張 越 梁 蕊 趙燦男 李春梅

（西南大學藥學院， 重慶 400715）

三磷酸腺苷（ATP）是生物體內(nèi)重要高能磷酸化合物，是細胞主要的能量來源［1］。每種生物體內(nèi)的ATP 的含量一般均在某一范圍內(nèi)，ATP 的異常濃度通常與不正常的生理活動有關［2］。因此，腫瘤細胞內(nèi)高濃度的ATP可以作為重要的生物標志物，為腫瘤早期診斷和及時治療提供有用的工具［3］。例如，正常人體內(nèi)ATP濃度通常小于0.4 mmol/L，而惡性腫瘤患者體內(nèi)因異常的細胞增殖與細胞代謝，腫瘤細胞內(nèi)的ATP濃度可達到1.5～15 mmol/L［4］?；熕幬锇l(fā)揮藥效使癌細胞凋亡，癌細胞內(nèi)ATP釋放至胞外使細胞外ATP 濃度升高，因此，通過對ATP 的動態(tài)監(jiān)測可以對藥物或生物活性物質(zhì)發(fā)揮作用效果進行評估，開發(fā)一種簡便、靈敏、快速和高效的ATP 檢測新方法具有重要意義。傳統(tǒng)用于ATP 含量檢測的方法主要有生物發(fā)光法［5］、高效液相法［6］、毛細管電泳法［7］和質(zhì)譜法［8］等。這些方法往往操作繁瑣、耗時長、特異性與靈敏度較低，且需要裂解細胞后提取ATP 進行含量分析，難以實現(xiàn)活細胞內(nèi)ATP 的原位動態(tài)監(jiān)測。隨著科學的不斷進步，越來越先進的檢測方法不斷涌現(xiàn)出來，如電化學分析法［9］、拉曼光譜法［10］、化學發(fā)光法［11］和熒光法［12］等。其中，熒光法不僅具有操作簡單、快速和靈敏度高等優(yōu)點，而且能用于活細胞的ATP 動態(tài)成像分析，在生化分析領域已得到廣泛應用［13］。核酸適配體是一種特殊類型的單鏈DNA 或RNA，能夠折疊成高度特異的結構，并且可以與特定的靶分子，如金屬離子、生物小分子和蛋白質(zhì)等特異性結合［14］。由于具有合成簡單、易修飾及長期穩(wěn)定性等獨特的優(yōu)點，且對特定的生物標記具有可調(diào)節(jié)的親和力，核酸適配體已在生物傳感、醫(yī)學成像和疾病治療等領域得到了廣泛的研究［15］。Liu 等［16］通過簡便的一鍋合成法成功構建了適配體sgc8c 修飾的DNA 四面體納米結構（s-TDN），用于將鹽酸阿霉素（DOX）靶向傳遞到高表達PTK7 的白血病細胞CCRF-CEM，從而最大限度地降低DOX 對非靶細胞的毒性。ATP 適配體因能與ATP 特異性結合，對ATP 的檢測具有重要意義，在許多研究中均有報道。Huang 等［17］設計了一個DNA 邏輯納米器件，結合i-motif 序列和ATP 適配體形成一種Y 形DNA（Y-DNA）結構，實現(xiàn)了溶酶體內(nèi)ATP水平監(jiān)測。Li等［18］設計了一種氧化還原激活的適配體傳感器，并結合納米粒子的靶向能力，實現(xiàn)了線粒體中ATP和谷胱甘肽（GSH）的空間控制和門控成像。

