王庚申 顏 懿 李 彤 董鵬生 謝建軍許文軍 張德民 張化俊 ①

(1. 寧波大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江寧波 315211; 2. 寧波大學(xué)海洋學(xué)院 浙江寧波 315211; 3. 浙江省海洋水產(chǎn)研究所 浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江舟山 316021)

為了防控凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)的傳染性疾病, 對(duì)源水消毒是養(yǎng)殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。漂白粉是對(duì)蝦養(yǎng)殖源水消毒中常用的一種鹵素類消毒劑, 具有價(jià)格低、殺菌力強(qiáng)、使用方便等特點(diǎn)。漂白粉是氫氧化鈣、氯化鈣、次氯酸鈣的混合物, 溶解在水中時(shí)水解成次氯酸離子和氯離子。次氯酸離子的強(qiáng)氧化作用可以殺死細(xì)菌, 氯離子也表現(xiàn)出一定的殺菌功能(Maetal, 2019)。研究表明, 大多數(shù)病原對(duì)次氯酸鈣敏感, 且殺菌效果與劑量有關(guān)(Parketal, 2004;Limsuwanetal, 2008; Chaetal, 2012)。一般認(rèn)為, 對(duì)養(yǎng)殖源水消毒可以有效去除病原微生物, 但由于消毒機(jī)制的非特異性, 水體中的有益微生物也會(huì)被殺滅。由于細(xì)菌類群生理及群落組成的多樣性, 水體中不同的微生物類群會(huì)對(duì)消毒表現(xiàn)出不同的響應(yīng)或恢復(fù)能力(Becerra-Castroetal, 2016)。目前, 對(duì)消毒后養(yǎng)殖源水細(xì)菌群落的恢復(fù)動(dòng)態(tài)仍知之甚少。

抗生素抗性基因(antibiotic resistant genes, ARGs)可以通過(guò)水平轉(zhuǎn)移將移動(dòng)遺傳元件轉(zhuǎn)至病原菌中,使病原菌產(chǎn)生抗生素抗性, 威脅公共衛(wèi)生健康(Joet al, 2021)。由于河流匯入及水產(chǎn)養(yǎng)殖活動(dòng), ARGs 在近海海區(qū)環(huán)境中普遍存在(Hedbergetal, 2018), 近海養(yǎng)殖源水是對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘環(huán)境中ARGs 的主要來(lái)源(夏濤濤等, 2022), 在華南及華東地區(qū)的對(duì)蝦養(yǎng)殖源水中均檢測(cè)到了多種養(yǎng)殖中常見抗生素的ARGs (Wangetal, 2019a; Yuanetal, 2019)。近幾年, 城市污水、飲用水處理領(lǐng)域的研究顯示, 氯消毒可以有效降低水中的ARGs 豐度(Yoonetal, 2017; Wangetal, 2020), 水產(chǎn)養(yǎng)殖用水消毒的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)(趙曉雨等,2021)。但氯消毒不能完全去除水體中的ARGs (Yuanetal, 2015), 即使攜帶ARGs 的細(xì)菌被殺滅, ARGs 仍可以釋放到水環(huán)境中通過(guò)水平轉(zhuǎn)移進(jìn)行傳播(姜瀚集等, 2019)。然而, 關(guān)于養(yǎng)殖源水消毒后ARGs 豐度的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律尚未見報(bào)道。

