張 帆 鄭關(guān)超 王瀟瀟 翟毓秀 譚志軍 吳海燕①

(1. 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 山東青島 266071; 2. 中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東青島 266003; 3. 海水養(yǎng)殖生物育種與可持續(xù)產(chǎn)出全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 山東青島 266071)

麻痹性貝類(lèi)毒素(paralytic shellfish toxins, PSTs)主要由Alexandrium、Gymnodinium和Pyrodinium等海洋甲藻產(chǎn)生, 通過(guò)貝類(lèi)濾食進(jìn)入食物鏈, 在世界范圍內(nèi)造成嚴(yán)重生態(tài)和食品安全風(fēng)險(xiǎn), 是國(guó)際社會(huì)重點(diǎn)關(guān)注目標(biāo)和管控對(duì)象(Viscianoetal, 2016; Nicolasetal, 2017)。研究表明PSTs 分布具有地域性特點(diǎn)(Villalobosetal, 2019), 而其風(fēng)險(xiǎn)形成過(guò)程主要受兩個(gè)方面的影響: 首先是產(chǎn)毒藻的種類(lèi)及來(lái)源差異, 鏈狀亞歷山大藻(Alexandriumcatenella)主要分布在渤海、黃海和東海海域(顧海峰等, 2011; 唐瑩瑩等,2018), 而太平洋亞歷山大藻主要分布在東海和南海,鏈狀裸甲藻在福建近海曾多次導(dǎo)致中毒事件(于仁成等, 2020)。其次, 不同地區(qū)貝類(lèi)如紫貽貝攝食產(chǎn)毒藻后毒素成分也有顯著差異, 在2019 年大連大窯灣海域紫貽貝中PSTs 成分以C1&2 和GTX2&3 為主(許道艷等, 2014), 而在浙南海域的紫貽貝中PSTs 成分則以C2、GTX5 和NEO 為主(張樹(shù)剛等, 2011), 這種區(qū)域差異在其他研究中也得到了充分的證明(Yaoetal,2019; Liangetal, 2022)。因此, 貝類(lèi)PSTs 組分的區(qū)域差異對(duì)其風(fēng)險(xiǎn)具有一定的指示作用, 可有效指向風(fēng)險(xiǎn)源地并用于產(chǎn)地溯源, 對(duì)于提升貝類(lèi)中PSTs 風(fēng)險(xiǎn)的監(jiān)管效果具有重要作用。

近年來(lái), 指紋溯源技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物地球化學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全等多個(gè)領(lǐng)域, 通過(guò)對(duì)生物體指紋生物標(biāo)志物的篩選, 結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)可快速實(shí)現(xiàn)源頭識(shí)別(劉靜等, 2022; 冷雪等,2023)。該技術(shù)是基于代謝組學(xué)技術(shù), 以高通量、高靈敏度、高分辨率的現(xiàn)代儀器分析方法為手段, 對(duì)細(xì)胞、體液和組織中全部代謝物進(jìn)行定性與定量分析,隨后結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析來(lái)構(gòu)建指紋溯源技術(shù)模型(孫曉珊等, 2021; 高淑芳等, 2022)。其中液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)(徐天潤(rùn)等, 2020)能夠在任何單一分析平臺(tái)中實(shí)現(xiàn)最高的代謝組覆蓋率, 并且需要最少的樣品前處理, 包括蛋白質(zhì)沉淀和代謝物提取(Bujaket al, 2015), 適宜的提取溶劑、提取時(shí)間和處理溫度等條件是影響前處理的重要參考指標(biāo)。有文獻(xiàn)報(bào)道, 基于LC-MS 的代謝指紋識(shí)別鯉魚(yú)和虹鱒魚(yú)精漿中的代謝物, 篩選出精子質(zhì)量的新型生物標(biāo)志物, 為優(yōu)化人工繁殖奠定了基礎(chǔ)(Dietrichetal, 2019)。同時(shí)也有研究針對(duì)澳大利亞翡翠貽貝新西蘭綠唇貽貝和進(jìn)行代謝指紋檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)兩種貽貝之間存在明顯的代謝差異, 根據(jù)差異代謝物可以實(shí)現(xiàn)貽貝產(chǎn)地溯源(Rochfortetal, 2013)。此外, 也有研究采用同位素標(biāo)記(Zhaoet al, 2019)、脂質(zhì)(Shinetal, 2008)、微量元素(Morrisonetal, 2019)等技術(shù)識(shí)別雙殼貝類(lèi)腸道內(nèi)容物的方式,實(shí)現(xiàn)貝類(lèi)產(chǎn)地溯源(Gaoetal, 2006)。