石墨烯是一種具有單原子厚度的二維材料，因其良好的生物相容性、高機械強度和高表面積等優(yōu)異性能，已被廣泛用于疾病標志物的分析檢測及細胞成像等領域［19］。石墨烯經(jīng)過氧化形成氧化石墨烯（Graphene oxide， GO），其表面含有羰基（—C= = O）、羧基（—COOH）和羥基（—OH）等含氧基團，化學性質(zhì)比石墨烯更加活潑，可以通過π-π堆積、疏水作用或化學偶聯(lián)等方式負載藥物、核酸、多肽和蛋白質(zhì)等進入細胞［20］。其中，GO 負載DNA 構建的熒光傳感平臺，不僅能提高DNA 探針進入細胞的效率，而且能增強探針在細胞內(nèi)的穩(wěn)定性和抗酶解能力。同時，GO 結構中的sp2電子雜化軌道使其具有極高的熒光猝滅能力，作為熒光能量轉(zhuǎn)移受體，展現(xiàn)出背景信號低和信噪比高等優(yōu)勢，目前已被廣泛用于分析檢測、細胞成像、藥物遞送及癌癥治療等過程監(jiān)測［21］。比如，Tang 等［22］利用分子信標修飾的GO 和DOX，開發(fā)了一種新型載藥納米系統(tǒng)，用于抑制藥物流出轉(zhuǎn)運蛋白p-糖蛋白的表達并通過多重基因沉默逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性。然而，通過物理吸附結合到GO上的單鏈DNA探針往往抗干擾能力較差。在復雜環(huán)境中，高濃度核酸和蛋白質(zhì)等生物分子容易通過物理吸附競爭性結合到GO 表面，使得GO 上的單鏈DNA 脫落，導致假陽性信號［23］。雖然將單鏈DNA 通過共價結合修飾到GO 表面能解決這一問題，但面臨過程繁瑣及修飾成本較高等問題［24］。因此，如何提高GO 表面物理吸附探針的抗干擾能力仍是一個挑戰(zhàn)。由于嘌呤在單個核苷酸水平上比嘧啶更容易被GO 吸附［25-26］，富含聚腺嘌呤（poly-A）的DNA 序列可以穩(wěn)定地錨定在氧化石墨烯上［27］，大大提高這種物理吸附探針的抗干擾能力。本課題組通過在GO 物理吸附的DNA 探針中引入poly-A 片段，由于poly-A 和GO 之間的牢固結合，大大減少了物理吸附帶來的假陽性信號，有效提高了該探針的抗干擾能力，實現(xiàn)了細胞凋亡相關miRNA的準確檢測與成像［28］。

基于此，設計了一種具有高抗干擾能力的GO-DNA 納米探針，用于ATP 的快速檢測及癌細胞內(nèi)DOX 的特異性釋放。如圖1 所示，ATP 的適配體與其互補序列（cDNA）雜交后形成雙鏈DNA（dsDNA），cDNA末端延伸了poly-A序列，用于穩(wěn)定吸附在GO表面。利用dsDNA的GC堿基對負載藥物DOX，并猝滅其熒光；進一步通過poly-A 序列吸附到GO 表面，構建GO-dsDNA-DOX 納米探針。ATP 通過與其適配體特異性結合形成復合物，使dsDNA 解鏈，DOX 釋放，熒光恢復，通過熒光“off-on”實現(xiàn)ATP 的定量分析。另一方面，ATP 作為重要的生物標志物，在腫瘤細胞微環(huán)境中比正常細胞含量高出許多。因此，利用腫瘤細胞內(nèi)高水平的ATP含量觸發(fā)GO-dsDNA-DOX探針中DOX特異性釋放，可實現(xiàn)癌細胞靶向治療。

圖1 GO-dsDNA-DOX探針構建及用于ATP檢測和DOX靶向遞送示意圖Fig. 1 Schematic illustration for the construction of GO-dsDNA-DOX nanoprobe for ATP detection and targeted DOX delivery

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

F-7000型熒光分光光度計（日本日立公司）；ThermoStat 型恒溫孵育器（廣州合眾生物科技股份有限公司）、Milli-Q 型純水儀（美國默克公司）；H1650 型醫(yī)用離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；Bio-Teck Epoch 型酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；Olympus IX-81型共聚焦熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；ZEN 3600型激光粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司）。