養(yǎng)殖水體細(xì)菌群落是對(duì)蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)的重要組成,對(duì)維持水質(zhì)穩(wěn)定及對(duì)蝦健康具有重要意義(杜世聰?shù)?2019)。一般認(rèn)為, 源水進(jìn)入養(yǎng)殖系統(tǒng)后除改善水體理化因子外, 也會(huì)影響水體微生物群落組成(Heyseetal,2021)。有研究報(bào)道氯消毒會(huì)引起水體細(xì)菌類群的異常增殖, 當(dāng)消毒后病原菌和耐抗生素細(xì)菌增殖時(shí), 可能導(dǎo)致潛在的微生物健康風(fēng)險(xiǎn)(Linetal, 2016; Dengetal, 2019; Wangetal, 2021a)。因此, 了解漂白粉消毒后養(yǎng)殖源水細(xì)菌群落、病原菌及抗生素抗性基因的恢復(fù)動(dòng)態(tài), 尤其是不同消毒濃度的影響, 對(duì)優(yōu)化對(duì)蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)微生物管控策略具有重要的指導(dǎo)作用?；诖? 本研究利用不同濃度漂白粉消毒養(yǎng)殖源水, 通過(guò)高通量測(cè)序比較消毒前后養(yǎng)殖源水的理化因子、細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及病原菌豐度變化, 同時(shí)利用RT-qPCR 檢測(cè)養(yǎng)殖源水ARGs 的豐度變化, 探究源水細(xì)菌群落對(duì)不同濃度漂白粉消毒后的響應(yīng)特征, 以期為對(duì)蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)中漂白粉的使用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)在浙江省海洋水產(chǎn)研究所試驗(yàn)場(chǎng)進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)用對(duì)蝦養(yǎng)殖源水取自周邊海域, 溫度27.3～ 27.9 °C,鹽度25.5～25.7, pH 8.25～8.21。漂白粉購(gòu)自湖北省應(yīng)城市利必康化工有限公司, 有效氯含量28%～35%。

實(shí)驗(yàn)在室內(nèi)300 L 塑料水槽中進(jìn)行, 共設(shè)置2 個(gè)高、低漂白粉消毒濃度: 60、20 mg/L, 每組4 個(gè)重復(fù)。消毒前(DC)、消毒后余氯衰減至0.1 mg/L 時(shí)0～3 d(D0、D1、D2、D3)定時(shí)取2 L 水樣, 1 L 用于水質(zhì)理化指標(biāo)測(cè)定; 1 L 用0.22 μm 濾膜過(guò)濾后保存于-80 °C,用于檢測(cè)微生物和抗性基因。

采用HANNA HI-97734 余氯和總氯便攜光度計(jì)(DPD 法, 量程0.00～10.00 mg/L, 精度為±0.03 mg/L)測(cè)定水體中的余氯濃度; 用YSI Pro2030 測(cè)定水體溶解氧, YSI Pro10 測(cè)定水體pH。水體理化因子化學(xué)需氧量(COD)采用堿性高錳酸鉀法, 氨氮采用靛酚藍(lán)分光光度比色法, 亞硝酸鹽氮(NO2-N)采用萘乙二胺分光光度法, 硝酸鹽氮(NO3-N)采用鋅-鉻還原法, 活性磷酸鹽(AP)用磷鉬藍(lán)分光光度法測(cè)定。

1.2 DNA 提取、高通量測(cè)序

使用PowerSoil ?Pro Kit (Qiagen)試劑盒提取水樣DNA, 通過(guò)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取DNA 的質(zhì)量, 用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 的濃度和純度。用帶Barcode 的338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGC AG-3′)和806R (5′-GGACTA CHVGGGTWTCTAAT-3′)引物對(duì)細(xì)菌16S rRNA 的V3～V4 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增條件: 98 °C 預(yù)變性30 s; 98 °C 變性15 s,50 °C 退火30 s, 72 °C 延伸30 s, 27 個(gè)循環(huán); 72 °C 延伸5 min。反應(yīng)體系(25 μL): 5 μL 5×High GC Buffer、5 μL 5×Reaction Buffer、2 μL 10 mmol/L dNTPs、2 μL引物(10 μmol/L )、0.25 μL FastPfu 聚合酶; 2 μL 模板DNA, 滅菌雙蒸水補(bǔ)足25 μL。PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化、定量后, 使用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 建庫(kù), 構(gòu)建的文庫(kù)經(jīng)質(zhì)檢和定量后, 使用 Illumina NovaSeq 平臺(tái)PE250 進(jìn)行雙端測(cè)序。

1.3 測(cè)序數(shù)據(jù)處理

使用QIIME2 2021.2 版本對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制, 去除接頭, 利用DADA2 插件去噪, 并生成擴(kuò)增子序列變體(ASV)表。以每個(gè)ASV 中豐度最高的作為代表序列, 在SILVA138 數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)確定其所屬類群。去除葉綠體(Chloroplast)、線粒體(Mitochondria)及未被鑒定的ASVs, 共獲得了2933 個(gè)ASVs。