采用高通量篩查技術(shù)獲得的數(shù)據(jù)規(guī)模大且來(lái)源復(fù)雜, 因此需要結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法, 降低數(shù)據(jù)維度篩選出具有識(shí)別能力的變量(徐天潤(rùn), 2020)。多變量分析是通過(guò)降低維度來(lái)簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)的復(fù)雜程度, 并通過(guò)相關(guān)軟件進(jìn)行結(jié)果可視化, 主要包括主成分分析(principal component analysis, PCA)、正交偏最小二乘判別分析(orthogonal signal correction partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA)、聚類(lèi)分析等。其中PCA 主要通過(guò)質(zhì)量控制樣本(QC)在PCA 圖中分布情況對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步考察, 譚芷晴等(2023)為篩選炔諾酮暴露斑馬魚(yú)后的生物標(biāo)志物, 運(yùn)用PCA分析發(fā)現(xiàn)處理組與代謝組有明顯分離。劉天亮等(2022)運(yùn)用PCA 分析成功將來(lái)自山東、河南和河北產(chǎn)區(qū)的金銀花樣品分成了3 類(lèi)。而OPLS-DA 可以使分類(lèi)信息主要集中在主成分上, 并且通過(guò)變量投影重要度(Variable importance in projection, VIP)來(lái)確定差異化合物, 判別效果更具有說(shuō)服力(李思源等, 2021)。然而, 基于多變量分析的代謝指紋從未用于研究攝食麻痹性貝類(lèi)毒素的紫貽貝。

本研究選擇我國(guó)近海主要麻痹性貝類(lèi)毒素產(chǎn)毒藻種, 通過(guò)室內(nèi)暴露貽貝模擬指紋信息傳遞過(guò)程, 采用UPLC-Q-Exactive MS 對(duì)五種前處理方法進(jìn)行比較分析, 結(jié)合PCA 和OPLS-DA 化學(xué)計(jì)量學(xué)方法, 挖掘攝食不同產(chǎn)毒藻后貽貝體內(nèi)的化學(xué)差異, 篩選區(qū)分?jǐn)z食不同產(chǎn)毒藻貽貝中的特征指紋物質(zhì), 構(gòu)建特征指紋溯源技術(shù)模型, 快速精準(zhǔn)的識(shí)別潛在風(fēng)險(xiǎn)以便提高麻痹性貝類(lèi)毒素風(fēng)險(xiǎn)源頭識(shí)別。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用藻株包括鏈狀亞歷山大藻(A.catenella,GY-H25)、微小亞歷山大藻(A.minutum, GY-H46)和鏈狀裸甲藻(G.catenatum, GY-H65)購(gòu)自上海光語(yǔ)生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)以f/2 培養(yǎng)液?jiǎn)畏N培養(yǎng), 溫度為(20±1) °C, 光照為6 000 lx; 光暗比12 h∶12 h。餌料藻選用小球藻(Chlorellavulgaris), 置于-20 °C冰箱保存。

