1.7 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析

CIBERSORT是基于一種反卷積算法，主要采用支持向量回歸技術(shù)對(duì)基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，從而精確地計(jì)算混合樣本中各細(xì)胞類型的占比[26]。本文基于CIBERSORT算法對(duì)GSE95233數(shù)據(jù)集中數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以識(shí)別不同樣本中22種免疫細(xì)胞的豐度，使用Spearman相關(guān)系數(shù)分析膿毒癥相關(guān)鐵死亡核心基因與免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性，當(dāng)Plt;0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并用R語(yǔ)言可視化免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析結(jié)果。

1.8 中藥治療預(yù)測(cè)

將膿毒癥相關(guān)鐵死亡核心基因通過(guò)本草圖鑒數(shù)據(jù)庫(kù)（HERB，http：//herb.ac.cn/）檢索其相應(yīng)中藥，Plt;0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，通過(guò)查閱《中華本草》和《中藥大辭典》篩選出具有調(diào)節(jié)鐵死亡、治療膿毒癥的相關(guān)中藥，并根據(jù)其性味歸經(jīng)繪制雷達(dá)圖進(jìn)行可視化總結(jié)。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)下載處理及差異表達(dá)基因鑒定

從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載基于GPL570測(cè)序平臺(tái)的GSE95233數(shù)據(jù)集，將數(shù)據(jù)歸一化處理，結(jié)果見(jiàn)圖1A。通過(guò)分析GSE95233數(shù)據(jù)集中102名膿毒癥患者和22名正常人的差異表達(dá)基因，共鑒別出2695個(gè)差異表達(dá)基因，其中有1516個(gè)上調(diào)基因，1179個(gè)下調(diào)基因。紅色區(qū)域表示顯著上調(diào)的基因，綠色表示顯著下調(diào)的基因，使用火山圖展示，見(jiàn)圖1B，熱圖見(jiàn)圖1C。

2.2 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

運(yùn)用R語(yǔ)言對(duì)根據(jù)顯著性排序的前15000個(gè)基因進(jìn)行WGCNA分析，首先對(duì)所有樣本進(jìn)行聚類分析，未發(fā)現(xiàn)異常樣本，見(jiàn)圖2A。根據(jù)基因間的無(wú)標(biāo)度拓?fù)鋽M合指數(shù)（R2）以及無(wú)標(biāo)度指數(shù)0.9來(lái)確定軟閾值Power（β）為17，以確保各基因之間的調(diào)控關(guān)系接近無(wú)尺度分布，見(jiàn)圖2B～C。通過(guò)構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)繪制模塊聚類樹狀圖，見(jiàn)圖2D，共得到14個(gè)基因模塊，并對(duì)模塊與表型進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)深紅色模塊（MEdarkred）與膿毒癥表型之間呈負(fù)相關(guān)（cor= -0.76， P=2e-24），藍(lán)綠色模塊（MEcyan）與膿毒癥表型之間呈正相關(guān)（cor=0.81， P=5e-30），見(jiàn)圖2E～G。提示這模塊聚類的基因可能與膿毒癥具有高度顯著的相關(guān)性，因此，選擇其作為膿毒癥關(guān)鍵基因模塊。以|MM|gt;0.8和|GS|gt;0.2為篩選條件進(jìn)行篩選，深紅色模塊中含有489個(gè)關(guān)鍵模塊基因，藍(lán)綠色模塊含有794個(gè)關(guān)鍵模塊基因。

2.3 膿毒癥相關(guān)鐵死亡基因富集分析

應(yīng)用“venn”包共獲得30個(gè)膿毒癥相關(guān)鐵死亡基因，見(jiàn)圖3A。將其進(jìn)行GO及KEGG富集分析。KEGG富集分析結(jié)果顯示，主要與鐵死亡（ferroptosis）、過(guò)氧物酶體（peroxisome）、脂肪酸合成（fatty acid biosynthesis）、脂肪酸氧化（Fatty acid degradation）、脂肪酸代謝（fatty acid metabolism）等信號(hào)通路相關(guān)，見(jiàn)圖3B。GO功能分析顯示，其主要參與一元羧酸代謝過(guò)程（monocarboxylic acid metabolic process）、輔酶代謝過(guò)程（coenzyme metabolic process）、長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A代謝過(guò)程（long-chain fatty-acyl-CoA metabolic process）等生物相關(guān)過(guò)程（BP）；微體部分（microbody part）、過(guò)氧化物酶體部分（peroxisomal part）、過(guò)氧化物酶體部分（peroxisomal membrane）等細(xì)胞組分（CC）；中鏈脂肪酸-CoA連接酶活性（medium-chain fatty acid-CoA ligase activity）、癸酸-CoA連接酶活性（decanoate-CoA ligase activity）等相關(guān)分子功能（MF），見(jiàn)圖3C。通過(guò)Metascape平臺(tái)對(duì)交集基因進(jìn)行富集，主要富集在鐵死亡（ferroptosis）、一元羧酸代謝過(guò)程（ monocarboxylic acid metabolic process）、巨噬的調(diào)控（regulation of macroautophagy）等，見(jiàn)圖3D。

