孫若楠 李泊涵 鄭德菲 趙夏瑩 林子云 胡昳歆 高 莉 高 靜 李 捷 盧 俊 肖佩芳 潘 健 凌 婧 方 芳 胡紹燕

蘇州大學附屬兒童醫(yī)院（江蘇蘇州 215025）

異基因造血干細胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）是兒童高危惡性疾病、先天性免疫缺陷病及骨髓衰竭疾病的重要治療手段，隨著移植技術的日漸成熟，更多的患者得到根治，但與移植后的長期存活及患者的生活質量密切相關的移植晚期并發(fā)癥也越來越引起臨床醫(yī)師的重視[1]。慢性移植物抗宿主病（chronic graft versus host disease，cGVHD）是移植后晚期的主要并發(fā)癥，cGVHD中最嚴重的肺部非感染性并發(fā)癥是閉塞性細支氣管炎（bronchiolitis obliterans，BO）。其中移植后BO 是一類發(fā)生在肺移植或造血干細胞移植（HSCT）后的肺部并發(fā)癥，臨床上將這類臨床表現(xiàn)、影像學、肺功能檢查基本符合BO 的疾病統(tǒng)一命名為閉塞性細支氣管炎綜合征（bronchiolitis obliterans syndrome，BOS）[2-3]。BOS 是導致移植后患者非復發(fā)死亡的主要原因，其死亡率高達50.0%[4-5]。目前國內(nèi)外對于BOS的研究多見于成人，兒童鮮見報道，本文通過回顧性分析在本院接受allo-HSCT患兒的病例資料，探究兒童移植后BOS的危險因素及臨床預后。

1 對象與方法

1.1 研究對象

回顧性分析2010年10月至2018年12月在蘇州大學附屬兒童醫(yī)院接受allo-HSCT患兒的臨床資料。納入標準：①年齡＜18 歲；②移植前肺功能檢查基本正常；③allo-HSCT后存活時間＞100天。排除標準：①臨床資料不完整；②失訪；③allo-HSCT后100天內(nèi)發(fā)生BOS。

本研究獲醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（No.2021CS 143）。

1.2 方法

1.2.1 預處理方案及GVHD 預防 以白消安+環(huán)磷酰胺（busulfan+cyclophosphamide，BuCy）為預處理方案的骨架，部分患兒采用氟達拉濱+BuCy，惡性血液病在此基礎上加用阿糖胞苷。部分急性淋巴細胞白血病，尤其合并髓外白血病的患兒，以全身照射（TBI）代替Bu。兔抗人胸腺免疫球蛋白（ATG）用于單倍體移植及無關供體移植體內(nèi)T細胞去除治療。環(huán)孢素（CSA）、他克莫司（tacrolimus，F(xiàn)K-506）或西羅莫司聯(lián)合嗎替麥考酚酯（mycophenolate mofetil，MMF）口服預防GVHD，移植后+1 d、+3 d、+6 d、+11d予甲氨蝶呤口服預防GVHD。

1.2.2 造血干細胞動員和采集 皮下注射重組人粒細胞集落刺激因子動員供者干細胞，劑量每天5～10μg/kg，皮下注射連續(xù)4至5天，供者白細胞＞50×109/L后暫停。第4天開始采集外周血干細胞或骨髓干細胞，若第4天干細胞數(shù)量不足，第5天繼續(xù)采集外周血干細胞，然后對采集物進行干細胞常規(guī)、單個核細胞（MNC）及CD34+細胞計數(shù)檢測。

1.2.3 GVHD診斷標準 急性GVHD(aGVHD)和cGVHD的診斷主要參照美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）標準[6]。根據(jù)患兒皮疹面積、膽紅素水平及腹瀉量進行分度，cGVHD主要根據(jù)患兒病變范圍和嚴重程度分為局限性和廣泛性。局限性：僅有局限性皮膚受累或僅有cGVHD引起的肝功能障礙。廣泛性：全身性皮膚受累，或在局限性cGVHD 的基礎上合并①肝組織學表現(xiàn)為慢性侵襲性肝炎、橋接性壞死或肝硬化；②眼睛受累，Schirmer 試驗濕潤度小于5mm；③唇腺活檢證明有小唾液腺受累或口腔粘膜受累；④其他任何靶器官的受累。

1.2.4 BOS 診斷標準及治療反應評估 BOS 診斷標準參考NIH 2005年建立并于2014年修訂的診斷標準[7]。BOS分度根據(jù)NIH 2014年肺功能及肺部情況評分[7]分為輕度、中度及重度。基于NIH共識[7]，依據(jù)FEV1%pred將BOS對治療的反應分為：①完全緩解（CR），治療后FEV1%pred≥80%；②部分緩解（PR），初始FEV1%pred＜70%，治療后FEV1% pred絕對值增加≥10%，但沒有達到CR；③病情穩(wěn)定（SD），初始FEV1%pred＜70%，治療后FEV1% pred絕對值變化小于10%；④疾病進展（PD），治療后FEV1%pred 絕對值下降≥10%。