樣品前處理及色譜質(zhì)譜條件優(yōu)化采用取自秦皇島貽貝重點(diǎn)養(yǎng)殖區(qū)的紫貽貝(Mytilusgalloprovincialis),經(jīng)檢測(cè)為麻痹性貝類(lèi)毒素陽(yáng)性貝, 毒素含量為1 008 μg STXeq/kg。

指紋溯源技術(shù)建立采用購(gòu)于山東青島碼頭紫貽貝(Mytilusgalloprovincialis), 平均規(guī)格為: 殼長(zhǎng)(40.0±1.9) mm, 殼寬(22.6±0.8) mm, 總重(6.0±0.6) g,購(gòu)入后先在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行馴化, 每天持續(xù)通氣并更換海水。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置3 組, 每200 只紫貽貝為一組, 培養(yǎng)于24 h 通氣的天然海水養(yǎng)殖容器環(huán)境下。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫貽貝室內(nèi)暴露實(shí)驗(yàn) 各取1 mL 混勻后的鏈狀亞歷山大藻、微小亞歷山大藻和鏈狀裸甲藻的藻液, 加入20 μL 魯哥試劑(Lugol’s agent)固定, 在顯微鏡下計(jì)數(shù)藻細(xì)胞密度。按照A.catenella組和A.minutum組投喂量約為1×105cells/(inds.·d),G.catenatum組投喂量約為 2×105cells/(inds.·d), 早晚各喂一次,輕微曝氣。實(shí)驗(yàn)共持續(xù)14 d, 投喂產(chǎn)毒藻7 d, 投喂餌料藻7d 。分別取0 (對(duì)照)、1、3、7 和14 d 的紫貽貝樣品, 每組樣品設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù), 毒素分析樣品為3 只貝混樣; 特征物質(zhì)分析樣品為6 只貝混樣, 均解剖紫貽貝并采集全部軟組織, 于-80 °C 下冷凍保存。

1.2.2 產(chǎn)毒藻和貽貝中麻痹性貝類(lèi)毒素組成分析 將指數(shù)生長(zhǎng)期的藻液取20 mL 于離心管中, 2 760 ×g離心5 min, 收集藻細(xì)胞置于15 mL 離心管中, 加入5 mL 1%乙酸水溶液。將其置于冰浴中, 使用超聲波細(xì)胞破碎儀(JY92- ⅡN, 寧波新芝生物科技股份有限公司)對(duì)藻類(lèi)樣品進(jìn)行破碎(設(shè)置全程時(shí)間5 min、間隔時(shí)間2 s、功率比50%)。鏡檢確認(rèn)藻細(xì)胞完全破碎后, 將離心管置于高速冷凍離心機(jī)(Himac CR 22G,日本 Hitachi 公司)中, 2 760 ×g離心5 min, 供測(cè)試。將貽貝開(kāi)殼用生理鹽水清洗后取軟組織, 瀝水均質(zhì), 參考Boundy 等(2015)等方法進(jìn)行麻痹性貝類(lèi)毒素提取及測(cè)試。

1.2.3 特征指紋物質(zhì)的前處理方法 取(1.00±0.02) g麻痹性貝類(lèi)毒素陽(yáng)性紫貽貝樣品轉(zhuǎn)移至5 mL 離心管(分為5 組, 每組6 個(gè)平行), 按照表1 中五種方法進(jìn)行前處理, 提取液經(jīng)12 470 ×g離心5 min 后, 供測(cè)試。

1.2.4 液相條件 Q-Exactive 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(Q-Exactive, 美國(guó) Thermo 公司)C8 色譜柱體系:Kinetex C8 (150 mm×2.1 mm, 2.6 μm); 梯度洗脫程序:0～0.5 min, 20% A; 0.5～5.0 min, 20%～90% A;5.0～14.0 min, 90% A; 14.0～15.0 min, 80% A。Amide色譜柱體系: TSK-Amide-80 柱(2 mm×15 cm, 3 μm);梯度洗脫程序: 0～1.0 min, 80% A; 1.0～4.0 min, 80%～40% A; 4.0～6.5 min, 40% A; 6.5～8.0 min, 40%～80%A;8.1～10.0 min, 80% A。