1.4 水環(huán)境細(xì)菌病原數(shù)據(jù)庫(kù)分析

將實(shí)驗(yàn)樣品中每個(gè)ASV 的代表序列在水環(huán)境細(xì)菌病原數(shù)據(jù)庫(kù)(DPiWE, dayuz.com) (董鵬生等,2021)進(jìn)行BLAST 比對(duì)、注釋, 參數(shù)閾值E-value＜1×10-6, 序列同源性＞98.5%, 最后輸出病原菌比對(duì)信息, 共比對(duì)獲得病原菌169 個(gè)ASV。由于數(shù)據(jù)庫(kù)注釋信息的差異, 所得病原菌序列以病原菌庫(kù)的注釋信息為準(zhǔn)。

1.5 抗性基因檢測(cè)

采用Real-time qPCR 方法對(duì)常見的8 種ARGs(表1)進(jìn)行定量分析。qPCR 在羅氏LightCycler480 上使用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix (Vazyme)進(jìn)行, 反應(yīng)體系: 10 μL 2×SYBR real-time PCR premixture、0.8 引物(10 μmol/L)、1 μL 模板DNA, 滅菌雙蒸水補(bǔ)足20 μL。PCR 反應(yīng)條件: 95 °C 5 min;95 °C 15 s, 55～62 °C 30 s, 72 °C 30 s, 40 個(gè)循環(huán), 之后進(jìn)行熔解曲線分析。通過(guò)Ct 值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算基因拷貝數(shù), 以每毫升養(yǎng)殖源水的拷貝數(shù)來(lái)測(cè)定ARGs 的濃度。

表1 抗生素抗性基因及RT-PCR 引物Tab.1 Antibiotic resistance genes and RT-PCR primers

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)Bray-Curtis 距離進(jìn)行非度量多維尺度分析(NMDS)分析, 展示漂白粉消毒后水體細(xì)菌群落的演替規(guī)律。基于Bray-Curtis 距離的相似性分析(ANOSIM)分析各組細(xì)菌群落的相似性。通過(guò)R 中的“pheatmap”軟件包繪制熱圖。使用“psych”軟件包計(jì)算類群相關(guān)性矩陣, 保留皮爾森相關(guān)性系數(shù)|r|＞0.6, 且P＜0.05 的數(shù)據(jù)矩陣, 使用Gephi(v0.9.2)構(gòu)建微生物群落的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò), 并進(jìn)行加權(quán)隨機(jī)模塊化網(wǎng)絡(luò)分析。利用SPSS 20.0 在用單因素方差分析(one-way ANOVA)分析樣品間ARGs 豐度的差異(P＜0.05)。

2 結(jié)果

2.1 消毒前后對(duì)蝦養(yǎng)殖源水水體理化因子變化

實(shí)驗(yàn)期間, 對(duì)蝦養(yǎng)殖源水溫度在27.5～32.9 °C,鹽度在漂白粉消毒后小幅升高, 高濃度組始終高于低濃度組; 溶解氧、化學(xué)需氧量濃度在消毒后(D0)迅速下降并保持穩(wěn)定; pH、硝酸鹽濃度在消毒后(D0)升高隨后保持穩(wěn)定; 亞硝酸鹽濃度在消毒后(D0)升高,之后大幅震蕩, 氨氮濃度則在消毒后緩慢上升; 活性磷酸鹽濃度在消毒后出現(xiàn)分化, 低濃度消毒組始終高于高濃度組(圖1)。

圖1 消毒前后對(duì)蝦養(yǎng)殖源水水質(zhì)理化因子變化Fig.1 Changes of physicochemical factors of shrimp source water before and after bleaching powder disinfection

