王飛揚 陳素陽 解家松 姜建湖 郭建林 張海琪

(1. 浙江省淡水水產(chǎn)研究所 浙江湖州 313001; 2. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院 浙江寧波 315211)

銀鯧(Pampusargenteus)屬于鱸形目(Pereiformes),鯧科(Stromateidae), 鯧屬(Pampus), 主要分布于中國東海、南海和黃渤海等地區(qū), 是我國沿海重要的經(jīng)濟(jì)魚類之一(徐善良等, 2012)。銀鯧肉質(zhì)嫩滑、刺少骨軟, 味道鮮美且具有很高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值(王佳等, 2021)。但由于過度捕撈, 其野生種群數(shù)量日漸減少(李建生等, 2014)。銀鯧是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要品種, 目前國內(nèi)寧波地區(qū)已經(jīng)可進(jìn)行銀鯧的全人工養(yǎng)殖。然而, 在銀鯧的規(guī)?；B(yǎng)殖中, 時常暴發(fā)由美人魚發(fā)光桿菌引起的“出血病”(Taoetal, 2018)。美人魚發(fā)光桿菌(Photobacteriumdamselae)曾被稱為美人魚弧菌, 為嗜鹽的革蘭氏陰性菌, 屬于海水中常見的一類條件致病菌, 當(dāng)外界環(huán)境惡化或魚體免疫力下降, 可能導(dǎo)致魚體感染弧菌(張飛等, 2012; 徐勝威等,2020)。美人魚發(fā)光桿菌分兩個亞種: 美人魚亞種(P.damselaesubsp.damselae) (PDD)和殺魚亞種(P.damselaesubsp.piscicida), 美人魚亞種廣泛分布在水生環(huán)境中, 可感染包括爬行動物、鯨類、甲殼類、軟體動物和魚類在內(nèi)的許多生物, 該亞種對人及其他哺乳動物也具有致病性, 其主要引起水生動物的出血性敗血癥, 發(fā)病較快, 死亡率較高(王洪彬等, 2018)。

微生物與生物之間聯(lián)系非常密切, 大多數(shù)微生物生活在動物的消化道中(Batesetal, 2006)。這些微生物主要由細(xì)菌組成, 同時還包括古菌、病毒和真菌等(Sommeretal, 2013)。消化道是魚類攝食和消化吸收的主要場所, 魚類腸道微生物群落有助于消化, 并可以影響宿主魚的營養(yǎng)、生長發(fā)育、繁殖和抗病能力(Mahdietal, 2015)。魚類腸道微生物群落作為魚類特殊的功能器官, 主要取決于宿主、周圍環(huán)境和飲食攝入之間的功能平衡(Sheetal, 2017)。環(huán)境因素, 如溫度、鹽度、pH 等, 對魚類腸道微生物的影響較為顯著(Tarneckietal, 2017)。此外, 遺傳也有一定影響(Wuetal, 2013)。環(huán)境的改變或應(yīng)激反應(yīng)可能會削弱宿主的免疫功能, 進(jìn)而改變腸道微生物群落結(jié)構(gòu), 容易導(dǎo)致外源性致病菌的入侵或內(nèi)源性機(jī)會致病菌大量增殖(Lietal, 2016)。反之, 當(dāng)疾病發(fā)生時, 病原體也會導(dǎo)致腸道微生物群的正常結(jié)構(gòu)改變。

深入了解魚類腸道微生物與其宿主之間的相互作用, 對于理解宿主的生命活動狀態(tài), 尤其是發(fā)生疾病的魚類非常重要。研究病原微生物對宿主腸道微生物的種類和數(shù)目的直接或間接影響, 可幫助及時診斷和治療疾病, 同時也有助于研究病原體的發(fā)展過程和機(jī)理。雖然已有研究表明消化道微生物變化與人類和動物的許多腸道相關(guān)疾病有關(guān)(Gaoetal, 2015),但關(guān)于PDD感染對銀鯧腸道微生物影響的研究卻未見報道。因此, 通過研究PDD感染后銀鯧腸道微生物群落組成的變化, 不僅有利于研究PDD發(fā)病過程和機(jī)制, 而且有助于“出血病”的診斷和治療。

