單雄威，羅涵文，古熾明，甘 澍

膀胱癌（bladder cancer，BCa）是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。近年來(lái)我國(guó)膀胱癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，其中1998—2008 年間膀胱癌發(fā)病率年均增長(zhǎng)率高達(dá)4.6%[1-2]。經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)是治療非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的主要方法，但術(shù)后5年復(fù)發(fā)率約為50%～70%[2]。抑制膀胱癌增殖復(fù)發(fā)是臨床中亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

淫羊藿屬于小檗科植物，其主要有效成分為黃酮類化合物，包括淫羊藿素、淫羊藿苷和槲皮素等，具有廣泛的生物學(xué)活性，可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和促進(jìn)細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過(guò)程抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿素能有效抑制膀胱癌細(xì)胞T24 和BT5637 的增殖和克隆形成，并且這種抑制作用呈劑量和時(shí)間依賴性；且淫羊藿素還能抑制表柔比星誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，協(xié)同表柔比星抑制T24和BT7637 細(xì)胞增殖[5]。雖然，淫羊藿能有效抑制膀胱癌細(xì)胞增殖，但其有效成分及作用機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及生物信息學(xué)技術(shù)探究淫羊藿基于CCNB1 誘導(dǎo)CD8+T 細(xì)胞浸潤(rùn)在膀胱癌中的作用及機(jī)制，為淫羊藿治療膀胱癌提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 靶點(diǎn)篩選 首先，應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP)[6]，按藥物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug likeness,DL）≥0.18 篩選淫羊藿的有效活性成分。并利用TCMSP 檢索藥物活性成分作用靶點(diǎn)，將檢索到的靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niProt（https://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化匹配，并過(guò)濾未驗(yàn)證的靶點(diǎn)。其次，從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（gene expression omnibus，GEO）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds）下載基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE13507（正常組織9 例，腫瘤組織165例）和GSE37815（正常組織5 例，腫瘤組織18 例），利用R 語(yǔ)言limma 包篩選出差異表達(dá)基因（｜logFC｜≥1或P<0.05）。最后，利用R 語(yǔ)言（R version3.6.2）將藥物活性成分靶點(diǎn)與差異基因取交集，獲得藥物-疾病共同作用靶點(diǎn)。

1.2 UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù) 利用UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/）[7]結(jié)合癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)分析CCNB1 表達(dá)與膀胱癌臨床及病理資料的相關(guān)性。

1.3 CCNB1 表達(dá)對(duì)膀胱癌預(yù)后的影響 利用TCGA 和GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中膀胱癌臨床信息，交互印證分析CCNB1 表達(dá)對(duì)膀胱癌患者預(yù)后的影響。

1.4 免疫浸潤(rùn)相關(guān)性分析 利用TIMER（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）[8]分析膀胱癌中CCNB1表達(dá)與B 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及CD8+T 細(xì)胞等6 種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性。并進(jìn)一步探究腫瘤免疫浸潤(rùn)與患者預(yù)后的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)或Mann-Whitney U 檢驗(yàn)，預(yù)后的影響因素采用Cox 回歸分析，P<0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿有效活性成分及靶點(diǎn) 應(yīng)用TCMSP 對(duì)淫羊藿有效活性成分及藥物作用靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，共檢索到有效成分130 個(gè)，根據(jù)OB≥0.30 和DL≥0.18 共篩選出23 個(gè)有效成分。利用Perl 軟件和UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)TCMSP 檢索到的23 個(gè)有效成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化匹配和過(guò)濾，得到390 個(gè)藥物作用靶點(diǎn)，而作用靶點(diǎn)最多的有效成分為槲皮素（60）、木犀草素（33）和山柰酚（19）（表1），提示槲皮素、木犀草素和山柰酚可能是淫羊藿治療膀胱癌的關(guān)鍵有效成分。