2.2 消毒前后對(duì)蝦養(yǎng)殖源水的細(xì)菌群落組成

消毒后, 高、低濃度組細(xì)菌類群門水平組成均發(fā)生了顯著的變化, 擬桿菌門(Bacteroidota)的相對(duì)豐度較消毒前均顯著升高(P＜0.05), 高濃度組變形菌門(Proteobacteria)的相對(duì)豐度則顯著下降(P＜0.05) (圖2a)。消毒前(DC), 高濃度組養(yǎng)殖源水的主要門類包括變形菌門(53.71%)、擬桿菌門(27.15%)、放線菌門(Actinobacteriota, 9.32%)、Patescibacteria (1.84%)及藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria, 1.46%)等; 消毒后余氯衰減至0.1 mg/L 時(shí)(D0), 優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門(25.54%)、擬桿菌門(73.91%)。而低濃度組在消毒前(DC)的主要門類為變形菌門(74.74%)、擬桿菌門(12.76%)、藍(lán)菌門(7.34%)、放線菌門(2.76%)及Patescibacteria (1.55%)等; 消毒后(D0), 優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門(69.26%)、擬桿菌門(29.19%)。消毒后第1～2 天, 高濃度組的優(yōu)勢(shì)菌門以變形菌門(79.90%、51.17%)、擬桿菌門(19.83%、44.85%)為主, 而低濃度組則以變形菌門為優(yōu)勢(shì)菌, 相對(duì)豐度達(dá)到了98.78%、95.78%。至第3天, 高濃度組的優(yōu)勢(shì)菌門均以變形菌門(91.58%)、蛭弧菌門(Bdellovibrionota) (5.17%)、擬桿菌門(2.19%)為主, 低濃度組的優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門(87.92%)、蛭弧菌門(6.34%)、擬桿菌門(2.79%)、Patescibacteria(1.67%)。

圖2 消毒前后對(duì)蝦養(yǎng)殖源水細(xì)菌群落相對(duì)豐度圖Fig.2 Relative abundance of bacterial community in shrimp source water before and after bleach disinfection

從屬水平看(圖2b), 消毒前高低濃度組養(yǎng)殖源水的優(yōu)勢(shì)菌屬包括Thalassococcus、Nautella、unclassified Stappiaceae、Candidatus_Aquiluna、Erythrobacter、Synechococcus_CC9902、Hymenobacter、Phaeodactylibacter,以上菌屬的總相對(duì)豐度在高、低濃度組分別占比27.80%、29.61%。消毒后第0～2 天, 高濃度組中薄層菌屬(Hymenobacter, 19.77%～73.88%) 和Nautella(5.26%～55.98%)交替占據(jù)優(yōu)勢(shì), 第3 天, 薄層菌屬豐度迅速下降。而低濃度組中薄層菌屬(29.06%)僅在第0 天占據(jù)優(yōu)勢(shì),Nautella(37.40%～78.34%)則在第1～2天維持優(yōu)勢(shì)。消毒后第2 天, 高、低濃度組的小紅卵菌屬(Rhodovulum)豐度開始升高, 第3 天在兩組中均占據(jù)優(yōu)勢(shì)(24.08% 、 14.52%), 其次是Nautella(22.00%、12.12%)。

在ASV 水平上(圖3), 源水細(xì)菌群落中相對(duì)豐度最高的50 個(gè)ASVs 主要?dú)w類于紅桿菌科Rhodobacteraceae(16 個(gè))、交替單胞菌科Alteromonadaceae (4 個(gè))、黃桿菌科Flavobacteriaceae (3 個(gè))和Nitrincolaceae (3 個(gè)),其中21 個(gè)ASVs 在消毒后相對(duì)豐度下降, 22 個(gè)ASVs相對(duì)豐度升高。消毒后, ASV848 (Nautella)在高、低濃度組的相對(duì)豐度均較消毒前顯著上升, 歸類于薄層菌屬的ASV1561、ASV953 的相對(duì)豐度在第1 天顯著升高, 之后開始下降; 紅桿菌科的 ASV1480、ASV1249、ASV2053 僅在高濃度組顯著下降,ASV1764 (小紅卵菌屬)則在高濃度組中顯著上升。

圖3 消毒前后對(duì)蝦養(yǎng)殖源水中的優(yōu)勢(shì)ASVs 熱圖(相對(duì)豐度前50 個(gè)ASVs)Fig.3 Dominant ASVs of shrimp source water before and after bleaching powder disinfection (top 50 ASVs in relative abundance)

2.3 消毒前后細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)演替特征

基于Bray-Curtis 距離的NMDS 分析發(fā)現(xiàn)消毒后水體細(xì)菌群落與消毒前分區(qū)明顯, 而高、低濃度組未完全分離(圖4); ANOSIM 分析也發(fā)現(xiàn), 消毒前、后細(xì)菌群落差異顯著(P＜0.05), 而消毒后高、低濃度之間差異不顯著(P＞0.05)。