采用擴(kuò)增子測序方法來研究PDD感染對銀鯧腸道微生物群落的動態(tài)變化是一種適宜的選擇。16S rRNA 位于原核細(xì)胞核糖體小亞基上, 含有10 個保守區(qū)(Conserved Regions)和9 個高變區(qū)(Hypervariable Regions), 其中保守區(qū)在不同種類細(xì)菌之間特異性較低, 而高變區(qū)則在屬或種級別上有明顯差異。因此,16S rRNA 序列被廣泛用于鑒定和區(qū)分不同的細(xì)菌物種。16S rRNA 擴(kuò)增子測序技術(shù)通過選擇一個或多個高變區(qū)的保守區(qū)域設(shè)計通用引物用于PCR 擴(kuò)增, 再對高變區(qū)域進(jìn)行測序分析和菌種鑒定, 已成為研究環(huán)境樣本中微生物群落組成結(jié)構(gòu)的重要手段(Lozuponeetal, 2005; Lietal, 2013; Lundbergetal, 2013;Bulgarellietal, 2015)。

本研究通過分析銀鯧對照組和PDD感染組在24 h 和72 h 所采集的中腸和后腸樣本, 采用16S rRNA 基因擴(kuò)增子測序技術(shù)并結(jié)合Illumina Nova 測序平臺進(jìn)行測序和數(shù)據(jù)分析, 研究PDD感染后不同時間銀鯧體內(nèi)微生物群落組成結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化。本研究結(jié)果有助于深入了解PDD感染對銀鯧腸道微生物的影響, 并為銀鯧養(yǎng)殖業(yè)的健康管理提供科學(xué)依據(jù)。同時, 本研究對于探究水產(chǎn)動物腸道微生物的多樣性、功能和相互關(guān)系等問題也有著重要的意義。

1 材料與方法

1.1 銀鯧的飼養(yǎng)與感染實驗

從水產(chǎn)養(yǎng)殖場(寧波象山)采集重量約為(16±4) g的銀鯧, 在曝氣循環(huán)海水中養(yǎng)殖一周。每天早晚各投喂一次顆粒飼料, 每兩天換水一次。

在PDD感染試驗中, 隨機(jī)選取12 只活力旺盛的銀鯧, 其中一半作為對照組, 另一半作為試驗組。參考本實驗室前期已發(fā)表的人工感染方法(Nawazetal,2022), 用100 μL 2.6 × 108CFU/mLPDD細(xì)菌懸浮液進(jìn)行肌肉注射, 感染試驗組的6 只銀鯧, 對照組的6只銀鯧注射等體積的PBS。分別于24 h 和72 h 從這兩個養(yǎng)殖池中采集3 只感染的銀鯧和3 只對照組的銀鯧。每只采集的銀鯧都被保存在冰海水中進(jìn)行低溫麻醉, 然后采集中腸和后腸組織, 包括其內(nèi)容物。每個腸道樣本都用液氮快速冷凍, 并保存在-80 °C 下, 用于進(jìn)一步分析。

1.2 樣本處理

采用Illumina MiSeq 測序技術(shù)對采集到的腸道樣本進(jìn)行細(xì)菌群落組成分析。委托北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行DNA 的提取、PCR 擴(kuò)增、產(chǎn)物純化以及16S rRNA 基因擴(kuò)增, 基于Illumina Nova 測序平臺測序, 構(gòu)建 PCR-free 文庫, 然后進(jìn)行雙末端(Paired-End)測序。具體操作如下:

用SDS 方法提取樣本的基因組DNA, 將生物細(xì)胞破碎后, 加入SDS 使細(xì)胞膜裂解, 讓蛋白質(zhì)變性,從而將蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)與DNA 分開。之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和濃度, 取適量的樣本 DNA 于離心管中, 使用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA 為模板, 根據(jù)測序區(qū)域的選擇, 使用帶 Barcode 的特異引物和 New England Biolabs 公司的Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer, 結(jié)合高效高保真酶進(jìn)行PCR, 確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。PCR 產(chǎn)物使用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測; 對檢測合格的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化, 采用酶標(biāo)定量, 根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣, 充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物, 對目的條帶使用Qiagen 公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。最后使用 TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建, 構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit 和Q-PCR 定量, 文庫合格后, 使用NovaSeq6000 進(jìn)行上機(jī)測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)Barcode 序列和PCR 擴(kuò)增引物序列對樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行拆分, 隨后截去Barcode 和引物序列, 對每個樣本的Reads 進(jìn)行拼接, 從而得到原始Tags 數(shù)據(jù)(Raw Tags), 由于存在一定比例的干擾數(shù)據(jù)(Dirty Data), 為了使信息分析的結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠, 首先對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的拼接、過濾, 從而得到高質(zhì)量的Tags 數(shù)據(jù)(Clean Data), 再經(jīng)過進(jìn)一步過濾及嵌合體序列的去除后, 最終獲得有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)?；谟行?shù)據(jù), 以97%的一致性(Identity)進(jìn)行OTUs (Operational Taxonomic Units)聚類, 隨后對OTUs 的序列進(jìn)行物種注釋, 獲得分類學(xué)信息并分別在各個分類水平: Kingdom(界)、Phylum(門)、Class(綱)、Order(目)、Family(科)、Genus(屬)、Species(種)統(tǒng)計各樣本的群落組成, 得到對應(yīng)的各種物種信息和基于物種的豐度分布情況, 最后再對各樣本的數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理, 以便進(jìn)行后續(xù)的Alpha多樣性分析和Beta 多樣性分析。

在Alpha 多樣性分析中, 使用Qiime 軟件(Version 1.9.1)計算Observed-otus 和Chao1 等指數(shù), 使用R 軟件(Version 2.15.3)繪制稀釋曲線, Rank abundance 曲線, 物種累積曲線并進(jìn)行Alpha 多樣性指數(shù)組間差異分析。在多樣本比較分析(Beta Diversity)中, 使用R軟件(Version 2.15.3)繪制PCA 和NMDS 圖, 探究不同樣本或組別間群落結(jié)構(gòu)的差異。PCA 分析使用R 軟件的ade4 包和ggplot2 軟件包, NMDS 分析使用R 軟件的vegan 軟件包。

2 結(jié)果

2.1 Illumina 測序及銀鯧腸道微生物復(fù)雜度分析

通過測序, 總共獲得了2 365 568 條銀鯧腸道微生物序列, 平均每樣本測得98 565 條tags, 經(jīng)過質(zhì)控處理得到1 950 750 條銀鯧腸道微生物序列, 平均每樣本81 642 條有效數(shù)據(jù), 最終用于后續(xù)分析的質(zhì)控有效數(shù)據(jù)量平均每樣本為63 610 條(51 649～69 729 條質(zhì)控數(shù)據(jù)), 質(zhì)控有效率達(dá)65.00%, 平均讀取長度為255 bp。堿基識別準(zhǔn)確率在99%以上的堿基比例為99.22%～99.74%, 而堿基識別準(zhǔn)確率在99.9%以上的堿基比例為97.70%～99.13%, 測序質(zhì)量高, 適合用于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。以97%的一致性將序列聚類成為OTUs, 共得到4 496 個OTUs (表1)。

表1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果Tab.1 Statics of sequencing

