郭 鋒 王玉霞 董震宇 姚榮輝 王偉峰 葉瑩瑩嚴(yán)小軍, 郭寶英, ①

(1. 國(guó)家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心 浙江舟山 316022; 2. 浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 浙江舟山 316022)

近幾十年來(lái), 全球變暖現(xiàn)象持續(xù)加劇, 海水溫度長(zhǎng)期以來(lái)一直被認(rèn)為是影響潮間帶海洋生物生長(zhǎng)、生存、發(fā)育和繁殖的重要非生物因素(Jansenetal, 2007;Guoetal, 2020)。潮間帶貝類生活在巖石上, 活動(dòng)范圍有限, 而貝類作為變溫動(dòng)物, 適應(yīng)環(huán)境溫度變化的能力被認(rèn)為是它們適應(yīng)自然環(huán)境的主要決定因素。預(yù)計(jì)到22 世紀(jì)末, 全球海洋溫度將上升1～4 °C, 可能導(dǎo)致貝類產(chǎn)生生理應(yīng)激反應(yīng)(Maulvaultetal, 2018;Alfonsoetal, 2021)。氣溫持續(xù)上升, 極端熱浪事件頻率增加(Smithetal, 2023)等全球變暖正影響著世界各地的動(dòng)物群落, 而潮間帶貝類對(duì)溫度等環(huán)境因素的變化極為敏感(姜高偉等, 2021)。為了預(yù)測(cè)在全球氣候變化背景下海洋生物的命運(yùn), 特別是對(duì)于生活在極端或溫度波動(dòng)環(huán)境中的生物, 需重點(diǎn)研究它們對(duì)棲息地的生理適應(yīng)。由于氣候變化, 季節(jié)性水溫持續(xù)上升, 導(dǎo)致溫度變化和極端事件變得日益頻繁, 尤其是夏季溫度和極端熱浪事件的頻率正在增加(Sokolovaetal, 2012; Vasseuretal, 2014; Jacoxetal, 2020), 在貽貝和藤壺等物種中觀察到與熱相關(guān)的大規(guī)模死亡事件, 這些物種調(diào)節(jié)體溫和行為的能力有限。潮間帶貝類成為適應(yīng)極端溫度的模式物種。對(duì)這些物種的研究可能對(duì)變溫動(dòng)物應(yīng)對(duì)全球變暖的機(jī)制提供重要啟示。因此, 由人類活動(dòng)引起的氣候變化正在進(jìn)一步加劇全球平均溫度和極端溫度事件的頻率, 導(dǎo)致生物多樣性和生物地理分布的變化, 溫度適應(yīng)性問(wèn)題變得越來(lái)越重要(Zippayetal, 2012; van de Poletal,2017; Zhangetal, 2020)。

