梁 歡 張惠文

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院 上海市兒科醫(yī)學(xué)研究所 兒內(nèi)分泌遺傳科（上海 200092）

杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD，OMIM 310200）是一種X 連鎖隱性遺傳的肌營(yíng)養(yǎng)不良癥，在活產(chǎn)男嬰中的患病率約為1/6000～1/4000[1]，女性病例較為罕見(jiàn)[2]。該病的致病基因位于染色體Xp 21 的抗肌萎縮蛋白基因（dystrophin，DMD，OMIM 300377），有79個(gè)外顯子，長(zhǎng)達(dá)2.5Mbp，是人類最大的基因之一[3]。DMD基因編碼抗肌萎縮蛋白，該蛋白主要分布在骨骼肌和心肌細(xì)胞的細(xì)胞膜上，起支架作用，能保護(hù)肌細(xì)胞膜在肌肉收縮時(shí)免遭損傷。DMD基因變異導(dǎo)致抗肌萎縮蛋白功能異常，引起肌細(xì)胞損傷，進(jìn)而出現(xiàn)進(jìn)行性肌肉壞死、萎縮，可導(dǎo)致兩種肌病——貝氏肌營(yíng)養(yǎng)不良和杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良，后者較重，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性肌無(wú)力、發(fā)育遲緩和/或發(fā)育倒退，最終出現(xiàn)呼吸衰竭及心力衰竭等，體格檢查可發(fā)現(xiàn)腓腸肌假性肥大、肌力下降等體征。

目前，在DMD 患者中發(fā)現(xiàn)了幾千種不同的DMD基因變異[4-5]，約60%～70%為片段缺失，5%～15%為片段重復(fù)，另有20% 為點(diǎn)突變、小缺失或插入，而倒位突變較為罕見(jiàn)，不足1%[6]。因而針對(duì)片段缺失/重復(fù)檢測(cè)的多重連接依賴性探針擴(kuò)增分析（multiplex ligation-dependent amplification，MLPA）為DMD 的主要檢測(cè)手段。對(duì)于MLPA 陰性者，可選擇二代測(cè)序技術(shù)，以發(fā)現(xiàn)一些微小變異。需要注意的是，即使綜合這幾種檢測(cè)手段，仍有約7%的患者找不到致病變異[7]。

光學(xué)基因組圖譜（optical genome mapping，OGM）是一項(xiàng)基于納米通道的基因作圖技術(shù)，利用基因組中的特定序列位點(diǎn)直接對(duì)大分子DNA 進(jìn)行熒光標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)DNA 分子的線性光學(xué)成像，在識(shí)別基因組的結(jié)構(gòu)變異方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[8-9]。此前，相關(guān)研究用OGM對(duì)11例DMD患者進(jìn)行了遺傳驗(yàn)證，準(zhǔn)確地確定了突變刪除、重復(fù)和反轉(zhuǎn)的斷點(diǎn)，還發(fā)現(xiàn)該方法能夠識(shí)別涉及DMD基因的5.1-Mbp倒位[10]。這表明OGM 能夠靈敏且準(zhǔn)確地識(shí)別基因組結(jié)構(gòu)變異，有望成為臨床基因診斷的新方法。

在此，我們報(bào)道1 例DMD 患兒，該患兒在進(jìn)行了MLPA和全外顯子測(cè)序后，均未發(fā)現(xiàn)致病變異。通過(guò)OGM檢測(cè)，成功識(shí)別出1個(gè)長(zhǎng)達(dá)711kb的臂內(nèi)倒位突變，涉及DMD基因44～55號(hào)區(qū)段的12個(gè)外顯子，破壞了該基因的正常結(jié)構(gòu)，屬于致病性變異，成功實(shí)現(xiàn)了該患兒的分子診斷。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性分析2020年6月12日在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院兒內(nèi)分泌遺傳科就診的1例DMD患兒的臨床資料。本研究已獲得監(jiān)護(hù)人知情同意并通過(guò)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院倫理委員會(huì)審查（No.XHEC-D-2022-101）。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 通過(guò)新華醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)收集該患兒的臨床表現(xiàn)和診斷過(guò)程。