圖4 基于Bray-Curtis 距離的NMDS 分析水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.4 NMDS analysis of bacterial community structure in source water based on the Bray-Curtis distance

2.4 消毒前后水體細(xì)菌群落的共現(xiàn)模式

消毒前及高、低濃度組消毒后的水體細(xì)菌群落的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)包含425、238、348 個(gè)節(jié)點(diǎn), 分別由1 776、1 137、1 958 個(gè)邊連接(圖5a～5c, 表2), 說(shuō)明消毒后節(jié)點(diǎn)減少, 低濃度消毒會(huì)增加群落間的相互作用。相比消毒前, 消毒后水體細(xì)菌群落共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的模塊化系數(shù)、平均聚類系數(shù)降低, 而其他網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)則升高; 消毒后, 除了網(wǎng)絡(luò)直徑外, 高濃度組共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的平均聚類系數(shù)、平均路徑長(zhǎng)度、平均度均低于低濃度組。高、低濃度組的網(wǎng)絡(luò)分別由6 個(gè)主要模塊構(gòu)成,分別占整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的69.74% (9.24%～13.87%)、79.38%(8.33%～18.39%), 而對(duì)照組模塊較為平均, 模塊Ⅰ到模塊Ⅵ僅占整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的26.6% (4%～4.71%)。

圖5 消毒前后水體微生物群落共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Co-occurrence network of bacterial communities

表2 共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)Tab.2 Topological parameters of co-occurrence networks of water bacterial communities before and after bleaching powder disinfection

2.5 消毒前后水體病原菌的組成

使用DPiWE 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)消毒前后的水體細(xì)菌高通量測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行序列比對(duì)和病原菌物種注釋, 消毒前水體病原菌有23 屬, 總序列數(shù)為6 461; 消毒后高濃度組病原菌有37 屬, 總序列數(shù)為2 912, 低濃度組有31 屬, 總序列數(shù)為6 584, 說(shuō)明消毒后病原菌種類增加, 而高濃度組總序列數(shù)顯著下降。

對(duì)蝦養(yǎng)殖源水的優(yōu)勢(shì)病原菌(平均相對(duì)豐度大于0.01%)豐度占總病原菌豐度的95.59%, 其中50%為魚類病原, 50%為跨宿主共患病病原。消毒前, 優(yōu)勢(shì)病原菌為假埃希氏菌(Pseudescherichia, 1.56%)、微球菌屬(Micrococcus, 0.53%)、Thalassobius(0.23%)等; 消毒后, 高濃度組的優(yōu)勢(shì)病原菌Thalassobius(0.32%)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter, 0.10%), 低濃度組則為Thalassobius(0.88%) 、 假 交 替 單 胞 菌 屬(Pseudoalteromonas, 0.13%)等。水中優(yōu)勢(shì)病原菌在消毒后具有一定時(shí)間上的差異, 而Thalassobius在高、低濃度組均逐漸占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。值得一提的是, 弧菌屬(Vibro)病原菌的相對(duì)豐度在消毒后明顯下降, 但在源水中仍存在(圖6)。

圖6 消毒前后病原菌的相對(duì)豐度堆積圖Fig.6 Relative abundance of pathogenic bacteria before and after bleaching powder disinfection

2.6 消毒前后抗性基因的動(dòng)態(tài)變化

本研究中, 4 大類8 個(gè)ARGs 在消毒前的養(yǎng)殖源水中均有檢出(圖7),tetA 是豐度最高的ARG, 達(dá)到107copies/mL,cfr是豐度最低的ARG (102copies/mL),其他ARGs 的豐度在103～104copies/mL 水平。消毒后, 余氯衰減至0.1 mg/L 時(shí)(D0), 高、低濃度組sul1、floR、cfr、tetQ 的豐度較消毒前(DC)顯著下降(P＜0.05),而tetA、strB、cmlA、sul2 的豐度變化趨勢(shì)在高、低濃度組出現(xiàn)分化。sul1、floR 的豐度均在隨后的1～2 d內(nèi)恢復(fù)到消毒前的數(shù)量級(jí)水平, 而cfr、tetQ 基因在實(shí)驗(yàn)期間未能恢復(fù)到消毒前的數(shù)量級(jí)。