代謝組研究是一種系統(tǒng)性的方法, 通過(guò)對(duì)生物樣本中的小分子化合物進(jìn)行分析和比較, 可以揭示生物體在不同生理狀態(tài)下的代謝特征(Courantetal,2014; Zhaoetal, 2014)。生物代謝組學(xué)分析已被用于包括生態(tài)毒理學(xué)在內(nèi)的許多領(lǐng)域, 用于評(píng)估暴露于不同污染物的生物體的亞致死變化, 揭示新的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng), 并假設(shè)暴露的生物標(biāo)志物(Lankaduraiet al, 2013; Serra-Compteetal, 2019)。Costa 等(2008)的研究表明, 水溫等環(huán)境條件的變化或貽貝的繁殖周期可能會(huì)影響它們對(duì)化學(xué)污染的反應(yīng)。代謝組學(xué)分析已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的檢測(cè)中, 例如,Gui 等(2016)在運(yùn)用代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)綠唇貽貝(Perna canaliculus)采捕后和運(yùn)輸后, 貽貝血淋巴和肝胰腺中大量代謝物與對(duì)照相比存在差異。這些代謝產(chǎn)物一般參與能量代謝、氨基酸代謝、蛋白質(zhì)降解和脂肪酸代謝等過(guò)程(Guietal, 2016)。Yang 等(2019)基于代謝組學(xué)的分析, 探究馬氏珠母貝(Pinctadafucatamartensii)在不同飼料喂養(yǎng)下代謝物的變化, 綜合關(guān)鍵代謝途徑分析表明, C45P25 調(diào)節(jié)淀粉和蔗糖代謝、甘氨酸、谷氨酸代謝、天冬氨酸、丙氨酸以及絲氨酸和蘇氨酸代謝, 以滿足能量需求, 增加生糖氨基酸。Dumas 等(2020)應(yīng)用代謝組學(xué)方法揭示了地中海貽貝暴露于污水處理廠廢水提取物的代謝途徑, 突出的代謝物主要是氨基酸代謝(如脯氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等)與神經(jīng)激素(多巴胺和5-羥色胺代謝物)等, 還有一種成分涉及氧化應(yīng)激防御(氧化谷胱甘肽) (Dumasetal, 2020)。在厚殼貽貝(Mytiluscoruscus)代謝組研究方面, 范孝俊等(2023)通過(guò)開(kāi)展厚殼貽貝外套膜進(jìn)行急性酸性環(huán)境下的我代謝組的分析, 推測(cè)厚殼貽貝通過(guò)促進(jìn)尿素合成, 增強(qiáng)細(xì)胞膜流動(dòng)性, 并加強(qiáng)滲透壓調(diào)節(jié)和鈣離子運(yùn)輸?shù)确绞絹?lái)應(yīng)對(duì)海洋酸化威脅的代謝途徑。這些代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)可以反映能量代謝、DNA 和RNA 合成、免疫系統(tǒng)、滲透調(diào)節(jié)、足絲形成和生殖等生物過(guò)程的變化, 這些變化可能會(huì)對(duì)生物體的適應(yīng)性造成一些負(fù)面影響(G?tzeetal, 2020; 范孝俊等, 2023)。

厚殼貽貝隸屬于軟體動(dòng)物門(mén)(Mollusca), 雙殼綱(Bivalvia), 貽貝目(Mytilida), 貽貝科(Mytilidae), 貽貝屬(Mytilus), 主要分布于東亞溫帶海域, 包括我國(guó)東海、黃海、渤海等, 主要集中在浙江省舟山市嵊泗縣養(yǎng)殖, 是我國(guó)具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的海洋養(yǎng)殖貝類之一(?？姑赖? 2007; 袁文斌等, 2017; 劉碩博等, 2019)。溫度是影響水生動(dòng)物生理過(guò)程的重要因素之一, 溫度變化對(duì)軟體動(dòng)物生理代謝和基因表達(dá)有顯著影響(姚翠鸞等, 2015; 楊東敏等, 2017; 姜高偉等, 2021; 張?jiān)? 2022)。在全球變暖的環(huán)境下, 海洋暖化、海洋熱浪事件也偶有發(fā)生, 由此造成的貝類大量死亡事件也越來(lái)越多, 給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大損失(江天棋等, 2020)。盡管許多研究表明高溫嚴(yán)重影響著海洋生物的各種生命過(guò)程, 但對(duì)于海洋雙殼貝類如何應(yīng)對(duì)熱應(yīng)激的研究仍然不足。基于此, 本研究選取厚殼貽貝作為研究對(duì)象, 對(duì)厚殼貽貝消化腺響應(yīng)熱應(yīng)激的代謝途徑進(jìn)行研究, 為闡明厚殼貽貝消化腺應(yīng)對(duì)熱應(yīng)激的調(diào)節(jié)機(jī)制提供一定啟示, 也為其耐熱品種的選育提供豐富的遺傳材料和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品材料采集與處理

厚殼貽貝是由中國(guó)浙江舟山市嵊泗縣的養(yǎng)殖基地購(gòu)買(mǎi), 并在溫度為(18±0.5) °C 的100 L 充氣水箱中馴化。在馴化期間, 水箱內(nèi)的海水用氣泵進(jìn)行不間斷的充氣, 水箱內(nèi)的海水每天更換一次, 以螺旋藻粉為飼料(1 g/m3), 定時(shí)投飼(18:30)。馴化時(shí)間為一周, 馴化期間光照與黑暗控制在12 h : 12 h, 海水鹽度為25,pH 8±0.2, 溶解氧(7±0.5) mg/L。將其從溫度為18 °C的暫養(yǎng)水箱隨機(jī)分到實(shí)驗(yàn)水箱中, 一共三個(gè)實(shí)驗(yàn)組,分別為: 熱應(yīng)激組33 °C, 緩溫脅迫組26 °C 和對(duì)照組18 °C, 溫度設(shè)定是根據(jù)水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)驗(yàn)和自然環(huán)境實(shí)際情況得出的理想溫度范圍(15～25 °C, 26 °C 為緩慢應(yīng)激溫度)。在特別低潮期間, 水溫接近于周圍空氣的溫度。在低潮與惡劣天氣條件同時(shí)出現(xiàn)的情況下, 貽貝棲息地的水溫有可能驟升至30 °C 甚至更高。每組三個(gè)水箱, 在熱應(yīng)激12 h 取樣, 然后使用干冰將溫度處理然后使用干冰將溫度處理過(guò)的厚殼貽貝消化腺組織運(yùn)輸至華大基因完成非靶向代謝組測(cè)序。