1.2.2 基因檢測(cè)方法 ①M(fèi)LPA：對(duì)DMD基因的79 個(gè)外顯子利用天昊公司試劑盒進(jìn)行缺失/重復(fù)檢測(cè)。②全外顯子測(cè)序：以患兒外周血基因組DNA為檢測(cè)材料，先將基因組DNA 打斷并制備文庫(kù)，然后通過(guò)BGI V 4 芯片對(duì)目標(biāo)基因外顯子及臨近剪切區(qū)的 DNA 進(jìn)行捕獲和富集，最后使用MGISEQ-2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行變異檢測(cè)。測(cè)序片段通過(guò)羅伯斯-惠勒比對(duì)工具（Burrows-Wheeler-alignment tool，BWA）與加州大學(xué)圣克魯茲分校（university of California Santa Cruz，UCSC）hg19人類參考基因組進(jìn)行比對(duì)。使用基因組分析工具包（genome analysis toolkit，GATK）進(jìn)行堿基質(zhì)量值校正單核苷酸位點(diǎn)突變、小的插入或刪減和基因型檢測(cè)。使用 ExomeDepth 進(jìn)行外顯子水平的拷貝數(shù)突變檢測(cè)。③光學(xué)基因組圖譜技術(shù)：使用Bionano Prep KitsTM從新鮮血液中提取并標(biāo)記大分子量的基因組DNA，然后將其裝載在Saphyr芯片(?G 2.3)上進(jìn)行線性化，使用Saphyr儀器進(jìn)行光學(xué)成像。通過(guò)對(duì)原始數(shù)據(jù)結(jié)果預(yù)處理、組裝，對(duì)比到人類參照基因組hg 38。對(duì)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)質(zhì)控合格（表1），可進(jìn)行下一步變異分析。

表1 OGM檢測(cè)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

患兒，男，漢族，2歲。2020年6月12日（7月齡）因肺炎住院治療。血生化：肌酸激酶（CK）12 369U/L，顯著高于正常參考值（55～170U/L），當(dāng)時(shí)患兒能翻身、能獨(dú)坐，無(wú)明顯大運(yùn)動(dòng)發(fā)育落后，查體未發(fā)現(xiàn)腓腸肌肥大，針對(duì)DMD基因的MLPA檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)缺失/重復(fù)。10月齡時(shí)，進(jìn)一步行全外顯子組測(cè)序檢測(cè)，未檢出可解釋CK顯著升高的基因變異。21月齡時(shí)，家長(zhǎng)發(fā)現(xiàn)患兒走路不穩(wěn)，容易摔跤。自發(fā)病以來(lái)，患兒智力、語(yǔ)言發(fā)育正常。體格檢查：神清，身材勻稱，心肺腹部無(wú)異常，隱匿性陰莖，脊柱無(wú)側(cè)彎，四肢無(wú)畸形，雙側(cè)腓腸肌肥大，肌力Ⅳ級(jí)，肌張力正常，腱反射可引出，無(wú)亢進(jìn)或減弱。既往體健，由于患兒為領(lǐng)養(yǎng)，出生史和家族史不詳?；純旱脑\治時(shí)間軸見(jiàn)圖1。

圖1 患兒疾病進(jìn)展與診斷過(guò)程圖

2.2 基因檢測(cè)結(jié)果

M L PA 結(jié)果顯示，患兒D M D基因所有的79 個(gè)外顯子未見(jiàn)缺失/重復(fù)突變。全外顯子測(cè)序結(jié)果顯示，未檢出與患兒表型相關(guān)的基因變異。OGM 結(jié)果顯示，患兒Xp 21.1 存在1 個(gè)臂內(nèi)倒位突變：seq[GRch 38]inv(X)(p 21.1 p 21.1)chrX:31534761_32245846inv，斷點(diǎn)分別位于DMD基因44號(hào)外顯子的上游和55號(hào)外顯子下游，倒位片段長(zhǎng)約711.09 kbp，涉及DMD基因的44～55號(hào)區(qū)段的12個(gè)外顯子，破壞了DMD基因的正常結(jié)構(gòu)，屬于致病性變異。倒位突變示意圖如圖2所示。

圖2 DMD 基因倒位突變示意圖

3 討論

本例患兒在7 月齡時(shí)，發(fā)現(xiàn)血清CK 水平達(dá)正常值的50 倍以上，21 月齡時(shí)出現(xiàn)明顯的肌無(wú)力癥狀，伴有雙側(cè)腓腸肌肥大，臨床上高度懷疑為DMD。在MLPA 和全外顯子檢測(cè)陰性的基礎(chǔ)上，選擇了OGM 進(jìn)一步檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該患兒在Xp 21.1 存在1 個(gè)臂內(nèi)倒位突變，兩個(gè)斷點(diǎn)均位于DMD基因內(nèi)部，倒位片段長(zhǎng)約711.09 Kbp，涉及DMD基因的自44 到55 號(hào)的12 個(gè)外顯子，破壞了DMD基因的正常結(jié)構(gòu)。按照Redin 等[11]提出的對(duì)平衡性染色體結(jié)構(gòu)變異的分類標(biāo)準(zhǔn)：DMD基因變異與DMD 疾病表型的關(guān)系確切，且片段重排影響了該基因的功能區(qū)域，可判定該變異為致病性變異。依據(jù)DMD 多學(xué)科管理專家共識(shí)[12]，DMD的確診應(yīng)該基于發(fā)現(xiàn)DMD基因致病性變異或存在抗肌萎縮蛋白完全缺失的證據(jù)，故該患兒可以診斷為DMD。