表1 3 組患者一般資料比較

2.2 藥物疾病共同靶點(diǎn) 將藥物有效成分作用靶點(diǎn)與GSE13507 和GSE37815 差異基因取交集，得到11 個(gè)共同靶點(diǎn)（圖1 A），對(duì)應(yīng)活性成分為槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin） 和山柰酚（kaempferol）等共8 種（表1），其中活性成分作用最多的靶點(diǎn)為GSK3B（4）和CCNB1（2），提示GSK3B 和CCNB1 可能是淫羊藿治療膀胱癌的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

圖1 藥物- 疾病共同靶點(diǎn)及在膀胱癌組織中表達(dá)情況

2.3 靶點(diǎn)基因在膀胱癌中的差異表達(dá)情況及與預(yù)后的關(guān)系 使用TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中膀胱癌RNAseq 數(shù)據(jù)分析11 個(gè)靶點(diǎn)基因在膀胱癌中配對(duì)表達(dá)情況，結(jié)果表明GSK3B、CCNB1、TOP2A、E2F2 和IGFBP3在膀胱癌組織中表達(dá)顯著高于正常組織。BCL2、CCL2、VCAM1、F3 和MAOB 在膀胱癌組織中表達(dá)顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。VEGFA在膀胱癌組織與正常組織中表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05，見(jiàn)圖1 B）。

TCGA 膀胱癌數(shù)據(jù)預(yù)后分析結(jié)果顯示：VCAM1、F3、MAOB 及CCNB1 高表達(dá)患者總生存期（overall survival，OS）預(yù)后較差，其中CCNB1 高表達(dá)膀胱癌患者的OS、疾病特異性生存期（disease specific survival，DSS）及無(wú)進(jìn)展間隔（progress free interval，PFI） 均較差（見(jiàn)圖2A-2L）。同時(shí)采用GSE13507 臨床數(shù)據(jù)再次印證CCNB1 高表達(dá)膀胱癌患者OS 及DSS 預(yù)后較差（見(jiàn)圖2M-2N）。上述結(jié)果表明CCNB1 在膀胱癌組織中表達(dá)情況與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步采用ROC 曲線圖驗(yàn)證CCNB1 在預(yù)測(cè)膀胱癌患者預(yù)后方面的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示：CCNB1 在預(yù)測(cè)膀胱癌患者預(yù)后方面具有較好的診斷效能（AUC = 0.901，CI = 0.831～0.972，見(jiàn)圖2O）。

2.4 CCNB1 表達(dá)與膀胱癌患者臨床及病理因素的相關(guān)性 UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)分析CCNB1 表達(dá)與種族、性別、年齡、體重、吸煙情況、腫瘤組織學(xué)類型、Stage 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，結(jié)果表明：除年齡21～40 歲亞組及Stage 1 期膀胱癌患者CCNB1表達(dá)與正常組織差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余所有膀胱癌患者CCNB1 表達(dá)均高于正常組織（P＜0.05）。亞組分析結(jié)果顯示：白種人及非裔美國(guó)人膀胱癌患者CCNB1 表達(dá)兩者間無(wú)差異，但均高于亞洲人（P＜0.001），提示CCNB1 表達(dá)可能與種族相關(guān)。年齡亞組分析：41～60 歲亞組、61～80 歲亞組及81～100 歲亞組膀胱癌患者CCNB1 表達(dá)均高于21～40 歲亞組（P＜0.001），但三組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組織學(xué)類型亞組分析：非乳頭狀膀胱癌患者CCNB1 表達(dá)較乳頭狀瘤患者明顯升高（P<0.001），提示CCNB1 表達(dá)與腫瘤組織類型相關(guān)。而性別、體重、吸煙情況、Stage 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移亞組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05，見(jiàn)圖3）。