1.2 代謝物的提取

在提取厚殼貽貝消化腺組織的代謝物時(shí), 需要進(jìn)行預(yù)冷處理, 所有提取試劑將被置于-20 °C。首先,我們?cè)诮M織樣本加入標(biāo)簽為(L-2-氯苯丙氨酸, 濃度為0.06 mg/mL)的甲醇溶液中, 并加入比例為4∶1 的甲醇與混合水溶液。然后, 使用研磨器以60 Hz 的頻率進(jìn)行研磨處理(持續(xù) 2 min), 之后將樣品離心(10 000×g, 4 °C, 持續(xù)10 min), 并取上清液進(jìn)行冷凍干燥。隨后, 使用甲醇與混合水溶液將冷凍干燥后的樣品復(fù)溶。將復(fù)溶后的樣品在-20 °C 下靜置2 h, 然后再次離心(10 000×g, 4 °C, 持續(xù)10 min), 取其上清液。為了分析提取的代謝物, 使用0.22 μm 濾膜對(duì)上清液進(jìn)行過(guò)濾, 然后將樣品進(jìn)行超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。在分析過(guò)程中, 我們對(duì)兩種不同條件下的貽貝(對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組)的消化腺組織進(jìn)行了6 次獨(dú)立的重復(fù)實(shí)驗(yàn)。每一組實(shí)驗(yàn)代表了一次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn), 共進(jìn)行了6 次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn), 并且使用了由全樣本混合制備的質(zhì)控樣品。

1.3 LC-MS/MS 分析

LC-MS/MS (液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用)技術(shù)是一種分析化學(xué)技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)的樣品分離和檢測(cè)采用了UPLC 串聯(lián)QExactive 高分辨質(zhì)譜儀。儀器每10 個(gè)樣本穿插一個(gè)QC 樣本。采用LECO 公司的ChromaTOF4.33x 軟件和 LECO-fiehnRtx5 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)峰進(jìn)行分析。具體的實(shí)驗(yàn)步驟參考Zhang 等(2021)的研究方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

LC-MS/MS 技術(shù)能夠獲得大量的質(zhì)譜原始數(shù)據(jù),這些數(shù)據(jù)需要經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)處理才能得到有用的信息。本實(shí)驗(yàn)使用了Thermo Fisher Scientific 公司的Compound Discoverer 3.1 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。在代謝物鑒定方面結(jié)合了BMDB 數(shù)據(jù)庫(kù)(華大代謝組數(shù)據(jù)庫(kù))、mzCloud、HMDB、ChemSpider、LipidMaps 和KEGG等多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行鑒定。篩選條件為母離子的質(zhì)量偏差(Precursor Mass Tolerance) ＜ 5 ppm (Part Per Million, 質(zhì)譜儀的精度單位), 碎片離子的質(zhì)量偏差(Fragment Mass Tolerance) ＜ 10 ppm, 保留時(shí)間偏差(RT Tolerance) ＜0.2 min, 確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。將Compound Discoverer 3.1 導(dǎo)出的結(jié)果, 導(dǎo)入metaX 進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理。本實(shí)驗(yàn)采用了log2對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換和 Pareto scaling 的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理, 應(yīng)用Pareto scaling 的方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行比例調(diào)整。PCA (主成分分析)和OPLS-DA (潛在結(jié)構(gòu)鑒別分析的正交投影)由SIMCA14 軟件包(Umetrics, Umea, 瑞典)執(zhí)行。運(yùn)用OPLS-DA 對(duì)分組進(jìn)行有效分離, 采用PCA 對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分布。本文通過(guò)構(gòu)建代謝產(chǎn)物變化的熱圖,運(yùn)用直觀的可視化來(lái)獲取這些代謝產(chǎn)物的豐度(低/高)。PLS-DA 模型第一主成分的 VIP 值(Variable Importance in the Projection, VIP＞1)被認(rèn)為是篩選差異代謝物的第一參數(shù)。對(duì)剩余變量的評(píng)價(jià)采用T 檢驗(yàn)(Student’s T 檢驗(yàn)), FC (fold change)值為兩組之間的差異倍數(shù), 去掉兩組之間P＞0.05 的差異代謝物。研究使用KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異代謝物進(jìn)行信號(hào)通路的富集分析, 篩選代謝通路為顯著富集的代謝通路的標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