2.4 膿毒癥相關(guān)鐵死亡核心基因

本研究使用3種機(jī)器學(xué)習(xí)算法對(duì)30個(gè)膿毒癥相關(guān)鐵死亡基因進(jìn)行分析。其中，使用LASSO回歸算法，共得到6個(gè)基因，見(jiàn)圖4A～B。選取RF算法共識(shí)別的20個(gè)基因進(jìn)行研究，見(jiàn)圖4C。通過(guò)SVM-RFE算法，篩選出前20個(gè)重要基因，見(jiàn)圖4E～F。然后將這3種算法得到的基因利用Venn圖取交集，共得到6個(gè)交集基因（TXN、NR1D2、ZFAS1、LYRM1、PARP15和IDH1），見(jiàn)圖4D，其中TXN在3種機(jī)器學(xué)習(xí)算法分析中均表現(xiàn)出最高評(píng)分。

2.5 膿毒癥相關(guān)鐵死亡核心基因驗(yàn)證結(jié)果

使用GSE232753數(shù)據(jù)集作為驗(yàn)證組，對(duì)上述6個(gè)膿毒癥相關(guān)鐵死亡核心基因進(jìn)行驗(yàn)證，通過(guò)繪制特征基因在對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的箱線圖，并進(jìn)行雙側(cè)t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，有3個(gè)基因表現(xiàn)出極顯著差異，TXN、NR1D2、PARP15（Plt;0.001），在膿毒癥患者中TXN表達(dá)上調(diào)，NR1D2、PARP15表達(dá)下調(diào)，見(jiàn)圖5A。同時(shí)進(jìn)行ROC曲線分析，結(jié)果顯示TXN、NR1D2、PARP15、ZFAS1、LYRM1和IDH1的AUC分別為0.925、0.906、0.912、0.669、0.706和0.662，見(jiàn)圖5B，表明TXN、NR1D2、PARP15等3個(gè)基因的具有作為膿毒癥診斷生物標(biāo)志物的潛力，且有望成為膿毒癥治療的潛在新靶點(diǎn)。

2.6 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析

使用CIBERSORT算法，對(duì)膿毒癥患者和正常樣本之間22種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的特點(diǎn)進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，初始B細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞、靜息樹突狀細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞等免疫細(xì)胞在健康樣本中細(xì)胞豐度相對(duì)較低，而M0型巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和γδT細(xì)胞等免疫細(xì)胞在膿毒癥患者中細(xì)胞豐度明顯較高，見(jiàn)圖6A～B中。根據(jù)相關(guān)性分析的發(fā)現(xiàn)，NR1D2和PARP15與CD8+T細(xì)胞表現(xiàn)出最強(qiáng)正相關(guān)，與單核細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)負(fù)相關(guān)；而TXN、ZFAS1、LYRM1和IDH1，與CD8+T細(xì)胞表現(xiàn)出最強(qiáng)負(fù)相關(guān)，與單核細(xì)胞表現(xiàn)出最強(qiáng)正相關(guān)，見(jiàn)圖6C，圖中紅色代表正相關(guān)，藍(lán)色代表負(fù)相關(guān)。

2.7 中藥預(yù)測(cè)結(jié)果

借助本草圖鑒數(shù)據(jù)庫(kù)映射核心基因相關(guān)中藥，以P＜0.05作為有顯著意義，共篩選出可能治療膿毒癥的中藥22種，通過(guò)《中華本草》和《中藥大辭典》對(duì)22種藥物進(jìn)行性味歸經(jīng)總結(jié)，見(jiàn)表1，并繪制雷達(dá)圖進(jìn)行可視化展示，由圖7A～B，可知，靶向中藥大多藥性偏平，藥味甘，歸經(jīng)入胃、肺。提示這些篩選出的中藥可能作為膿毒癥治療潛在藥物來(lái)源。