柱溫: 40 °C; 進(jìn)樣量: 10 μL; 流速: 0.35 mL/min;流動(dòng)相為: A 相為95%乙腈水(含2 mmol/L 甲酸銨,50 mmol/L 甲酸), B 相為水(含2 mmol/L 甲酸銨,50 mmol/L 甲酸)。

1.2.5 質(zhì)譜條件 Q-Exactive 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀使用加熱電噴霧離子源(HESI), 掃描模式: 全掃描/數(shù)據(jù)依賴(lài)二級(jí)子離子掃描(Full MS/dd MS2); 噴霧電壓: 3 500 V; 毛細(xì)管和加熱器溫度: 320 和50 °C; 鞘氣和輔助氣: 40 和10 arb; 分辨率用半峰高處的全峰寬(FWHM)表示, 一級(jí)全掃描分辨率: 70 000 FWHM;trap 最大容量(AGC target): 1×106; C-trap 最大注入時(shí)間: 150 ms, 數(shù)據(jù)依賴(lài)二級(jí)離子掃描分辨率: 17 500 FWHM; C-trap 最大容量(AGC target): 1×105; C-trap最大注入時(shí)間: 50 ms; 質(zhì)譜掃描范圍: 質(zhì)荷比(m/z)100～600 和600～1 500。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 樣品前處理及色譜質(zhì)譜分析 按照時(shí)間順序在色譜圖中隨機(jī)選取峰強(qiáng)度大于1×105的10 個(gè)離子峰, 分別計(jì)算每種方法6 個(gè)樣品的峰強(qiáng)度均值, 計(jì)算每種方法貽貝樣品中所測(cè)的10 個(gè)離子峰峰強(qiáng)度及其變異系數(shù)(Coefficient of variation, CV=標(biāo)準(zhǔn)差/均值)。5 種前處理方法所測(cè)峰強(qiáng)度以均值表示, 多組間比較采用隨機(jī)區(qū)組的單因素方差分析, 若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 進(jìn)一步的兩兩比較采用Bonferroni 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3.2 特征指紋物質(zhì)分析 原始數(shù)據(jù)使用Compound Discoverer 3.1 軟件進(jìn)行峰檢測(cè)、保留時(shí)間對(duì)齊等預(yù)處理。采用數(shù)據(jù)庫(kù)(ChemSpider, mzCloud 等)從精確質(zhì)量數(shù)、同位素組成及分布與預(yù)測(cè)分子式的吻合度、一級(jí)質(zhì)譜/二級(jí)質(zhì)譜碎片和數(shù)據(jù)庫(kù)匹配等方面進(jìn)行化合物初步鑒定, 其中設(shè)置參數(shù)如下: 保留時(shí)間最大漂移值0.2 min; 質(zhì)量偏差＜5×10-6; 信號(hào)強(qiáng)度偏差＜30%;峰強(qiáng)度最小值度50 000, 同時(shí)設(shè)置基質(zhì)空白去除, 不進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。由于特征物質(zhì)沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品, 采用STX 標(biāo)準(zhǔn)品曲線(xiàn)進(jìn)行相對(duì)定量分析計(jì)算其濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2021、Origin 2023、SIMCA 14.1 和IBM SPSS Statistics 22 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。在Excel 2021 中將數(shù)據(jù)整理為二維矩陣形式, 保留P值、m/z值、保留時(shí)間、分子式、峰面積等信息,根據(jù)P值篩選出差異顯著的化合物(P＜0.01); 以化合物的峰面積為變量,m/z值作為觀測(cè)ID 將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1 進(jìn)行PCA 與OPLS-DA 分析; 根據(jù)VIP＞1作為特征指紋物質(zhì)。采用逐步判別法對(duì)3 組樣品的13 個(gè)復(fù)合指紋物質(zhì)特征建立3 個(gè)群體的Fisher 線(xiàn)性判別函數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理及色譜質(zhì)譜條件選擇