1.2.5 BOS 治療 本研究29 例BOS 患兒的一線治療為甲基潑尼松龍，在此基礎上增加免疫抑制劑CSA或FK-506，部分患兒口服西羅莫司，同時予小劑量阿奇霉素（5 mg·kg-1·d-1）、孟魯司特鈉及布地奈德霧化治療，癥狀改善不明顯時加蘆可替尼或伊馬替尼。此外，8例患兒使用間充質干細胞，4例使用注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白，4 例使用利妥昔單抗，1 例使用吡非尼酮支持治療。每1～3個月檢測肺功能以評估治療效果。

1.2.6 隨訪 采用電話隨訪，隨訪周期約6個月，隨訪內(nèi)容為患兒疾病情況、一般狀態(tài)、有無嚴重并發(fā)癥等，末次隨訪時間為2019年9月1日，中位隨訪時間為2.1（1.1～3.5）年。BOS組中位隨訪時為1.7（1.0～2.9）年，Non-BOS組中位隨訪時間為2.1（1.1～3.6）年。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0 進行統(tǒng)計學分析。計量資料符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標準差表示；非正態(tài)分布的以中位數(shù)M（P25～P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法檢驗。采用多因素logistic回歸分析BOS 發(fā)生的危險因素。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank 檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

共納入接受allo-HSCT患兒368例，排除17例，其中10例因臨床資料不完整，6例因失訪排除，1例100天內(nèi)發(fā)生BOS。最終納入351例患兒，男213例、女138例，中位年齡75.0（38.0～119.0）月。移植前均無肺部基礎疾病。其中急性髓系白血?。ˋML）97例，急性淋巴細胞白血?。ˋLL）100例，再生障礙性貧血（AA）64例，骨髓增生異常綜合征（MDS）13例，急性混合細胞白血病3例，濕疹血小板減少癥伴免疫缺陷（WAS）30例，其他44例。臍血移植105例，骨髓干細胞移植15例，外周血干細胞移植72例，骨髓聯(lián)合外周干細胞移植159例。所有患兒中29例診斷為BOS（BOS 組），322 例未發(fā)生BOS（Non-BOS組），移植至發(fā)生BOS的中位時間為10.0（8.5～20.0）月。共發(fā)生cGVHD144例，局限性cGVHD85例，廣泛性cGVHD 59例。

2.2 BOS預后

截止至2019 年9 月1 日，共29 例診斷為BOS，發(fā)生率為8.3%，在cGVHD 患兒中，BOS 發(fā)生率為20.1%。在29 例BOS 患兒中，男11 例、女18 例，中位年齡92.0（67.0～132.0）月。因部分患兒年齡小，配合不佳，29例BOS中僅21例完成肺功能檢查，肺功能示FEV1占預計值為（51.0±22.3）%，F(xiàn)EV1/FVC為（77.4±22.1）%。余未完成肺功能檢查的根據(jù)其癥狀進行評分，BOS組輕度3例，中度10例，重度16例。

351例患兒移植后1、2、3年BOS累積發(fā)生率分別為（6.0±1.3）%、（10.0±1.8）%、（10.7±2.0）%；29 例BOS 患兒中，28 例BOS 發(fā)病前合并其他靶器官cGVHD；在28 例cGVHD 患兒中，移植后1、2、3 年BOS 累積發(fā)生率分別為（12.8±2.9）%、（23.0±4.0）%、（24.4±4.2）%。29例BOS患兒中死亡6例，存活患兒中10例不能脫離吸氧。

2.3 BOS危險因素分析

與Non-BOS 組相比，BOS 組年齡較大，男性比例較低，移植后100 天內(nèi)有呼吸系統(tǒng)疾病以及合并其他靶器官cGVHD的比例較高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 Non-BOS組與BOS組臨床特點比較

將單因素分析P＜0.05 的因素納入多因素logistic 回歸分析，結果顯示年齡較大、女性、移植后100 天內(nèi)有呼吸系統(tǒng)疾病以及合并其他靶器官cGVHD 是BOS 發(fā)生的獨立危險因素（P＜0.05）。見表2。