DOX 購自北京華奉聯(lián)博化學材料有限公司；單層GO 購自南京先豐納米公司；磷酸二氫鉀（KH2PO4）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、氫氧化鈉（NaOH）、氯化鈉（NaCl）、氯化鋅（ZnCl2）、氯化鋇（BaCl2）、硫酸鈉（Na2SO4）和亞硫酸鈉（Na2SO3）均購自重慶川東化工集團有限公司；天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、絲氨酸（Ser）均購自上海阿拉丁試劑有限公司；三磷酸尿苷（UTP）、三磷酸鳥苷（GTP）、三磷酸胞苷（CTP）、5′-三磷酸腺苷（ATP）、腺嘌呤核苷（A）、胞嘧啶核苷（C）和鳥嘌呤核苷（G）均購自南京優(yōu)純生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒購自日本同仁化學研究所；寡霉素（Oligomycin）購自美國Sigma-Aldrich 公司；脫氧核糖核酸酶I（DNase I）購自上海默克化工技術有限公司。所有試劑均為分析純。實驗用水為超純水（18.2 MΩ·cm，Mili-Q，美國）。ATP 的適配體與cDNA 均購自上海生工生物工程股份有限公司（Sangon Biotech， 上海），ATP 的適配體：5′-GTA ACT ACC TGG GGG AGT ATT GCG GAG GAA GGT-3′；cDNA：5′-CCC AGG TAG TTA CAT TCT CCC AGT TGA TTA AAA AAA AAA AAA AAA AAA-3′。

1.2 實驗方法

1.2.1 GO-dsDNA-DOX的制備與表征

首先，將適配體與cDNA 于95 ℃ 孵育5 min，25 ℃孵育1 h退火雜交形成雙鏈DNA（dsDNA），終濃度為2 μmol/L。于dsDNA 溶液中加入20 μg/mL DOX，并于37 ℃反應60 min，將DOX 負載在雙鏈中（dsDNA-DOX），最后加入20 μg/mL GO 溶液于25 ℃反應1.5 h，得到GO-dsDNA-DOX 探針。向該探針中加入一定濃度ATP，于37 ℃反應1.5 h，以480 nm 為激發(fā)波長，掃描500～750 nm 范圍的熒光發(fā)射光譜，分別考察DOX、dsDNA-DOX、GO-dsDNA-DOXh和GO-dsDNA-DOX-ATP熒光情況； 采用激光粒度儀測定GO、GO-dsDNA-DOX 和GO-dsDNA-DOX-ATP 的表面電位； 考察GO-dsDNA-DOX 探針在不同濃度的NaCl溶液（40、80、120、160和200 μmol/L）中的穩(wěn)定性。

1.2.2 實驗條件的優(yōu)化

為了使ATP加入后能最大程度釋放DOX，分別對DOX負載溫度、GO濃度、GO吸附溫度、GO吸附時間、ATP 反應時間以及反應緩沖液的pH 值等條件進行優(yōu)化。通過對比DOX 孵育溫度分別為14、25 和37 ℃時GO-dsDNA-DOX 探針對ATP 的響應，得到最優(yōu)的DOX 負載溫度； 通過對比GO 終質(zhì)量濃度分別為0、2、5、10、20、30、40 和50 μg/mL 得到最佳GO 質(zhì)量濃度； 同理對比了GO 吸附溫度分別為11、25 和37 ℃時ATP的響應； 通過控制GO 吸附時間分別為5、15、30、45、60、75和90 min，得到最優(yōu)的GO 吸附時間； 通過設置不同pH 值的PBS 緩沖體系（分別為4.92、5.91、6.98、7.38、7.73、8.34 和9.18）優(yōu)化反應的pH 值。實驗對比了GO-dsDNA-DOX 探針在以上條件下與ATP 的響應，通過反應前后DOX 熒光強度變化優(yōu)化最佳條件。

1.2.3 ATP的檢測

ATP 通過與適配體特異性結合進而打開dsDNA，釋放DOX，恢復GO-dsDNA-DOX 探針熒光。向GO-dsDNA-DOX 中加入不同濃度ATP（0、0.08、1、2、3、4、5、6 和8 mmol/L）后，37 ℃反應30 min。以480 nm 為激發(fā)波長掃描500～750 nm 范圍的熒光發(fā)射光譜，記錄593 nm 處的熒光強度，每個濃度設置3組平行樣。