圖3 CCNB1 表達(dá)與膀胱癌患者臨床及病理因素的相關(guān)性

2.5 CCNB1 表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)及預(yù)后的相關(guān)性 利用TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)分析膀胱癌中CCNB1 表達(dá)與B 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞浸潤(rùn)及預(yù)后相關(guān)性。結(jié)果顯示：CCNB1 表達(dá)與CD8+T 細(xì)胞（r=0.315,P<0.001）、中性粒細(xì)胞（r= 0.228,P< 0.001）及樹突狀細(xì)胞（r=0.397,P< 0.001）浸潤(rùn)呈正相關(guān)（見(jiàn)圖4 A）。進(jìn)一步利用TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)分析CCNB1 表達(dá)和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)對(duì)膀胱癌預(yù)后的影響，結(jié)果顯示：CCNB1 表達(dá)和CD8+T 細(xì)胞浸潤(rùn)與膀胱癌預(yù)后相關(guān)，CD8+T 細(xì)胞浸潤(rùn)水平越高患者預(yù)后越差（P= 0.006, 見(jiàn)圖4 B）。最后，本研究分析了膀胱癌中CCNB1 表達(dá)與T 細(xì)胞及CD8+T 細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示：CCNB1 與CD8A（r=0.186,P<0.001）及CD8B（r=0.13,P< 0.001）表達(dá)呈正相關(guān)（見(jiàn)圖4 C）。提示CCNB1 可通過(guò)調(diào)節(jié)膀胱癌組織中CD8+T 細(xì)胞浸潤(rùn)影響患者預(yù)后情況。

圖4 CCNB1 表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)及預(yù)后的相關(guān)性

3 討論

本研究首次應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)分析淫羊藿治療膀胱癌的有效成分及作用靶點(diǎn)，共篩選出11 個(gè)藥物疾病共同靶點(diǎn)，作用靶點(diǎn)最多的有效成分為槲皮素、木犀草素和山柰酚，活性成分作用最多的靶點(diǎn)為GSK3B 和CCNB1，其中CCNB1 高表達(dá)于膀胱癌組織中，且CCNB1 高表達(dá)患者OS、DSS 及PFI 預(yù)后均較差，CCNB1 可通過(guò)調(diào)節(jié)CD8+T 細(xì)胞浸潤(rùn)影響患者預(yù)后情況。

槲皮素、木犀草素和山柰酚均屬于天然黃酮類物質(zhì)，具有抗腫瘤作用。槲皮素通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞存活信號(hào)通路（如：PI3K/AKT 和FOXO1 等）、凋亡調(diào)節(jié)分子（如：caspase 和Bcl-2 家族等）、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白（如：p21、cyclinB 和p27 等）和活性氧自由基（ROS）形成等，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和侵襲，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[3,9]。體外實(shí)驗(yàn)表明槲皮素可通過(guò)作用多個(gè)靶點(diǎn)和通路（如：增強(qiáng)AMPK 磷酸化水平，DNA 損傷等）抑制膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤侵襲和遷移[3,10]。此外，槲皮素能夠協(xié)同順鉑抑制膀胱癌細(xì)胞生物活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。木犀草素通過(guò)調(diào)節(jié)ADP 核糖聚合酶水解、DNA 碎片化和多聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（PARP）斷裂，誘導(dǎo)膀胱癌RT112 細(xì)胞凋亡[4]。木犀草素亦可通過(guò)上調(diào)p21 表達(dá)及抑制mTOR 信號(hào)通路，使細(xì)胞阻滯在G2/M 期，抑制膀胱癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。山柰酚通過(guò)抑制AKT、CyclinD1、CDK4、Bid、Mcl-1、Bcl-xL 磷酸化，并促進(jìn)p53 信號(hào)通路活化，使細(xì)胞滯留S 期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制膀胱癌生長(zhǎng)[13]。