通過(guò)對(duì)比不同色譜和質(zhì)譜條件結(jié)果如圖1 所示,兩種色譜柱均為方法D 檢測(cè)到的化合物數(shù)量最多。采用C8 色譜柱時(shí)(圖1a), 正離子模式m/z100～600 掃描范圍下檢測(cè)到的化合物數(shù)量最多為3 374 個(gè), 負(fù)離子模式m/z100～600 掃描范圍次之; 采用Amide 色譜柱時(shí)(圖1b)負(fù)離子模式m/z100～600 的掃描范圍下檢測(cè)到的化合物最多為1 785 個(gè), 正離子模式m/z600～1 500 掃描范圍次之。因此方法D 檢測(cè)到的化合物達(dá)到了6 811 個(gè), 更加適合對(duì)特征物質(zhì)的提取。

圖1 不同前處理方法在每種色譜質(zhì)譜條件下的特征物質(zhì)數(shù)量Fig.1 The amount of compounds in each mode for different pretreatment method

此外, 根據(jù)不同方法的峰強(qiáng)度變異系數(shù)(CV 值)來(lái)分析不同的質(zhì)譜條件。采用C8 色譜柱時(shí), 離子峰強(qiáng)均值在正離子模式m/z100～600 和m/z600～1 500掃描范圍下大于1×107且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);比較其CV 值, 方法D 在正離子模式m/z600～1 500掃描范圍下CV 值最小。采用Amide 色譜柱時(shí), 方法D 在正離子模式m/z600～1 500 掃描范圍下的峰強(qiáng)最高為5.49×107且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05), CV 值＜25% (表2)。因此, 選擇方法D 在C8 色譜柱正離子模式m/z100～600 的掃描范圍和Amide 色譜柱正離子模式m/z600～1 500 的掃描范圍下更適用于貽貝的特征物質(zhì)分析, 覆蓋的化合物數(shù)量占總檢測(cè)量的40.4%。在方法D 兩種色譜質(zhì)譜條件下, 分別在QC 樣品色譜圖的前、中、后隨機(jī)共選取10 個(gè)離子峰進(jìn)行分析, 其CV 值均≤1.00%, 各峰面積和峰強(qiáng)度的CV 值均＜25.00%。以上結(jié)果表明本研究樣品分析過(guò)程中儀器的精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性均較好, 滿(mǎn)足分析要求。

表2 不同前處理方法測(cè)得的峰強(qiáng)及CV 值Tab.2 Peak intensity and CV values of different pretreatment methods

2.2 紫貽貝攝食不同產(chǎn)毒藻后體內(nèi)麻痹性貝類(lèi)毒素分析

紫貽貝攝食不同產(chǎn)毒藻后麻痹性貝類(lèi)毒素的變化情況如圖2 所示, 在前7 天為毒素蓄積階段, 紫貽貝中的麻痹性貝類(lèi)毒素含量不斷上升, 由暴露1 天毒素含量最低為54.1 μg STXeq/kg, 到7 天時(shí)毒素含量最高為5 538 μg STXeq/kg; 7 天到14 天為代謝階段(停止投喂產(chǎn)毒藻), 至 14 天時(shí)毒素含量最低降至267 μg STXeq/kg。

圖2 紫貽貝攝食不同產(chǎn)毒藻后體內(nèi)麻痹性貝類(lèi)毒素含量及組成Fig.2 Variation of toxin content and composition after ingestion of different toxin producing algae by M. galloprovincialis