圖7 消毒前后8 種ARGs 的動(dòng)態(tài)變化Fig.7 Changes of abundances of 8 ARGs before and after bleaching powder disinfection

3 討論

含氯消毒劑在海水養(yǎng)殖疾病預(yù)防中的應(yīng)用已被養(yǎng)殖業(yè)者廣泛接受, 但由于水體中不同細(xì)菌對(duì)消毒劑的敏感性存在差異, 消毒后水體的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的恢復(fù)動(dòng)態(tài)值得關(guān)注。研究表明, 氯消毒會(huì)改變飲用水的細(xì)菌群落組成, 降低群落結(jié)構(gòu)多樣性(Holingeret al, 2014; Daietal, 2020)。Becerra-Castro 等(2016)研究發(fā)現(xiàn)紫外線、臭氧及光催化臭氧化等多種方式消毒城市污水和地表水, 3 d 后的兩種類型水體的變形菌門豐度明顯上升。Duan 等(2020)報(bào)道漂白粉消毒對(duì)蝦育苗用水5 d 后, 變形菌門和擬桿菌門豐度上升, 放線菌門豐度下降。本研究中, 漂白粉消毒后養(yǎng)殖源水的細(xì)菌群落與消毒前差異顯著, 但高低濃度組之間無(wú)顯著差異。消毒后(D0), 高濃度組變形菌門豐度明顯下降, 擬桿菌門占據(jù)主導(dǎo)地位, 而低濃度組變形菌門豐度無(wú)明顯變化, 說(shuō)明高濃度漂白粉對(duì)變形菌門的殺滅效果更強(qiáng), 存在劑量依賴效應(yīng)。消毒后第3 天,高、低濃度組細(xì)菌群落組成趨于一致, 變形菌門豐度占據(jù)優(yōu)勢(shì), 表明消毒后變形菌門類群可快速恢復(fù)。共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性代表了不同樣本微生物群落之間的根本差異(Shietal, 2016), 網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)可以表征微生物之間的相互作用(Barberánetal, 2012)。漂白粉消毒后, 細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)量減少, 模塊化程度降低,說(shuō)明消毒降低了細(xì)菌的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜程度。低濃度組共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)之間的連接最為復(fù)雜, 并且網(wǎng)絡(luò)中心性最高, 表明消毒后低濃度的水體細(xì)菌群落穩(wěn)定性高于高濃度組。

從屬水平看, 消毒后(D0)養(yǎng)殖源水優(yōu)勢(shì)屬的數(shù)量減少, 但總相對(duì)豐度增加, 與Wan 等(2022)的研究結(jié)果一致。屬水平的變化趨勢(shì)與ASV 水平相似, 主要由單個(gè)或幾個(gè)優(yōu)勢(shì)ASV 的豐度變化主導(dǎo)。消毒后0～2 d, 薄層菌屬和Nautella在占據(jù)主導(dǎo)地位, 高濃度組薄層菌屬豐度高于低濃度組; 第3 天, 小紅卵菌屬在高低濃度組均占據(jù)優(yōu)勢(shì), 其次是Nautella豐度, 且高濃度豐度均高于低濃度組。有研究認(rèn)為, 薄層菌屬具有輻射抗性, 能適應(yīng)多種極端環(huán)境(Collinsetal,2000)。Nautella常見于海水養(yǎng)殖環(huán)境及對(duì)蝦腸道中(李秋芬等, 2011; Sakamietal, 2014; Zhengetal,2016), 但尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)凡納濱對(duì)蝦的致病性。小紅卵菌屬是一類光養(yǎng)細(xì)菌, 分泌多種殺菌活性物質(zhì), 對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物有益生作用(Looetal, 2013; Changetal, 2019;Kogaetal, 2021)。