1.2.4 選擇性與抗干擾實驗

向GO-dsDNA-DOX 探針溶液中加入2 mmol/L 的ATP 與200 mmol/L 的ATP 類似物（包括GTP、UTP、CTP），37 ℃反應30 min。按1.2.3小節(jié)方法進行光譜掃描，每組設置3個平行樣進行選擇性考察。

細胞內(nèi)成分復雜，因而考察了一些常見的陽離子、陰離子和氨基酸等共存物質(zhì)對反應體系的影響。向GO-dsDNA-DOX 探針溶液中加入2 mmol/L 的ATP 與200 mmol/L 的Cys、Ser和Asp等不同干擾組分，37 ℃反應30 min。按1.2.3小節(jié)方法進行光譜掃描，每組設置3個平行樣進行抗干擾實驗。

1.2.5 抗酶解實驗與細胞毒性

向GO-dsDNA-DOX 探針溶液中加入相同的ATP（終濃度為20 mmol/L），37 ℃反應30 min 后，對比與核酸酶（0.1 U/L）反應不同時間（0、15、30、45、60、75 和90 min）后的熒光強度，按1.2.3 小節(jié)方法進行光譜掃描，每組設置3個平行樣。

細胞毒性實驗采用的是CCK-8 法。將人乳腺癌細胞（MCF-7）置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種1.0×104個細胞，并置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后按照100 μL/孔的量分別加入不同濃度的GO-dsDNA-DOX（質(zhì)量濃度為2、10、20、40和80 μg/mL），再培養(yǎng)24 h。去掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔100 μL 10%CCK-8 試劑，37 ℃孵育20 min 后使用酶標儀在450 nm 波長處測定OD 值，計算細胞存活率，并與未負載藥物的GO-dsDNA組進行對照。

1.2.6 細胞內(nèi)DOX釋放的熒光成像

將含有2%胎牛血清的MCF-7 細胞以每孔1.0×105個細胞的密度接種在35 mm 玻璃底細胞培養(yǎng)皿中，放入5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中于37 ℃培養(yǎng)24 h。分別將含有DOX、GO-dsDNA-DOX 和GO-dsDNA-DOX-oligomycin 的培養(yǎng)基與MCF-7 細胞孵育3 h（其中DOX 質(zhì)量濃度均為2 μg/mL，oligomycin濃度為10 μmol/L）。吸除培養(yǎng)基，并用PBS洗滌3次，最后使用共聚焦掃描熒光顯微鏡熒光通道（激發(fā)波長范圍為530～560 nm，發(fā)射波長范圍為575～625 nm）下對細胞進行熒光成像。

2 結果與討論

2.1 GO-dsDNA-DOX與ATP的響應及鹽穩(wěn)定性考察

首先，用熒光光譜考察了GO-dsDNA-DOX 對ATP 的響應性能。如圖2A 所示，DOX 嵌入dsDNA 后，熒光大幅度猝滅（圖2A 曲線b），加入GO 后熒光強度進一步降低（圖2A 曲線c）。加入ATP后，與適配體特異性結合，釋放DOX，熒光有明顯恢復（圖2A 曲線d），表明ATP 與GO-dsDNA-DOX 發(fā)生了反應，使得dsDNA 解鏈，DOX 釋放。Zeta 電位結果表明，單獨GO 的Zeta 電位較低，約為-17 mV。吸附dsDNA 后，dsDNA-DOX 的電位升高約為-12 mV（圖2B）。由于DOX 帶正電，加入ATP 后，DOX 從雙鏈中釋放出來，從而Zeta 電位降低約為-25 mV，進一步證實了反應的發(fā)生。GO-dsDNA-DOX 探針鹽穩(wěn)定性分析結果圖2C所示，不同濃度氯化鈉溶液（40～200 μmol/L）對GO-dsDNA-DOX探針影響較小，證明GO-dsDNA-DOX具有良好的鹽穩(wěn)定性，可以應用于復雜介質(zhì)中ATP的檢測。