在投喂產(chǎn)毒藻的紫貽貝體內(nèi)共檢出11 種麻痹性貝類(lèi)毒素成分, 不同組樣品毒素成分差異顯著。投喂A.catenella的紫貽貝中麻痹性貝類(lèi)毒素主要成分為C1&2 和GTX5, 在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中C1&2 占比從第1 天68.6%下降到第14 天的49.8%; 投喂A.minutum的紫貽貝中麻痹性貝類(lèi)毒素主要成分為GTX1&4 和GTX2,且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間各成分占比穩(wěn)定; 投喂G.catenatum的紫貽貝中麻痹性貝類(lèi)毒素主要成分為dcGTX2&3、dcSTX 和C1&2, 其中dcSTX 占比從第1 天的10.9%增高到第14 天的21.5%; 而C2 的占比從21.5%降至4.02%。因此, 攝食不同產(chǎn)毒藻后紫貽貝體內(nèi)的毒素成分有明顯差異且隨時(shí)間發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化, 還需對(duì)紫貽貝體內(nèi)的代謝物進(jìn)行檢測(cè)。

2.3 多元統(tǒng)計(jì)分析

2.3.1 主成分分析 本研究使用上述乙腈/甲醇/丙酮(體積比為1∶1∶1)作為提取劑的提取方法結(jié)合篩選出的兩個(gè)離子通道, 經(jīng)過(guò)軟件處理后, 提取了3 886 個(gè)化合物, 利用P＜0.01 篩選差異化合物并結(jié)合毒素成分進(jìn)行PCA 分析, 如圖3 所示, 前兩個(gè)主成分分別解釋了總變量的 36.9%和 18.3%, 共解釋了55.2%的變量。三組樣品分別沿PC1 或PC2 軸分離,表明攝食不同產(chǎn)毒藻貽貝中化合物存在差異。

圖3 投喂三種不同產(chǎn)毒藻后貽貝中差異化合物PCA 圖Fig.3 PCA of different compounds and toxins in M.galloprovincialis fed with three different toxic microalgae

2.3.2 正交偏最小二乘判別分析 對(duì)投喂A.catenella、A.minutum和G.catenatum的貽貝經(jīng)篩選后結(jié)合毒素進(jìn)行OPLS-DA 分析, 如圖4a～4c 所示。三組樣品中的化合物顯著分離, 自變量擬合指數(shù)分別為0.724、0.860、0.846, 自變量擬合指數(shù)分別為1.00、1.000、0.969, 模型預(yù)測(cè)指數(shù)(Q2)為0.985、0.982、0.988, 表明當(dāng)前OPLS-DA 模型穩(wěn)定可靠, 具有良好的預(yù)測(cè)性。經(jīng)OPLS-DA 模型分析分別生成S-plots 圖, 如圖4d～4f 所示。OPLS- DA 模型中變量VIP＞1.0 說(shuō)明該變量對(duì)整體模型的貢獻(xiàn)度高于平均水平, 作為本研究的毒素和特征指紋物質(zhì)。此外, 毒素成分NEO 和dcNEO 作為攝食A.catenella和G.catenatum后紫貽貝的特有成分也被作為指紋物質(zhì),共計(jì)13 種復(fù)合指紋物質(zhì)。根據(jù)精確分子質(zhì)量、保留時(shí)間以及二級(jí)質(zhì)譜碎片等與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)參數(shù)如表3 所示。

表3 復(fù)合指紋物質(zhì)Tab.3 Composite fingerprint substances

2.4 判別分析

根據(jù)篩選的復(fù)合指紋物質(zhì), 建立基于Fisher 判別函數(shù)的一般判別方法。以篩選出來(lái)的13 種復(fù)合指紋物質(zhì)作為判別分析的自變量, 對(duì)貽貝樣品進(jìn)行多變量判別分析, 排除了7 種對(duì)分類(lèi)作用較小的指紋物質(zhì),僅保留6 種指紋物質(zhì)用于判別分析, 建立Fisher 線(xiàn)性判別函數(shù)如下:

式中:Y分別表示暴露于不同產(chǎn)毒藻貽貝的判別得分;C329.22、C381.14、C461.31、C374.21、CNEO、CdcNEO分別表示分子質(zhì)量為329.22、381.14、461.31、374.21 的特征指紋物質(zhì)和毒素NEO、dcNEO?；卮鷻z驗(yàn)正確判別率為100%, 交叉驗(yàn)證正確率為88.9%, 表明6 種特征指紋成分對(duì)貽貝的判別效果較好。

3 討論

麻痹性貝類(lèi)毒素的風(fēng)險(xiǎn)形成過(guò)程, 亦是從產(chǎn)毒藻信息向貝類(lèi)傳遞的過(guò)程。通過(guò)傳統(tǒng)的監(jiān)管手段不僅耗費(fèi)大量的人力物力財(cái)力, 對(duì)于近年來(lái)常見(jiàn)的小規(guī)模有害赤潮爆發(fā)作用有限(Fernandes-Salvadoretal,2021)。研究利用UPLC-Q-Exactive MS 結(jié)合PCA 分析與OPLS-DA 分析, 從攝食3 種麻痹性貝類(lèi)毒素產(chǎn)毒藻的紫貽貝樣品里共篩選出13 種復(fù)合指紋物質(zhì),對(duì)攝食不同藻的紫貽貝進(jìn)行成功溯源。由于有毒藻種類(lèi)和生態(tài)學(xué)特征不同, 其所產(chǎn)PSTs 的種類(lèi)和含量也有很大差異(Guetal, 2013), 因此造成了貝類(lèi)中PSTs風(fēng)險(xiǎn)表征差異明顯, 這為識(shí)別PSTs 風(fēng)險(xiǎn)源頭提供了重要依據(jù)。Lewis 等(2022)用蘇格蘭的鏈狀亞歷山大藻和英格蘭南部的鏈狀亞歷山大藻分別投喂紫貽貝測(cè)定其體內(nèi)的毒素譜, 根據(jù)毒素譜差異成功區(qū)分了攝食兩種產(chǎn)毒藻的樣品。同時(shí)有研究(Yanetal, 2022)表明不同產(chǎn)毒藻的毒素組成及毒性大小存在著較大差別, 并且我國(guó)的毒素分布也具有區(qū)域性特征。由于雙殼貝類(lèi)攝食產(chǎn)毒藻后毒素會(huì)在體內(nèi)發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化,如攝食鏈狀亞歷山大藻后的紫貽貝中毒素成分隨時(shí)間發(fā)生轉(zhuǎn)化, C2 占比減小而GTX5 占比增加(張海濤等, 2023), 蛤仔在攝食微小亞歷山大藻后毒素的積累階段, GTX1&4 的占比逐漸增加, 在排出階段占比下降( 焦玥 等, 2010), 這與本研究結(jié)果一致。在之前研究中發(fā)現(xiàn)這種代謝轉(zhuǎn)化會(huì)受到投喂產(chǎn)毒藻量(Chenetal,2001)、環(huán)境的酸堿性(Cheetal, 2020)等因素影響, 因此僅根據(jù)毒素信息無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確分類(lèi)。