對(duì)所有組的消化腺組織樣本進(jìn)行PCA 分析, 置信區(qū)間為95%。在正離子檢測(cè)模式下, 研究結(jié)果表明CT-18 VS ST-26、CT-18 VS HT-33 和ST-26 VS HT-33的第一主成分和第二主成分呈顯著分離, 每個(gè)主成分分別解釋了26.17%和17.28%、26.26%和13.73%、22.61%和18.26%的變異(圖1a); 在負(fù)離子檢測(cè)模式下, 研究結(jié)果表明CT-18 VS ST-26、CT-18 VS HT-33和ST-26 VS HT-33 的第一主成分和第二主成分呈顯著分離, 每個(gè)主成分分別解釋了27.04%和16.93%、27.25%和14.28%、23.94%和17.31%的變異(圖1b), 表明對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組樣品中的代謝物存在顯著變化。

圖1 經(jīng)過(guò)熱脅迫處理后, 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組厚殼貽貝消化腺組織的代謝物在正負(fù)離子模式下PCA 得分圖Fig.1 PCA score plots of metabolites from digestive gland tissues of M. coruscus in experimental and control groups in positive and negative ion mode after heat stress treatment

PLS-DA 是一種有監(jiān)督的統(tǒng)計(jì)方法, 它是根據(jù)樣品中代謝物的表達(dá)量來(lái)進(jìn)行分類預(yù)測(cè)。通過(guò)這種方法可以有效地將不同樣品分到不同的組別中, 從而更好地理解樣品之間的差異和分類情況。PLS-DA 模型分析進(jìn)一步顯示, 在正負(fù)兩種離子模式下, 不同的組別間均存在顯著差異, 說(shuō)明熱應(yīng)激引起了厚殼貽貝消化腺代謝表型的改變。在正離子檢測(cè)和鑒定下, CT-18 VS ST-26、CT-18 VS HT-33 和ST-26 VS HT-33 的R2和Q2 的截距值分別為0.98 和-0.77, 0.98 和-0.69, 0.98和-0.67 (圖2a); 在負(fù)離子檢測(cè)和鑒定下, CT-18 VS ST-26、CT-18 VS HT-33 和ST-26 VS HT-33 的R2 和Q2 的截距值分別為0.98 和-0.810.99 和-0.74、0.98 和-0.80 (圖2b), 表明模型可靠穩(wěn)定, 且沒(méi)有過(guò)擬合。

圖2 厚殼貽貝消化腺中的代謝物在正、負(fù)離子模式下對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組兩兩比較的PLS-DA 分析模型的得分圖Fig.2 Score plots of PLS-DA analytical model for two-by-two comparison of metabolites in digestive glands of thick-shelled mussels in positive and negative ion modes for control and experimental groups

2.2 差異代謝物篩選與注釋

與熱刺激過(guò)實(shí)驗(yàn)組貽貝和對(duì)照組貽貝相比, 熱刺激導(dǎo)致了厚殼貽貝機(jī)體內(nèi)許多代謝物的改變。在正離子和負(fù)離子檢測(cè)模式下, 對(duì)CT-18、ST-26、HT-33以及CT-18、HT-26、ST-26、HT-33 等不同溫度組合進(jìn)行了代謝物分析。結(jié)果顯示, 在正離子模式下,CT-18 VS ST-26 產(chǎn)生了732 種代謝物的變化; CT-18 VS HT-33 有539 種代謝物的變化; ST-26 VS HT-33產(chǎn)生了496 種代謝物的變化。在負(fù)離子模式下, CT-18 VS ST-26 有274 種代謝物的變化, 166 種減少; CT-18 VS HT-26 產(chǎn)生了263 種代謝物的變化; ST-26 VS HT-33 產(chǎn)生了174 種代謝物的變化。這些結(jié)果揭示了不同貽貝組合之間的代謝物變化情況(表1)。因此, 該方法和結(jié)果是可靠的, 雙離子模式下, 各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間具有顯著差異的代謝物數(shù)量如火山圖所示(圖3a, 3b)。