3 討論

膿毒癥是由感染引起的全身炎性反應(yīng)綜合征，其高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率，給患者的工作和生活帶來(lái)很大的痛苦，其已被世界衛(wèi)生組織（WHO）列為全球衛(wèi)生優(yōu)先事件。目前，對(duì)于膿毒癥的治療，只能通過(guò)抗菌藥物治療、機(jī)械通氣、液體復(fù)蘇等手段控制其癥狀，但膿毒癥患者感染后存在個(gè)體差異和缺乏特異性的臨床特征等狀況，很難能夠及時(shí)做出明確的臨床診斷。鐵死亡是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡方式，其具有免疫原性和促炎性[27]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞發(fā)生鐵死亡后會(huì)釋放損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），從而增加炎癥反應(yīng)，加重細(xì)胞死亡的過(guò)程[28]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析方法和機(jī)器學(xué)習(xí)算法探討鐵死亡參與膿毒癥的可能機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，TXN、NR1D2、PARP15、ZFAS1、LYRM1和IDH1是膿毒癥相關(guān)鐵死亡基因，根據(jù)數(shù)據(jù)集GSE232753進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)TXN、NR1D2和PARP15（Plt;0.001），同時(shí)這3個(gè)基因的中ROC的AUC分別為0.925、0.906、0.912，均大于0.9，故可認(rèn)為這3個(gè)基因?yàn)槟摱景Y相關(guān)鐵死亡核心基因，同時(shí)可作為膿毒癥的診斷生物標(biāo)志物。TXN是一種經(jīng)典的氧化還原蛋白，可以通過(guò)多種方式調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)[29-31]。研究表明，TXN蛋白降低會(huì)引起脂質(zhì)活性氧（ROS）堆積，最終引起細(xì)胞鐵死亡[32]。Chen等[33]研究證實(shí)，TXN在膿毒性腦病的小鼠模型中呈高表達(dá)，且能夠抑制炎癥反應(yīng)可減少細(xì)胞凋亡。此外，TXN與含有半胱氨酸（Cys）殘基的蛋白質(zhì)相互作用，能夠改變其構(gòu)象和功能，在一氧化氮的作用下，TXN亞硝基化CASP3的Cys活性位點(diǎn)，從而抑制其活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)鐵死亡，參與膿毒癥的發(fā)病機(jī)制[34]。NR1D2是1種與生物鐘紊亂相關(guān)的核激素受體。有研究表明，NR1D2在哮喘疾病中具有節(jié)律性[35]。Lachmann等[36]也發(fā)現(xiàn)NR1D2在膿毒癥患者中也具有節(jié)律性，且其表達(dá)量下調(diào)。NR1D2也被證實(shí)可以參與脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)、抑制細(xì)胞自噬通路、生物調(diào)節(jié)等過(guò)程，同時(shí)參與鐵死亡調(diào)控[37]。PARP15屬于PARP蛋白家族，其激活通常是由于脂質(zhì)代謝的紊亂。羅銳等[38]研究發(fā)現(xiàn)PARP蛋白家族具有抑癌的治療價(jià)值，其可調(diào)節(jié)鐵死亡達(dá)到治療效果。研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者心臟組織與PARP激活水平有關(guān)[39]。此外，也參與許多生物過(guò)程，如脫氧核糖核酸修復(fù)、細(xì)胞分裂、肺腺癌、細(xì)胞分化、應(yīng)激、免疫反應(yīng)和細(xì)胞死亡等過(guò)程[40]?；蚋患治鲲@示，脂肪酸相關(guān)代謝途徑被顯著富集。此外，當(dāng)脂質(zhì)過(guò)氧化物過(guò)多時(shí)，會(huì)破壞細(xì)胞的正常形態(tài)和功能，使細(xì)胞膜出現(xiàn)破裂或者有缺陷，從而誘發(fā)鐵死亡[41]。膿毒癥中這些異常表達(dá)的核心基因可能參與機(jī)體細(xì)胞中脂肪酸相關(guān)代謝途徑進(jìn)而參與鐵死亡的調(diào)控，從而影響外周血中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和膿毒癥的預(yù)后情況。