以抽取的測序數(shù)據(jù)量與對應(yīng)的物種數(shù)構(gòu)建稀釋曲線(Rarefaction Curve), 可看到曲線逐漸趨向平坦,說明測序數(shù)據(jù)量合理, 每個樣本都獲得了足夠的采樣深度(圖1a)。構(gòu)建Rank Abundance 曲線, 在水平方向上, 曲線的跨度大, 垂直方向曲線較為平滑, 說明樣本的豐富度較高且分布較均勻度(圖1b)。物種累積箱形圖(species accumulation boxplot)是描述隨著樣本量的增加物種多樣性增加的分析, 其結(jié)果可反映持續(xù)抽樣下新OUT (新物種)出現(xiàn)的速率。隨著樣本量的加大, 箱形圖位置逐漸平緩, 表明抽樣充分, 適合進(jìn)行數(shù)據(jù)分析(圖1c)。

圖1 感染PDD 的銀鯧及對照組銀鯧在24 h、72 h 的中腸和后腸微生物群落的稀疏性分析(a)、Rank Abundance 曲線(b)以及物種累積箱形圖(c)Fig.1 The rarefaction curve (a), the rank abundance curves (b) and the species accumulation boxplots (c) of PDD-infected silver pomfret and healthy silver pomfret at midgut and hindgut microbial communities at 24 h and 72 h

為了估計和比較各樣本中的微生物多樣性, 從OTUs 中計算細(xì)菌豐富度和多樣性指數(shù), 對不同樣本在 97%一致性閾值下的 Alpha Diversity 分析指數(shù)(Chao1、observed_species)進(jìn)行統(tǒng)計、制圖(圖2)。可以看到感染組和對照組的中腸腸道微生物豐富度在72 h 時都有所下降, 而兩組的后腸腸道微生物豐富度在72 h 時均大幅提高, 尤其是感染組, 提高較多; 對照組24 h 及72 h 的中腸樣本的數(shù)據(jù)差異略大, 可能是由于銀鯧的個體差異造成, 而感染組的差異較小,可能是由于PDD感染引起腸道微生物菌群的變化導(dǎo)致; 對比G2 和G4、G6 和G8, 隨著PDD感染時間的增加, 樣本個別數(shù)據(jù)差異有所加大, 說明PDD感染可能會引起銀鯧腸道微生物紊亂。

圖2 Chao1 指數(shù)組間差異箱形圖(a)和observed_species 指數(shù)組間差異蜜蜂群圖(b)Fig.2 Chao1 Boxplot of differences between groups (a);observed_species index bee colonies of differences between groups (b)

2.2 PDD 感染導(dǎo)致銀鯧腸道微生物組成變化

為了探究PDD感染對銀鯧腸道微生物結(jié)構(gòu)的影響, 根據(jù)前兩個主成分(PC1 和PC2)構(gòu)建了銀鯧腸道樣本微生物群落組成的PCA 分析(圖3a)。從PCA 圖(圖3a)看出, G1 和G3 樣本位置主要在右上方區(qū)域附近, G2 和G4 樣本位置主要在左下方區(qū)域附近, 顯示出了PDD感染后中腸與對照組中腸微生物結(jié)構(gòu)的差異性; 而PDD感染組的后腸樣本比對照組的表現(xiàn)出更多的離散性。為了克服線性模型(PCA)的缺點, 更好反映數(shù)據(jù)的非線性結(jié)構(gòu), 根據(jù)樣本中的物種信息,進(jìn)行NMDS 分析(圖3b)。NMDS 圖(圖3b)顯示, G1和G3 樣本位置主要聚集在方框內(nèi), G2 和G4 樣本在左上方靠近坐標(biāo)軸的位置; G5 和G7 樣本位置主要分布在橫坐標(biāo)軸上下, 而G6 和G8 樣本位置較為離散,和PCA 分析結(jié)果相似。

圖3 銀鯧腸道樣本微生物群落組成的PCA 分析(a)和NMDS 分析(b)Fig.3 The PCA analysis (a) and The NMDS analysis (b) of microbial community composition of silver pomfret intestinal samples