研究表明, 含水的有機(jī)提取劑如甲醇水溶液(Sidwicketal, 2017)可以有效地提取極性代謝物, 而非極性代謝物常選擇氯仿、二氯甲烷等有機(jī)試劑(Caoetal,2020)進(jìn)行提取。通過(guò)比較了5 種高效前處理方法, 經(jīng)過(guò)扣除空白貽貝基質(zhì)干擾后, 最終選擇了乙腈/甲醇/丙酮作為提取劑的提取方法, 可以有效地移除大分子蛋白質(zhì)(Lietal, 2017), 提高弱極性和非極性物質(zhì)(Mushtaqetal, 2014)的提取效率。通過(guò)比較, 特征物質(zhì)的提取方法和色譜質(zhì)譜方法差異系數(shù)較小, 表明儀器穩(wěn)定較好(李倩倩等, 2021), 可為后續(xù)特異性物質(zhì)的篩選提供了方法。采用PCA 分析發(fā)現(xiàn), 三組樣品有明顯分離; 進(jìn)一步采用OPLS-DA 分析, 剔除無(wú)關(guān)數(shù)據(jù)使得模型更加易于解釋, 可視化效果更加明顯(鐘若梅等, 2018)。劉鴿等(2021)采用PCA 與OPLSDA 分析, 通過(guò)VIP 值＞1 以及P＜0.05 篩選出暴露無(wú)機(jī)砷后三疣梭子蟹的100 種差異代謝產(chǎn)物。Vera 等(2019)等采用主成分分析(PCA)并比較獨(dú)立建模(SIMCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)作為化學(xué)計(jì)量學(xué)分類(lèi)方法, 實(shí)現(xiàn)了對(duì)品種特級(jí)初榨橄欖油的地理來(lái)源高靈敏和無(wú)偏差的鑒定。進(jìn)一步采用Fisher線(xiàn)性判別模型構(gòu)建判別函數(shù), 可在變量服從正態(tài)分布、沒(méi)有顯著相關(guān)或變量的平均值和方差不相關(guān)使效果較好(李洪成等, 2017)。歐陽(yáng)建等(2022)通過(guò)對(duì)黃金茶綠茶風(fēng)味的測(cè)定將52 個(gè)樣品分為醇厚型、鮮爽型和其他型3 種滋味類(lèi)型。開(kāi)建榮等(2022)構(gòu)建枸杞原產(chǎn)地鑒別的判別模型, 模型的正確判別率達(dá)到了97.3%。目前, 未見(jiàn)Fisher 線(xiàn)性判別模型用于對(duì)攝食麻痹性貝類(lèi)毒素產(chǎn)毒藻的溯源報(bào)道。本研究引入6 種物質(zhì)構(gòu)建的判別模型交叉驗(yàn)證準(zhǔn)確率達(dá)到了88.9%,預(yù)測(cè)效果較為理想。指紋識(shí)別技術(shù)需要結(jié)合識(shí)別和鑒定(Cuadros-Rodríguezetal, 2021)兩個(gè)過(guò)程, 為了達(dá)到更好地溯源目的還需要進(jìn)一步的現(xiàn)場(chǎng)驗(yàn)證。同時(shí),由于在同一海域往往會(huì)存在多種產(chǎn)毒藻且毒素成分會(huì)更加復(fù)雜, 如遼東灣曾檢測(cè)出安氏亞歷山大藻、偽亞歷山大藻和李氏亞歷山大藻等(宋倫等, 2018), 長(zhǎng)江口海域則為塔瑪亞歷山大藻和鏈狀亞歷山大藻(高巖等, 2016)。因此, 需持續(xù)采集典型藻株特征物質(zhì)識(shí)別以增加溯源技術(shù)的準(zhǔn)確度和適用性。

4 結(jié)論

通過(guò)優(yōu)化前處理方法, 確定了甲醇/乙腈/丙酮(體積比為 1∶1∶1)作為提取劑; 采用 Q-Exactive Orbitrap 篩選 C8 色譜柱中正離子掃描模式m/z100～600 的掃描范圍和Amide 色譜柱正離子掃描模式m/z600～1 500 的掃描范圍, 可獲得40.4%的指紋信息。通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)篩選出攝食不同產(chǎn)毒藻貽貝的13 種復(fù)合指紋物質(zhì), 構(gòu)建了判別模型交叉驗(yàn)證準(zhǔn)確率達(dá)到了88.9%。研究成果有助于提高麻痹性貝類(lèi)毒素區(qū)域風(fēng)險(xiǎn)源頭的準(zhǔn)確識(shí)別能力, 為防范食用安全風(fēng)險(xiǎn)提供了科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。