細(xì)胞周期蛋白B1（cyclin B1，CCNB1）是細(xì)胞成熟促進(jìn)因子（maturation promoting factor，MPF）調(diào)節(jié)亞單位，與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1 結(jié)合啟動(dòng)有絲分裂，在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G2/M 轉(zhuǎn)換中發(fā)揮關(guān)鍵作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)CCNB1 在胰腺癌[14]、肺癌[15]及肝癌[16]等多種腫瘤呈高表達(dá)狀態(tài)，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和周期分布參與腫瘤發(fā)生發(fā)展，且與患者預(yù)后不良密切相關(guān)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)CCNB1 高表達(dá)于膀胱癌組織中，且高表達(dá)患者預(yù)后較差[17-18]。體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，抑制CCNB1 表達(dá)能夠顯著抑制膀胱癌細(xì)胞增殖及生長(zhǎng)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)CCNB1 高表達(dá)膀胱癌患者OS、DSS 及PFI 均較差，CCNB1 在腫瘤組織中的表達(dá)情況與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，與上述研究結(jié)果基本一致。診斷ROC 曲線圖提示CCNB1 在預(yù)測(cè)膀胱癌患者預(yù)后方面具有較好的診斷效能，提示CCNB1可作用膀胱癌藥物治療的新靶點(diǎn)。

研究發(fā)現(xiàn)肝癌中CCNB1 mRNA 表達(dá)與患者種族顯著相關(guān)[20]。本研究中白種人及非裔美國(guó)人膀胱癌患者CCNB1 表達(dá)均高于亞洲人，可能與歐洲及北美地區(qū)膀胱癌患者發(fā)病率較高相關(guān)[21]。吸煙是膀胱癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素，然而本研究中CCNB1 表達(dá)與患者吸煙情況無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示吸煙可能不是通過(guò)介導(dǎo)CCNB1 表達(dá)影響膀胱癌患者預(yù)后情況。研究發(fā)現(xiàn)CCNB1 表達(dá)增加可作為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌復(fù)查的標(biāo)志，提示CCNB1 表達(dá)可能與膀胱癌病理類型及腫瘤惡性程度相關(guān)[18]。本研究中非乳頭狀膀胱癌患者CCNB1 表達(dá)較乳頭狀瘤患者明顯升高，表明CCNB1 表達(dá)與腫瘤病理類型及惡性程度相關(guān)，與上述研究結(jié)果基本相符。

腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞浸潤(rùn)與腫瘤免疫逃逸密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中CCNB1 表達(dá)與CD4+T細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)，表明CCNB1 參與腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)調(diào)控，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸[16]。本研究發(fā)現(xiàn)CCNB1 表達(dá)與CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞浸潤(rùn)呈正相關(guān)，且CD8+T 細(xì)胞浸潤(rùn)與膀胱癌預(yù)后相關(guān)，CD8+T 細(xì)胞浸潤(rùn)水平越高患者預(yù)后越差，表明膀胱癌中CCNB1高表達(dá)通過(guò)誘導(dǎo)CD8+T 細(xì)胞浸潤(rùn)實(shí)現(xiàn)腫瘤免疫逃逸，從而導(dǎo)致患者預(yù)后較差。與上述研究結(jié)果基本一致。

綜上所述，本研究結(jié)果表明槲皮素及木犀草素和山柰酚可能是淫羊藿治療膀胱癌的關(guān)鍵有效成分。CCNB1 是淫羊藿的主要作用靶點(diǎn)，高表達(dá)于膀胱癌組織中，并且與膀胱癌患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。CCNB1 表達(dá)與CD8+T 細(xì)胞浸潤(rùn)呈正相關(guān)，CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)水平越高患者預(yù)后越差。提示淫羊藿可通過(guò)靶向CCNB1 調(diào)節(jié)CD8+T 細(xì)胞浸潤(rùn)，從而影響膀胱癌患者預(yù)后。盡管本研究對(duì)淫羊藿治療膀胱癌的有效成分及分子機(jī)制進(jìn)行了初步探究，但由于藥物篩選條件過(guò)濾了部分活性成分，使結(jié)果具有局限性，同時(shí)CCNB1 調(diào)控CD8+T 細(xì)胞浸潤(rùn)詳細(xì)分子機(jī)制還有待基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。