表1 厚殼貽貝消化腺代謝組學(xué)測(cè)序差異代謝物的統(tǒng)計(jì)表Tab.1 Differential metabolites of metabolomics sequencing in digestive glands of M. coruscus

圖3 熱脅迫處理后, 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組厚殼貽貝消化腺差異代謝物火山圖Fig.3 Volcano plot of differential metabolites in digestive glands of M. coruscus in the experimental and control groups after heat stress treatment

2.3 代謝通路富集與聚類

在雙離子模式下, 我們對(duì)獲得的差異顯著的代謝物進(jìn)行了層次聚類分析, 如圖4a 和圖4b 所示。研究結(jié)果顯示, 在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組之間存在著代謝物含量方面的顯著差異。高溫脅迫處理組與對(duì)照組相比,高溫脅迫實(shí)驗(yàn)組聚類關(guān)聯(lián)性良好。

圖4 經(jīng)熱脅迫處理后, 厚殼貽貝消化腺的差異代謝物層次聚類熱圖Fig.4 The heat map of hierarchical clustering analysis of significantly different metabolites in outer coat membrane of M. coruscus after heat stress treatment

KEGG 富集分析用于探索差異代謝物的潛在代謝途徑。在正離子模式下, 共發(fā)現(xiàn)73 條信號(hào)通路, 其中有12 條顯著(P＜0.05)。具體來(lái)說(shuō), CT-18 對(duì)比ST-26顯示出鞘脂類代謝和視黃醇新陳代謝, CT-18 對(duì)比HT-33 中有酪氨酸、亞油酸和丙氨酸新陳代謝的變化,ST-26 對(duì)比HT-33 中有多個(gè)代謝通路發(fā)生變化(圖5a)。在負(fù)離子模式下, 共發(fā)現(xiàn)71 條信號(hào)通路, 其中有17 條顯著(P＜0.05)。具體來(lái)看, CT-18 對(duì)比ST-26表現(xiàn)出?；撬岷痛闻；撬岽x、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、不飽和脂肪酸的生物合成的顯著變化;CT-18 對(duì)比HT-26 中, 酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸代謝有顯著差異; ST-26 對(duì)比HT-33 中則有咖啡因代謝等代謝通路的顯著差異(圖5b)。

圖5 經(jīng)熱脅迫處理后, 厚殼貽貝消化腺差異代謝物的代謝通路富集分析氣泡圖Fig.5 The bubble plot of metabolic pathway enrichment analysis of differential metabolites in digestive gland of M. coruscus after heat stress treatment

3 討論

在全球變暖的情況下, 不斷上升的溫度可能構(gòu)成熱應(yīng)激, 進(jìn)而導(dǎo)致生物機(jī)體做出不同的反應(yīng)(Paraskevopoulouetal, 2018)。對(duì)于水生動(dòng)物來(lái)說(shuō), 調(diào)節(jié)代謝水平是適應(yīng)溫度變化的重要機(jī)制之一。這是因?yàn)榇x水平的調(diào)節(jié)能夠影響細(xì)胞產(chǎn)生能量和生成關(guān)鍵代謝物, 從而幫助維持身體內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定狀態(tài)(Liangetal, 2021)。潮間帶軟體動(dòng)物適應(yīng)溫度升高的機(jī)制在水生生物研究中越來(lái)越受到關(guān)注, 其對(duì)水溫的適應(yīng)范圍十分有限, 超過(guò)一定水溫限度會(huì)對(duì)其生理功能造成紊亂, 也會(huì)導(dǎo)致貝類的生長(zhǎng)代謝速率和免疫功能被抑制, 影響其生存能力和地理分布(Weigeletal, 2016)。而東海潮間帶的海表溫度每年變化在8～27 °C 之間(鞠霞等, 2013), 本研究在前期通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料和做與溫度有關(guān)的預(yù)實(shí)驗(yàn), 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示20～26 °C 比較適合厚殼貽貝生存。18 °C 是在厚殼貽貝被帶進(jìn)實(shí)驗(yàn)室時(shí)的海表溫度, 因此, 18 °C 作為對(duì)照組溫度。之所以選擇26 °C, 是因?yàn)槠浯砹撕駳べO貝在該地區(qū)夏季可能經(jīng)歷的最高溫度。最后, 33 °C 則是該地區(qū)可能經(jīng)歷的極端溫度(Liaoetal, 2019)。