表2 多因素logistic回歸分析BOS發(fā)生危險因素

2.4 BOS組與Non-BOS組預后比較

截止至2019 年9 月1 日，351 例患兒中，死亡41 例，其中Non-BOS 組35 例，BOS 組6 例。BOS組和Non-BOS 組總生存（OS）率分別為71.7%（95%CI：51.7%～91.7%）和87.9%（95%CI：84.0%～91.8%），兩組間差異無統(tǒng)計學意義（χ2=2.48，P=0.120）。見圖1。16例重度BOS患兒死亡4例，中度死亡2 例，輕度無死亡。中、重度組OS 率分別為（72.0±17.8）%和（70.5±12.6）%，組間差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.09，P=0.812）。29例BOS患兒中，2例出現(xiàn)原發(fā)疾病復發(fā)，Non-BOS組復發(fā)22例，BOS組和Non-BOS組累積復發(fā)率分別為（6.9±4.7）%、（8.5±1.8）%，兩組差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.00，P=0.948）。

圖1 BOS 組與Non-BOS 組總生存率比較

3 討論

BOS是allo-HSCT后最嚴重的肺部并發(fā)癥之一。1982年Roca等[8]首先描述了allo-HSCT后的BOS，它是一種累及小氣道的炎性反應，臨床主要表現(xiàn)為活動后氣促、頑固性咳嗽、喘息，逐漸進展為進行性呼吸困難，很少伴有發(fā)熱。胸部高分辨CT（HRCT）主要表現(xiàn)為空氣潴留、支氣管壁增厚、馬賽克灌注征和支氣管擴張。BOS 的病理特征為肺內(nèi)終末細支氣管內(nèi)進行性纖維增生，導致氣道腔閉塞[9-10]。臨床上，BOS 在肺活量測定上表現(xiàn)為固定的氣流阻塞，在診斷時，大多數(shù)患者表現(xiàn)為中到重度通氣障礙，肺功能表現(xiàn)為阻塞性通氣功能障礙，而后逐漸發(fā)展為混合性通氣功能障礙[11-13]。盡管在BOS確診后進行治療干預，但BOS患兒通常會出現(xiàn)不可逆轉的進行性肺功能下降，5年存活率低至13.0%[14]。本研究對HSCT后BOS患兒的回顧性分析發(fā)現(xiàn)，BOS在移植后1、2、3年的累積發(fā)生率分別為（6.0±1.3）%、（10.0±1.8）%、（10.7±2.0）%，本研究中29 例BOS 患兒，28 例合并其他靶器官cGVHD，主要影響的靶器官為皮膚、口腔和肝臟，在cGVHD 患兒中，移植后1、2、3 年BOS 累積發(fā)生率分別為（12.8±2.9）%、（23.0±4.0）%、（24.4±4.2）%。早期文獻估計，在所有接受allo-HSCT 的患者中，BOS 發(fā)生率約為2.0%～5.0%，在已經(jīng)診斷為cGVHD的患者中，BOS發(fā)生率為6.0%[15-16]。然而，最近的研究表明BOS發(fā)生率有所增加。相關研究發(fā)現(xiàn)總體BOS發(fā)生率約為5.5%，在存活至少1年的患者中發(fā)生率為10.0%，在診斷為cGVHD的患者中發(fā)生率為16.0%[17]。也有研究發(fā)現(xiàn)BOS在所有移植患者中的總發(fā)生率為5.5%，在cGVHD患者中的發(fā)生率為14.0%[18]。本研究結果與近期研究基本一致。

許多研究評估了BOS 發(fā)生的危險因素，包括除肺部外其他部位的cGVHD、移植后Ⅲ或Ⅳ級aGVHD、外周血干細胞移植、高齡捐贈者、非HLA相合捐贈者、低丙種球蛋白血癥和甲氨蝶呤免疫抑制治療等[19-20]。移植前存在的肺部疾病似乎也是移植后BOS發(fā)生的預測因子[21]。此外，呼吸道病毒感染可能會引發(fā)BOS患兒的GVHD，供者巨細胞病毒（CMV）和EB 病毒（EBV）血清均陽性也會增加cGVHD的風險[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生BOS前合并其他靶器官cGVHD 和移植后100 天內(nèi)呼吸系統(tǒng)疾病是BOS發(fā)生的獨立危險因素，與既往研究結果一致。與之不同的是既往研究BOS 大多發(fā)生在接受外周血干細胞移植的患者中，因為外周血干細胞移植更易出現(xiàn)cGVHD，然而本研究發(fā)現(xiàn)來源于外周血干細胞的移植方式并未對BOS產(chǎn)生影響，可能與本研究病例數(shù)較少有關。而且以往研究很少提及臍血干細胞移植，可能考慮目前針對BOS的研究多集中于成人，成人較少行臍血移植，故無法做回顧性研究。此外，本研究排除了自體造血干細胞移植，考慮BOS主要為cGVHD的一種表現(xiàn)，而自體移植不存在排異反應，但既往也有關于自體移植后發(fā)生BOS的個案報道[18-20]，并且出現(xiàn)致死性結局。本研究發(fā)現(xiàn)女性及年齡較大兒童受者是BOS 發(fā)生的獨立危險因素。但通過文獻復習未發(fā)現(xiàn)有相似結果的報道，其他報道均認為性別并不是影響移植后BOS發(fā)生的危險因素，可能與兒童相關研究較少有關，并且本研究是單中心研究，樣本數(shù)少，可能存在偏倚，仍需多中心研究來驗證這一結論。