為了進(jìn)一步揭示PDD感染對銀鯧腸道微生物群落組成的影響, 對銀鯧腸道在屬和門水平上對主要微生物的相對豐度進(jìn)行了分析(圖 4、圖 5)。結(jié)果表明35.19%的有效序列被注釋到屬水平, 其中占據(jù)優(yōu)勢地位的主要有弧菌屬(Vibrio)、發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)、未定義藍(lán)藻門屬(unidentified_Chloroplast)和不動桿菌屬(Acinetobacter) (圖4)。屬水平微生物豐度圖顯示, 24 h 時感染組的中腸和后腸樣本中發(fā)光桿菌屬比對照組的更少, 大多都是未定義藍(lán)藻門屬或弧菌屬占主導(dǎo)地位, 而在72 h 時發(fā)光桿菌屬才逐漸增多, 且后腸中發(fā)光桿菌屬增長得更快;對照組的腸道內(nèi)也有發(fā)光桿菌屬的存在, 但一般不會隨時間增多, 絕大部分都在72 h 時出現(xiàn)減少(圖4)。而77.18%的有效序列被注釋到門水平, 占據(jù)主導(dǎo)地位的主要包括變形菌門(Proteobacteria)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、厚壁菌門( Firmicutes )和放線菌門(Actinobacteriota) (圖5)。通過門水平上微生物的平均相對豐度圖(圖5b)可以看出, 感染組和對照組中腸樣本中的變形菌門在72 h時對比24 h 時都有所減少, 而藍(lán)藻門均有所增加; 后腸樣本中變形菌門在72 h 時均有所增加, 而藍(lán)藻門均有所減少, 結(jié)合屬水平腸道微生物豐富度圖(圖4),已知發(fā)光桿菌屬和弧菌屬都是屬于變形菌門, 于是可以得出以下結(jié)論, 對照組中腸中發(fā)光桿菌的減少以及感染組中腸中弧菌的減少可能導(dǎo)致了兩組中腸樣本中變形菌門的減少, 而后腸中感染組發(fā)光桿菌在72 h 的大量增加及對照組72 h 時未定義藍(lán)藻門屬的減少可能是后腸中變形菌門增多的原因, 這種變化可能是感染組腸道內(nèi)PDD的大量增殖所導(dǎo)致; 不同于對照組72 h 時中腸樣本中厚壁菌門的減少, 感染組中腸中厚壁菌門在72 h 增多了, 但感染組后腸樣本中厚壁菌門在72 h 則減少了, 這也可能是由于PDD感染引起; 再結(jié)合門水平上微生物的豐富度圖(圖5a)進(jìn)行分析, 當(dāng)樣本中的藍(lán)藻門較多時, 變形菌門則相對較少, 說明藍(lán)藻門與變形菌門之間可能存在競爭關(guān)系, 而PDD感染可能會影響這種競爭關(guān)系。

圖4 感染PDD 的銀鯧及對照組銀鯧在24 h、72 h 的中腸和后腸屬水平微生物的相對豐度(a)以及平均相對豐度(b)Fig.4 The relative abundance (a) and The mean relative abundance (b) of microorganisms at the midgut and hindgut of PDD-infected silver pomfret and control group silver pomfret at 24 h and 72 h at the genus level

圖5 感染PDD 的銀鯧及對照組銀鯧在24 h、72 h 的中腸和后腸門水平微生物的相對豐度(a)以及平均相對豐度(b)Fig.5 The relative abundance (a) and The mean relative abundance (b) of microorganisms at the midgut and hindgut of PDD-infected silver pomfret and control group silver pomfret at 24 h and 72 h at the phylum level