基于代謝組學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), 在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組之間存在著代謝物含量方面的顯著差異, 這意味著不同溫度對(duì)厚殼貽貝消化腺中的代謝產(chǎn)物具有明顯的調(diào)控作用。具體來(lái)說(shuō), 經(jīng)過(guò)層次聚類分析, 我們觀察到代謝物在樣本之間的聚類模式呈現(xiàn)出明確的趨勢(shì), 揭示了它們?cè)诓煌瑮l件下的表達(dá)變化。尤其值得注意的是, 與對(duì)照組相比, 高溫脅迫實(shí)驗(yàn)組的代謝物差異聚類表現(xiàn)出良好的關(guān)聯(lián)性, 這表明高溫脅迫處理對(duì)厚殼貽貝消化腺的代謝網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生了顯著影響,并導(dǎo)致了一系列代謝物水平上的變化。

KEGG 富集在以下代謝通路中, 例如在ST-26 VS HT-33 中發(fā)現(xiàn)“苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成(map00400)”, CT-18 VS ST-26 中發(fā)現(xiàn)“鞘脂類代謝(map00600)”, CT-18 VS HT-33 中發(fā)現(xiàn)“酪氨酸代謝(map00350)”。基于前期所研究轉(zhuǎn)錄組與代謝組學(xué)聯(lián)合分析(Wangetal, 2023), 發(fā)現(xiàn)色氨酸代謝通路代謝物和差異基因上調(diào)明顯, 這些基因參與的通路也包括能量代謝, 而TCA 循環(huán)作為生物機(jī)體重要的能量代謝組成成分, 其代謝產(chǎn)物的高表達(dá)可能說(shuō)明了熱應(yīng)激使厚殼貽貝消化腺具有比較強(qiáng)的能量代謝水平。

色氨酸是生物體的必需氨基酸, 它的功能具有多樣性, 主要參與蛋白質(zhì)的合成。其代謝功能具有復(fù)雜性, 能直接或間接參與多種代謝通路反應(yīng)(Chenet al, 2019; Agostinietal, 2020)。厚殼貽貝的消化腺是色氨酸代謝的主要器官, 消化腺的細(xì)胞組織破損導(dǎo)致L-色氨酸代謝物和犬尿氨酸產(chǎn)物的表達(dá)量發(fā)生改變, 也可能通過(guò)色氨酸代謝調(diào)節(jié)紊亂的免疫反應(yīng), 保護(hù)消化腺組織細(xì)胞免受損傷。這種氨基酸是合成神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)調(diào)節(jié)因子5-羥色胺、褪黑激素、狗嘌呤以及相關(guān)化合物如狗嘌呤酸、喹啉酸或煙酸的前體。因此, 它在脊椎動(dòng)物體內(nèi)從免疫系統(tǒng)到神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)過(guò)程中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用(Machadoetal, 2022)。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中, 色氨酸的作用得到了廣泛的研究, 特別是在調(diào)節(jié)魚(yú)類的行為、應(yīng)激反應(yīng)、抗氧化和免疫系統(tǒng)方面(Hoseinietal, 2019; Herreraetal, 2020)。脂質(zhì)是水不溶性分子, 其中磷酸甘油酯、鞘脂和固醇是構(gòu)建細(xì)胞膜的主要成分(Yangetal, 2018)。更重要的是,脂質(zhì)在能量穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用(Bianetal, 2021), 細(xì)胞脂質(zhì)代謝與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)(Zhangetal, 2022)。