DMD基因是人類最大的基因之一[3]，該基因區(qū)域內(nèi)有99%以上的序列是內(nèi)含子，含有豐富的可介導(dǎo)大片段基因重排的轉(zhuǎn)座元件[13]，結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性決定了該基因變異的多樣性，因此，DMD的基因診斷需要結(jié)合多種檢測(cè)方法。由于DMD基因變異中，大片段的缺失/重復(fù)占據(jù)主導(dǎo)，約80%左右[14-15]，MLPA 是基于探針的擴(kuò)增分析，可快速且準(zhǔn)確地檢出基因的大片段缺失或重復(fù)變異，故MLPA 成為了DMD患兒的首選檢測(cè)手段，但該技術(shù)無(wú)法檢出非缺失與重復(fù)的突變，這是本例患兒MLPA 檢測(cè)陰性的原因所在。DMD基因變異常發(fā)生在編碼區(qū)和/或相鄰的非編碼區(qū)[14-15]，小片段的突變及單核苷酸變異在DMD患兒中也較為常見(jiàn)，故外顯子靶向捕獲二代測(cè)序和全外顯子測(cè)序也是DMD 患兒常用的診斷手段。但是二代測(cè)序?qū)儆诙套x測(cè)序，在識(shí)別結(jié)構(gòu)突變時(shí)存在固有的局限性。需要注意的是，即使綜合上述幾種基因檢測(cè)方法，目前仍有約7%的患者找不到致病變異[7]。對(duì)于這種情況，以往的指南推薦進(jìn)行肌肉活檢以確認(rèn)抗肌萎縮蛋白的表達(dá)情況[16-17]，但肌肉活檢為有創(chuàng)性檢查，家長(zhǎng)的接受度低。

由于MLPA 和二代測(cè)序的技術(shù)缺陷，導(dǎo)致無(wú)法檢測(cè)出平衡性結(jié)構(gòu)變異，這是一類染色體總量不變，特定片段定位或者方向改變（如易位、倒位）的結(jié)構(gòu)變異。針對(duì)這類變異的檢測(cè)方法有助于提升DMD患者的診斷率，目前臨床上常用方法有核型分析、熒光原位雜交法（FISH）[18]。核型分析可檢出染色體數(shù)目異常和顯微水平的結(jié)構(gòu)異常，具有直觀、成本低的優(yōu)點(diǎn)，在檢測(cè)非整倍體方面具有強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)，但受限于顯帶技術(shù)分辨率低（3～10 Mb），無(wú)法精確提供變異的具體位置和大小，對(duì)于淺帶和帶型差異較小的區(qū)域容易誤判或漏判[19]。FISH主要用于特定染色體的變異驗(yàn)證，具有直觀、分辨率高（40～250kb）的優(yōu)點(diǎn)，但該技術(shù)只能利用定制探針對(duì)已知的位置進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)法檢測(cè)未知的變異[20]。

近年來(lái)，RNAseq和長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)也被用于平衡性結(jié)構(gòu)變異的檢測(cè)。RNAseq支持如剪接分析、等位基因表達(dá)分析和變異分析等多項(xiàng)分析，本身也是一種診斷工具。在一項(xiàng)原發(fā)性肌病的研究中發(fā)現(xiàn)[21]，RNAseq 能夠觀察到異常的剪接序列，成功識(shí)別DMD基因上的結(jié)構(gòu)突變并分析這些突變對(duì)RNA的影響，如發(fā)現(xiàn)2 種倒位突變引起剪切異常，1 種倒位/缺失突變引發(fā)了外顯子跳躍。但RNAseq技術(shù)需要高質(zhì)量RNA，較以DNA為原料的檢測(cè)方法，樣本提取、保存的要求高。長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)也能夠識(shí)別出倒位變異，相關(guān)研究報(bào)道了1 位DMD 患者，在進(jìn)行多項(xiàng)基因檢測(cè)無(wú)果后，通過(guò)長(zhǎng)讀長(zhǎng)全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)了DMD基因的1 個(gè)倒位-刪除-插入復(fù)雜重排突變[22]，但是該項(xiàng)技術(shù)價(jià)格高昂，且算法難度高，目前難以在臨床常規(guī)開(kāi)展。因此，對(duì)于傳統(tǒng)檢測(cè)方法應(yīng)用于倒位突變時(shí)的診斷窘境，OGM可能是一項(xiàng)頗具潛力的解決辦法。