越來(lái)越多研究也表明，鐵死亡與細(xì)胞免疫浸潤(rùn)的變化有關(guān)[42-43]，如免疫細(xì)胞紊亂時(shí)會(huì)發(fā)生鐵死亡；鐵死亡又能夠被免疫細(xì)胞識(shí)別并加劇炎癥反應(yīng)。在膿毒癥患者中，由于氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的增強(qiáng)，導(dǎo)致TXN表達(dá)上調(diào)。而過(guò)度的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)又會(huì)導(dǎo)致免疫抑制，從而抑制CD8+T細(xì)胞的活性或功能，降低了其對(duì)感染細(xì)胞的殺傷能力。NR1D2和PARP15與CD8+T細(xì)胞呈正相關(guān)，說(shuō)明這兩個(gè)基因的表達(dá)水平可能影響了CD8+T細(xì)胞的活性，且CD8+T細(xì)胞在清除感染細(xì)胞和維持免疫穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用。Gianchecchi等[44]研究發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞能夠增強(qiáng)鐵死亡，從而達(dá)到免疫治療的效果。鑒于此，本研究采用CIBERSORT算法對(duì)膿毒癥患者和健康組的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)類型進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)多種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的變化與膿毒癥發(fā)生的重要生物學(xué)過(guò)程密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，M0巨噬細(xì)胞的比例顯著增加，這可為巨噬細(xì)胞極化做準(zhǔn)備；M1巨噬細(xì)胞主要參與促炎反應(yīng)，然而，在這項(xiàng)研究中沒(méi)有觀察到它們顯著增加；主要參與抗炎反應(yīng)的M2巨噬細(xì)胞在膿毒癥中顯著減少，表明其功能可能在膿毒癥發(fā)病機(jī)制中受到破壞；CD8+T細(xì)胞的比例顯著下降，表明其免疫功能受損，這更易加重膿毒癥病情的進(jìn)展；有研究表明[45]，自然殺傷細(xì)胞的數(shù)量和功能的異?？梢砸l(fā)多種免疫性疾病。本研究中，發(fā)現(xiàn)自然殺傷細(xì)胞的比例顯著減少，這可能是膿毒癥患者感染后造成機(jī)體異常免疫反應(yīng)所引起的。綜上所述，免疫細(xì)胞浸潤(rùn)以一種復(fù)雜的方式參與鐵死亡調(diào)控，促進(jìn)了膿毒癥的發(fā)展，還需更多的研究來(lái)進(jìn)一步闡明這種機(jī)制。

將上述篩選出的膿毒癥相關(guān)鐵死亡核心基因映射到本草圖鑒數(shù)據(jù)庫(kù)，以篩選出具有調(diào)節(jié)鐵死亡、治療膿毒癥可能有效的中藥。篩選的中藥中，沙棘有活血散瘀功效，現(xiàn)代研究表明沙棘具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎抑菌等藥理作用。此外，研究還發(fā)現(xiàn)沙棘中的黃酮類成分可以促進(jìn)樹突狀細(xì)胞、促成熟分子和共刺激分子顯著上升，對(duì)免疫基因的表達(dá)具有重要調(diào)節(jié)作用[46]?！端貑?wèn)·至真要大論》有云：“熱者寒之”，可以運(yùn)用清熱解毒法治療，改善病情[47]。另外，預(yù)測(cè)出的藥物中還有蜂房、山莓、虎杖葉、白茅根、天門冬等中藥均有清熱解毒功效。這和中醫(yī)治療膿毒癥選擇清熱解毒功效藥物的理念相符合。此外，中醫(yī)理論[47]也認(rèn)為，膿毒癥是由于瘀邪阻滯血脈所造成的，故具有活血化瘀功效的中藥對(duì)膿毒癥也起到一定的治療作用，本研究預(yù)測(cè)的中藥中沙棘、金甲豆、火麻仁等藥材也具有活血化瘀的功效。這說(shuō)明通過(guò)利用生物信息學(xué)和機(jī)器學(xué)習(xí)篩選出的診斷基因的具有一定的可靠性和準(zhǔn)確性。這為膿毒癥的治療提供了新的用藥參考。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，鐵死亡參與膿毒癥的機(jī)制可能與TXN表達(dá)上調(diào)及NR1D2、PARP15表達(dá)下調(diào)有關(guān)。ROC分析表明，這3個(gè)基因具有作為膿毒癥的診斷生物標(biāo)志物的較大潛力。本研究還發(fā)現(xiàn)，上述3個(gè)基因與多種類型的免疫細(xì)胞有較高相關(guān)性且參與了鐵死亡的調(diào)控，免疫細(xì)胞浸潤(rùn)與鐵死亡可能在膿毒癥發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮作用。此外，預(yù)測(cè)得到的22種中藥可能成為治療膿毒癥的潛在藥物，為臨床膿毒癥治療提供新的選擇藥物。但本研究是基于生物信息學(xué)研究，具有一定的局限性，需要進(jìn)一步結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

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