在ST (26 °C)組和HT (33 °C)組中, 除其他與脂質(zhì)相關(guān)的代謝過(guò)程外, 分別檢測(cè)到甘油磷脂代謝和鞘脂代謝的變化。CDP-膽堿是一種熱保護(hù)劑, 能對(duì)抗高溫對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響(Chenetal, 2021)。磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺是細(xì)胞膜的重要組成部分,受高溫?fù)p傷(Nguyenetal, 2020), 而CDP-膽堿途徑是合成磷脂酰膽堿的主要途徑(H?rletal, 2011)。CDP-膽堿含量的減少無(wú)疑削弱了磷脂酰膽堿(PC)的合成,從而影響了細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。被認(rèn)為是耐高溫的物種之一的塔結(jié)節(jié)濱螺(Echinolittorinamalaccana), 在遭受極端高溫時(shí)通過(guò)增加熱保護(hù)性滲透物和上調(diào)甘油磷脂代謝來(lái)適應(yīng)極端高溫(Chenetal, 2021), 并且珍珠貝(Pinctadamaxima)的耐熱性不及塔結(jié)節(jié)濱螺, 即使中等強(qiáng)度的高溫?zé)崂藢?duì)珍珠貝也會(huì)產(chǎn)生顯著的負(fù)面影響(Liuetal, 2023)。鞘脂是真核細(xì)胞膜的主要組成部分, 對(duì)穩(wěn)定脂質(zhì)雙層的結(jié)構(gòu)很重要。3-去氫鞘脂堿是鞘脂和鞘脂激酶1-磷酸酶的前體, 它們?cè)诩?xì)胞生長(zhǎng)和死亡的調(diào)控中起著重要作用(Leónetal, 2021;Tianetal, 2022)。在不同細(xì)胞類型中, 鞘脂酰胺促進(jìn)細(xì)胞死亡, 但鞘脂醇1-磷酸酶調(diào)節(jié)信號(hào)通路, 刺激細(xì)胞生長(zhǎng)并抑制程序性細(xì)胞死亡。鞘脂酰胺和鞘脂醇1-磷酸酶之間的平衡稱為鞘脂醇1-磷酸酶鞘脂醇1-磷酸酶平衡器, 并在細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡中保持長(zhǎng)期平衡(Laychocketal, 2003)。3-去氫鞘脂堿的減少不能確定鞘脂酰胺鞘脂醇1-磷酸酶平衡器的平衡是否被破壞, 但我們從結(jié)果中可知, 高溫脅迫對(duì)厚殼貽貝鞘脂代謝的合成、細(xì)胞生長(zhǎng)能力和死亡調(diào)節(jié)機(jī)制產(chǎn)生了重大的影響。

4 結(jié)論

通過(guò)厚殼貽貝熱應(yīng)激前后消化腺代謝組學(xué)分析,兩種離子模式下, 鑒定得到了1 821 個(gè)和711 個(gè)差異表達(dá)代謝物, 通過(guò)對(duì)其進(jìn)行KEGG 注釋及富集分析,最終確定了包括色氨酸(Tryptophol)、L-色氨酸(Ltryptophan)、L-犬尿氨酸(L-kynurenine)、8-甲氧基犬尿酸(8-methoxykynurenic acid)、5'-甲基硫腺苷(5'-methylthioadenosine)、次?；撬?Hypotaurine)、5-羥基吲哚-3-乙酸(5-hydroxyindole-3-acetic acid)、2-氨基己二酸(2-aminoadipic acid)和L-纈氨酸(L-(+)-valine)等差異表達(dá)的標(biāo)志代謝物, 并且還顯著地富集到厚殼貽貝消化腺主要通過(guò)調(diào)節(jié)色氨酸代謝、酪氨酸代謝、鞘脂代謝、代謝通路和苯丙氨酸代謝等代謝信號(hào)通路。這些研究結(jié)果提示, 熱應(yīng)激對(duì)厚殼貽貝的能量代謝和免疫機(jī)能產(chǎn)生不利影響, 影響厚殼貽貝消化腺脂肪代謝吸收從而導(dǎo)致消化腺功能受損。本研究在代謝水平上揭示了厚殼貽貝消化腺對(duì)熱應(yīng)激的適應(yīng)機(jī)制, 并強(qiáng)調(diào)了相關(guān)差異基因和代謝物的作用, 為后續(xù)針對(duì)特定代謝通路的厚殼貽貝耐高溫靶向調(diào)控研究提供了理論基礎(chǔ)。