3 討論

腸道微生物群落在宿主的消化和免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用(Gangulyetal, 2012)。在迄今為止正式描述的所有細(xì)菌門中, 變形菌門、梭桿菌門、厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門主要出現(xiàn)在魚類腸道菌群中(Ghanbarietal, 2015), 這與我們的研究結(jié)果相符合。在魚類腸道微生物中, 由于魚類不同的食性, 因而存在滿足不同營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的標(biāo)志性微生物, 蛋白酶和脂肪酶有助于肉食性魚類的消化吸收, 所以在肉食性魚類的腸道菌群中往往會存在單胞桿菌屬、鯨桿菌屬(Cetobacterium)等微生物(孟曉林等, 2019;駱啟豪等, 2021)。銀鯧為廣食性魚類, 主要攝食橈足類、頭足類、蝦類、水母類、箭蟲、幼魚和浮游動物等(彭士明等, 2011)。本研究中, 單胞桿菌屬、鯨桿菌屬在銀鯧的腸道內(nèi)都有發(fā)現(xiàn), 與前人研究結(jié)果一致。此外, 本研究還在銀鯧腸道菌群中發(fā)現(xiàn)了較多的藍(lán)藻門微生物, 其來源可能與銀鯧攝食浮游動物有關(guān),而其較多的豐富度可能與養(yǎng)殖銀鯧腸道菌群中產(chǎn)纖維素酶的微生物種類較少有關(guān)(王建建等, 2014)。

研究結(jié)果顯示, 銀鯧腸道微生物中的大多數(shù)都分類于變形菌門, 這與過去的發(fā)現(xiàn)相符(Wuetal,2010; Roeselersetal, 2011)。變形菌門包含了弧菌科,在銀鯧腸道中, 弧菌科被確定為豐富度最大的科, 這一發(fā)現(xiàn)與海洋魚類群落中肉食性魚類腸道微生物群的其他研究一致(Sullametal, 2012)?；【鷮俦粴w類于弧菌科, 弧菌作為一種廣泛分布于自然水域的條件致病菌, 易存在于雜食性海洋生物的體表和體內(nèi)(陳梅等, 2002)。本研究結(jié)果顯示銀鯧的部分腸道樣本中發(fā)現(xiàn)了弧菌, 但在養(yǎng)殖過程中并未發(fā)生疾病, 其可能作為一種正常菌群而存在于魚類的腸道中(駱啟豪等,2021)。發(fā)光桿菌屬細(xì)菌也屬于弧菌科, 相關(guān)研究結(jié)果表明幾種密切相關(guān)的發(fā)光桿菌菌株在大西洋鱈魚的腸道中占絕大多數(shù)(Le Doujetetal, 2019)。而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)健康銀鯧腸道中也存在發(fā)光桿菌屬細(xì)菌,它們很可能也屬于正常銀鯧腸道微生物組成的一部分, 且通常不會導(dǎo)致銀鯧發(fā)病。而在PDD感染后, 發(fā)光桿菌屬在感染組銀鯧腸道中的比例先小幅度減少,隨后呈現(xiàn)持續(xù)增加的趨勢, 到感染后72 h 時在鯧腸中腸和后腸中占據(jù)主要優(yōu)勢, 這很可能是由于PDD感染后, 隨著其在銀鯧體內(nèi)增殖, 進(jìn)入腸道, 影響了腸道中的其他發(fā)光桿菌屬細(xì)菌的正常增殖, 最后PDD逐漸占據(jù)優(yōu)勢并在腸道內(nèi)大量增殖。