BOS 的發(fā)病機制目前尚未明確，許多研究認為BOS 與cGVHD 有關。目前已提出的機制主要集中于供體T 淋巴細胞、炎癥介質和細胞因子。CD 4+輔助T細胞在GVHD的啟動和調(diào)節(jié)中起重要作用。幼稚的CD4+T細胞激活后可以分化為不同功能的T輔助（Th）細胞，包括Th0、Th1、Th2、Th9、Th17和調(diào)節(jié)性T細胞[23]。肺GVHD發(fā)生所必需的T細胞亞群還未完全確定。一般說來，活化的Th1細胞分泌干擾素-γ，而Th2細胞分泌白細胞介素4（IL-4）、IL-5和IL-13，主要通過抗體釋放參與體液免疫[24]。越來越多的證據(jù)表明，IL-17在aGVHD和cGVHD都起著重要作用[25-26]。也有研究發(fā)現(xiàn)，供體細胞中缺乏T-bet轉錄因子（T-bet在T細胞中表達）促進了Th17細胞的分化和隨后的肺纖維化[24]。Flynn[27]等研究數(shù)據(jù)表明，供體T細胞來源的T濾泡輔助細胞是激活供體骨髓來源的B 細胞所必需的，這些細胞分化為生發(fā)中心細胞，導致免疫球蛋白在BOS病變中沉積。

目前多數(shù)文獻報道BOS發(fā)生于移植后100天后，且多數(shù)患者在移植后6～12 月發(fā)生[28]，本研究中移植至發(fā)生BOS 的中位時間為10.0（8.5～20.0）月，與既往報道一致。BOS 起病較為隱匿，臨床表現(xiàn)起初多無特異性，主要表現(xiàn)為活動后氣促，伴或不伴不同程度的咳嗽、喘息等，本研究中患兒多數(shù)以咳嗽為癥狀，部分以胸悶、經(jīng)皮動脈血氧飽和度下降為最初表現(xiàn)。HRCT是BOS的重要輔助檢查，吸氣和呼氣HRCT 對阻塞性肺疾病的肺損傷有較好的敏感性。BOS 典型HRCT 的主要表現(xiàn)為空氣潴留、支氣管壁增厚、馬賽克灌注征、支氣管擴張，嚴重時可出現(xiàn)皮下及縱隔氣腫等表現(xiàn)[29]。

肺功能檢查是臨床診斷BOS 的主要手段，本研究僅21 例BOS 患兒完成肺功能檢查，F(xiàn)EV1占預計值比值為（51.0±22.3）%，F(xiàn)EV1/FVC 為（77.4±22.1）%，相關研究中發(fā)現(xiàn)25例BOS患者在診斷時，F(xiàn)EV1占預計值比值由移植前（88.3±10.9）%降至（42.2±19.0）%，F(xiàn)EV1/FVC由移植前的（88.9±5.6）%降至（58.1±19.5）%[30]。可見FEV1是監(jiān)測BOS的重要指標，發(fā)生BOS時，F(xiàn)EV1會出現(xiàn)迅速下降。但目前也有報道顯示早期的小氣道病變臨床癥狀多不明顯，肺功能常無明顯異常改變。有研究發(fā)現(xiàn)小氣道功能異常與肺部cGVHD相關，提示存在小氣道功能損害的患者，可能更容易受到肺cGVHD的影響，小氣道功能可能成為預測肺cGVHD的敏感指標[31]。

BOS 為肺部不可逆的表現(xiàn)，病亡率較高。不同文獻報道的病亡率也有很大的差異。在不同的研究中，5年存活率從13.0%到56.0%不等[32]。本研究中BOS 組和Nov-BOS 組OS 和累積復發(fā)率差異均無統(tǒng)計學意義，究其原因一方面可能與本研究中心BOS組隨訪時間較短有關，另一方面跟本中心BOS診療經(jīng)驗提高，對BOS監(jiān)測、干預、治療積極有關。

目前針對BOS的研究主要為回顧性研究，隨著BOS發(fā)生率的逐年升高，未來對于BOS的研究仍有許多工作要做。BOS的早期診斷對改善BOS預后有顯著幫助，有部分前瞻性試驗已顯示出有效性，目前暫不排除有相關基因多態(tài)性與BOS的發(fā)生有關，而發(fā)現(xiàn)這些基因，有望通過靶向治療改善預后。