DPiWE 是一個(gè)基于高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析水體環(huán)境病原菌群落特征和溯源的綜合數(shù)據(jù)庫(kù), 提供了人類介水傳染病、水產(chǎn)動(dòng)物疾病及跨宿主共患病等病害的細(xì)菌病原的分類學(xué)和宿主信息(董鵬生等, 2021)。通過(guò)DPiWE 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì), 養(yǎng)殖源水中優(yōu)勢(shì)病原菌為埃希氏菌、微球菌屬及Thalassobius等, 與象山大黃魚網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)水體中優(yōu)勢(shì)病原菌(弧菌屬、黏著桿菌屬Tenacibaculum、埃希氏-志賀氏菌屬Escherichia-Shigella和不動(dòng)桿菌屬)不同, 且總體豐度偏低(Houet al, 2021), 說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)源水環(huán)境受到水產(chǎn)養(yǎng)殖活動(dòng)影響的程度低。漂白粉消毒后病原菌總豐度降低, 但種類增加, 與病原菌對(duì)氯消毒的抗性有關(guān)(Songetal,2019; Wangetal, 2019b), 如消毒后新增鏈球菌Streptococcus、梭狀芽孢桿菌Clostridium、埃希氏-志賀氏菌等病原菌被普遍報(bào)道具有氯消毒抗性(Wangetal, 2021b)。高濃度組病原菌在消毒后初期豐度下降,而低濃度組在D0 時(shí)高于消毒前, 說(shuō)明高濃度漂白粉對(duì)病原菌有更好地殺滅作用。源水病原菌組成與豐度存在明顯的動(dòng)態(tài)演替, 實(shí)驗(yàn)后期均以Thalassobius占主導(dǎo)地位, 有研究認(rèn)為Thalassobius中包含多種魚類病原菌, 但未見對(duì)蝦類致病的報(bào)道(Kanehisa, 2018)。

本研究中, 養(yǎng)殖源水中豐度最高的ARG 是tetA,其次是cmlA 與floR, 與文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)蝦養(yǎng)殖近海水源水主要為磺胺類ARGs (sul2)不同, 養(yǎng)殖源水中ARGs豐度與該水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)常用的抗生素類型有關(guān)(夏濤濤等, 2022), 同時(shí)受人類活動(dòng)、生活污水排入、降雨等多種因素影響(Shaoetal, 2018; Liuetal, 2020)。有研究表明, 氯消毒能有效去除水體中的ARGs (Yoonet al, 2017), 去除效率與有效氯濃度有關(guān)(Huangetal,2013)。本實(shí)驗(yàn)中, 漂白粉消毒后(D0)僅對(duì)sul1、floR、cfr、tetQ 有一定的去除效果, 且在有效氯衰減后短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)至消毒前水平, 說(shuō)明漂白粉消毒養(yǎng)殖源水不能有效去除ARGs (Tangetal, 2023)。值得注意的是, 消毒后高濃度組sul1、sul2、tetA、tetQ 等ARGs的豐度高于低濃度組, 分析原因可能與消毒后攜帶相關(guān)抗性基因的細(xì)菌快速再生有關(guān)(Sullivanetal,2017)。氯消毒對(duì)水體ARGs 的去除具有選擇性, 對(duì)引用水的研究發(fā)現(xiàn), 氯消毒除對(duì)sul1 有明顯的去除作用外, 對(duì)ampC、aphA2、blatem1、tetA、tetG、ermA、ermB 等ARGs 均有富集作用(Shietal, 2013)。Wan 等(2022)也報(bào)道氯消毒30 min 對(duì)多種ARGs 的豐度沒(méi)有影響。本實(shí)驗(yàn)也有類似結(jié)果,tetA、cmlA 和strB 的豐度在消毒后無(wú)明顯變化, 但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn), 漂白粉消毒改變了源水的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性。消毒后, 兩個(gè)濃度組源水的擬桿菌門豐度上升, 而60 mg/L 漂白粉組變形菌門的豐度顯著降低; 屬水平上, 薄層菌屬和Nautella在消毒后源水中占據(jù)優(yōu)勢(shì); 至第3 天, 兩組的細(xì)菌群落組成在門和屬水平趨于一致。60 mg/L 漂白粉對(duì)病原菌豐度和恢復(fù)速度的抑制作用優(yōu)于20 mg/L。漂白粉消毒對(duì)養(yǎng)殖源水中sul1、floR、cfr、tetQ 有一定的去除作用, 但對(duì)其他 ARGs 幾乎無(wú)影響, 顯示了對(duì)ARGs 去除的選擇性, 且高低濃度組之間無(wú)差異。綜合分析認(rèn)為, 相比20 mg/L 組, 60 mg/L 漂白粉消毒可以顯著降低變形菌門的豐度, 抑制病原菌快速增殖,可以作為凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖中更好地消毒選擇。