圖2 GO-dsDNA-DOX 對ATP 的響應及鹽穩(wěn)定性考察。 （A） GO-dsDNA-DOX 與ATP 反應前后的熒光光譜；（B） GO-dsDNA-DOX與ATP反應前后的Zeta電位分析； （C） GO-dsDNA-DOX的鹽穩(wěn)定性Fig. 2 Investigation on the ATP response and salt stability of GO-dsDNA-DOX nanoprobe. （A） Fluorescence spectra of GO-dsDNA-DOX before or after reaction with ATP； （B） Zeta potential analysis of GO-dsDNA-DOX before or after reaction with ATP； （C） Salt stability of GO-dsDNA-DOX

2.2 實驗條件的優(yōu)化

為了獲得GO-dsDNA-DOX 探針與ATP 反應前后明顯的信號變化，實驗優(yōu)化了幾個重要的反應條件。首先，考察了DOX 嵌入dsDNA 的溫度影響。如圖3A 所示，DOX 負載溫度為25 ℃時，加入ATP 后GO-dsDNA-DOX 探針熒光恢復效果最好。圖3B 顯示，GO 質(zhì)量濃度為60 μg/mL 時，熒光恢復較明顯，質(zhì)量濃度繼續(xù)增加，GO 吸附更強，可能會使部分DOX 重新吸附于GO 表面，熒光恢復趨勢下降，因此選擇GO質(zhì)量濃度為60 μg/mL。進一步優(yōu)化GO吸附dsDNA-DOX的溫度，發(fā)現(xiàn)GO吸附溫度為25 ℃時對ATP響應的信號變化最大，因此選擇25 ℃作為GO的吸附溫度（圖3C）。如圖3D表明，GO吸附時間為60 min時背景信號較低，熒光恢復效果較好，因而選擇60 min 為GO 的最佳吸附時間。此外，GO-dsDNA-DOX探針與ATP反應30 min內(nèi)，隨著時間的增加，加入ATP后熒光恢復越來越明顯，30～105 min內(nèi)，熒光強度的恢復趨勢變化不明顯，105 min時熒光強度恢復效果最佳，但考慮到時間成本，選擇30 min為ATP的最佳反應時間（圖3E）。最后，考察了GO-dsDNA-DOX 探針在不同pH 值的緩沖溶液下對ATP 的響應（圖3F）。結果表明，GO-dsDNA-DOX在不同pH值條件下有良好的穩(wěn)定性，當pH值為5.91時，熒光恢復最明顯，因此后續(xù)實驗選擇pH值為5.91為最優(yōu)實驗條件。

圖3 實驗條件的優(yōu)化。 （A） DOX 負載溫度； （B） GO 濃度； （C） GO 吸附溫度； （D） GO 吸附時間； （E） ATP反應時間； （F） 反應緩沖液的pH值 （誤差棒代表3次重復實驗的標準偏差）Fig. 3 Optimization of experiment conditions. （A） DOX loading temperature； （B） Concentration of GO；（C） Adsorption temperature of GO； （D） Adsorption time of GO； （E） ATP reaction time； （F） pH of buffer（Error bars represented standard deviations of three repetitive experiments）

2.3 GO-dsDNA-DOX探針用于ATP檢測及其選擇性和抗干擾能力考察

基于上述優(yōu)化得到的不同條件，考察了GO-dsDNA-DOX 探針與一系列不同濃度的ATP 反應前后的熒光光譜。實驗結果如圖4A 所示，隨著ATP 濃度的不斷增加，DOX 逐漸被釋放，熒光強度不斷恢復。當ATP 濃度在0.08～8.0 mmol/L 時，熒光強度與ATP 濃度存在良好的線性關系（圖4B），線性方程為IF=3.0897c+129.08 （c表示加入的ATP濃度，IF表示熒光強度），線性相關系數(shù)的平方r2為0.9902，檢測限為0.059 mmol/L（3σ/k，其中，σ為背景信號的標準偏差，k為校準曲線的斜率）。該方法檢測的ATP 濃度范圍與癌細胞內(nèi)ATP 含量水平（1～10 mmol/L）范圍較一致［29］，有潛力應用于腫瘤微環(huán)境中的含量分析，并實現(xiàn)藥物遞送。