OGM 利用基因組中的特定序列位點(diǎn)對(duì)大分子DNA 分子進(jìn)行熒光標(biāo)記，無(wú)需經(jīng)歷打斷、擴(kuò)增及修飾等過(guò)程，可以實(shí)現(xiàn)直接標(biāo)記的DNA 分子的線性光學(xué)成像[23]，平均讀長(zhǎng)超過(guò)200kbp，可一次性檢出多種不同類型的基因結(jié)構(gòu)突變，包括缺失、易位、倒位、重復(fù)、插入、環(huán)狀染色體、復(fù)雜重排和等臂染色體等[24]。與傳統(tǒng)的染色體結(jié)構(gòu)變異的檢測(cè)手段相比，OGM 具有更高的分辨率，并且能夠精確提供斷裂位點(diǎn)信息與插入方向，在識(shí)別結(jié)構(gòu)突變的方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。此前，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)OGM能夠準(zhǔn)確識(shí)別出8例DMD患者攜帶的各種結(jié)構(gòu)突變，并能夠提供結(jié)構(gòu)突變的斷裂位點(diǎn)信息，其中包括1個(gè)涉及DMD基因的長(zhǎng)達(dá)5.1 Mb 的倒位突變，該突變此前已被RNAseq 方法檢出[25]，這表明OGM 技術(shù)能夠高效、準(zhǔn)確地檢出DMD患者的致病變異。有研究對(duì)來(lái)自孤獨(dú)癥譜系障礙或智力障礙、先天性畸形、生殖障礙、染色體病和產(chǎn)檢異常的85個(gè)樣本進(jìn)行驗(yàn)證，涉及缺失、重復(fù)、異位、倒位、環(huán)狀染色體和復(fù)雜重排等多種類型的結(jié)構(gòu)突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OGM對(duì)于結(jié)構(gòu)突變的檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)方法達(dá)到了100%的一致性，說(shuō)明OGM檢測(cè)具有較高的準(zhǔn)確性[19]。近期，國(guó)內(nèi)的一項(xiàng)研究也證實(shí)了OGM的診斷效能。研究者利用OGM技術(shù)，在9例核型異常的樣本中檢測(cè)結(jié)構(gòu)突變，其中3 例為非平衡性結(jié)構(gòu)突變，6 例為平衡性結(jié)構(gòu)突變，包括5例易位和1例臂內(nèi)倒位，檢測(cè)結(jié)果與核型、芯片等傳統(tǒng)方法一致，并能精細(xì)化斷裂點(diǎn)位置，確定重復(fù)或插入的片段方向[26]。OGM除了能夠發(fā)現(xiàn)DMD患者的致病變異以外，還能夠識(shí)別母親攜帶的結(jié)構(gòu)突變[10]，表明OGM在DMD診斷及攜帶者篩查中具有重要的臨床意義。同時(shí)，OGM技術(shù)也存在一些局限性。由于OGM不涉及堿基序列的測(cè)定，分辨率受限于標(biāo)記密度，故不能檢出較小的突變（＜500bp）。由于異染色質(zhì)區(qū)域（如著絲粒、近端著絲粒染色體的短臂）為人類參考基因組序列的空白區(qū)域，故OGM無(wú)法檢出斷裂點(diǎn)或融合位點(diǎn)位于此區(qū)域的平衡性結(jié)構(gòu)變異，但隨著人類基因組序列的完善，OGM對(duì)于這些區(qū)段的結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)也逐漸成為可能。此外，OGM 新發(fā)現(xiàn)的一些結(jié)構(gòu)變異缺乏與表型之間的關(guān)聯(lián)性，仍需更多的研究進(jìn)行論證[27]。

綜上，我們報(bào)道了1例DMD患兒，其進(jìn)行MLPA和全外顯子測(cè)序后均未明確病因。使用OGM發(fā)現(xiàn)在Xp 21.1 存在1 個(gè)臂內(nèi)倒位突變，長(zhǎng)約711.09 kbp，涉及DMD基因的44～55 號(hào)區(qū)段的12 個(gè)外顯子，實(shí)現(xiàn)了該患兒的分子診斷。這表明，OGM能夠成功識(shí)別DMD基因的倒位突變，有望成為DMD患兒的重要補(bǔ)充診斷手段。