上述研究結(jié)果表明, 銀鯧感染PDD后, 病原體侵入腸道并可能與其他發(fā)光桿菌屬產(chǎn)生了競爭。親緣關(guān)系相近的細(xì)菌之間可能有著相似的生態(tài)位, 因此它們之間存在天然的競爭關(guān)系(查繼偉, 2019)。Li 等(2018)的發(fā)現(xiàn)也顯示了生態(tài)位和適應(yīng)性差異對病菌侵入的重要性。大腸桿菌和沙門氏菌同為腸桿菌科,Eberl 等(2021)發(fā)現(xiàn)大腸桿菌可通過競爭限制性碳源來抑制鼠傷寒沙門氏菌的定植。銀鯧腸道中PDD和其他發(fā)光桿菌屬之間很有可能也存在這種競爭關(guān)系,此外同為弧菌科的發(fā)光桿菌屬和弧菌屬之間可能也是如此, 24 h 時銀鯧中腸和后腸內(nèi)弧菌屬和發(fā)光桿菌屬其中一屬處于壓倒性優(yōu)勢時, 另一屬的豐富度則會更低; 同樣地,PDD感染72 h 后腸道內(nèi)PDD的大量增殖很可能抑制了弧菌屬, 導(dǎo)致其豐富度大幅下降。此外, 我們發(fā)現(xiàn)不同門的微生物之間也存在這種此消彼長的關(guān)系, 可觀察到當(dāng)腸道內(nèi)藍(lán)藻門較多時,變形菌門就會較少; 變形菌門多, 則藍(lán)藻門較少。王建建等(2014)曾在野生銀鯧腸道檢測出產(chǎn)消化酶的菌株, 主要以產(chǎn)纖維素酶和淀粉酶為主。因此推測此現(xiàn)象可能與變形菌門中含有產(chǎn)纖維素酶和淀粉酶等消化酶的菌株存在有關(guān), 這些菌株較多時, 會減少藍(lán)藻門的數(shù)量。

動物宿主腸道微生物的平衡對維持宿主健康及其抗病能力高低密切相關(guān)(De Schryveretal, 2014)。PDD感染后, 感染組銀鯧中腸中厚壁菌門、擬桿菌門、藍(lán)藻門的相對豐度增加, 變形菌門的相對豐度減少; 后腸中變形菌門、擬桿菌屬、黏球菌門(Myxococcota)的相對豐度增加, 厚壁菌門、藍(lán)藻門的相對豐度減少,且感染組的中腸和后腸樣本各時間點的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化大多比對照組更為離散, 并隨著時間的推移,腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的離散性逐漸增大, 這可能與PDD的過度生長有關(guān), 其改變了在患病銀鯧腸道定植的其他微生物群的相對豐度, 破壞了腸道微生物的正常平衡。

一方面, 研究發(fā)生疾病時的腸道微生物構(gòu)成與原本健康狀態(tài)下腸道微生物群的差異或許可以為疾病的診斷提供新的視角, 然而, 目前PDD導(dǎo)致銀鯧發(fā)病的機(jī)理, 特別是發(fā)病過程中如何引起腸道微生物結(jié)構(gòu)改變的, 目前還尚不清楚。另一方面, 對于疾病的防治, 是否可以通過增強(qiáng)魚類腸道微生物群落的穩(wěn)定性, 從而預(yù)防病原體感染; 或是在發(fā)病過程中,能否調(diào)節(jié)腸道菌群, 引入有益菌與病菌競爭, 進(jìn)而抑制病原微生物的增殖, 使疾病向有利于宿主的方向轉(zhuǎn)歸。這些問題還需要更加深入地研究。

4 結(jié)論

綜上, 16S rRNA 擴(kuò)增子測序分析結(jié)果顯示PDD感染可引起銀鯧體內(nèi)腸道微生物的動態(tài)變化。PDD的侵入及在銀鯧腸道中的增殖打破了原本腸道微生物的競爭平衡。這些結(jié)果表明, 美人魚發(fā)光桿菌病隨著感染時間的延長而逐漸發(fā)展,PDD的過度生長與腸道微生物群落構(gòu)成失調(diào)密切相關(guān), 這顯示了腸道微生物群落結(jié)構(gòu)平衡的重要性。但是病原微生物與宿主及腸道微生物的關(guān)系, 以及它們之間如何相互影響,有待進(jìn)一步研究。