圖4 GO-dsDNA-DOX 探針用于ATP 檢測及其選擇性和抗干擾能力考察。 （A） GO-dsDNA-DOX 對不同濃度ATP 的熒光響應； （B） 熒光強度與ATP 濃度之間的線性關系； （C） GO-dsDNA-DOX 探針對ATP 檢測的選擇性； （D） GO-dsDNA-DOX探針的抗干擾能力 （誤差棒代表3次重復實驗的標準偏差）Fig. 4 Detection， specificity and anti-interference of GO-dsDNA-DOX probe for ATP assay. （A） Fluorescence response of the GO-dsDNA-DOX to different ATP concentrations； （B） The linear relationship between fluorescence intensity and ATP concentrations；（C） Specificity for the detection of ATP；（D） Anti-interference of probe （Error bars represented standard deviations of three repetitive experiments）

GO-dsDNA-DOX 探針對ATP 的特異性響應對準確檢測ATP 含量是至關重要的，因此實驗考察了ATP 類似物對GO-dsDNA-DOX 的響應。如圖4C 所示，當ATP 與GO-dsDNA-DOX 反應后的熒光強度明顯高于其它3 種ATP 類似物（UTP、CTP 和GTP），表明GO-dsDNA-DOX 探針中適配體對于ATP 的特異性響應良好。進一步考察了復雜環(huán)境中共存物，包括陰離子（）、陽離子（Ca2+、Ba2+和Zn2+）及部分氨基酸（Cys、Ser 和Asp）等對ATP 檢測的干擾情況。由圖4D 可知，在加入干擾離子或氨基酸后，熒光強度出現(xiàn)小幅度的下降或升高，總體變化較小，DOX熒光仍明顯恢復，表明GO-dsDNA-DOX探針對ATP的響應具有良好的選擇性與抗干擾能力，有潛力用于細胞內(nèi)復雜環(huán)境中ATP分析及觸發(fā)DOX 靶向釋放的熒光成像監(jiān)測。

2.4 GO-dsDNA-DOX探針抗酶解能力考察與細胞毒性

為考察GO-dsDNA-DOX 探針在細胞內(nèi)釋放DOX 的情況，需要探究GO-dsDNA-DOX 的穩(wěn)定性。脫氧核糖核酸酶Ι（DNase I）是一種DNA 的脫氧核糖核酸內(nèi)切酶，它識別并切割DNA 磷酸二酯鍵，破壞DNA 結構的完整性。因此，為避免細胞內(nèi)DNase I 切割DNA 引起DOX 非特異性釋放，實驗考察了GO-dsDNA-DOX 與DNase I 在37 ℃條件下反應不同時間后的熒光強度變化。實驗結果如圖5A 所示，與未經(jīng)加入核酸酶的GO-dsDNA-DOX 相比，經(jīng)核酸酶處理的GO-dsDNA-DOX對ATP的響應沒有太大的影響，說明GO-dsDNA-DOX 探針可以有效保護DNA不受核酸酶的影響，在細胞內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

圖5 抗酶解能力考察與細胞毒性。 （A） GO-dsDNA-DOX 探針抗酶解能力考察； （B） 不同濃度的GO-dsDNADOX探針對MCF-7細胞存活率的影響（誤差棒代表3次重復實驗的標準偏差）Fig. 5 Analysis of nuclease stability and cytotoxicity of GO-dsDNA-DOX probe.（A） Investigation on stability of probe against nuclease； （B） Cytotoxicity of MCF-7 cells incubated with different concentrations of probes （Error bars represented standard deviations of three repetitive experiments）

進一步考察了GO-dsDNA-DOX 探針負載DOX 前后對MCF-7 細胞毒性的影響。結果表明，當GO 質(zhì)量濃度在5～40 μg/mL 范圍內(nèi)時，GO-dsDNA 對細胞存活率的影響很小，細胞存活率約在70%以上，表明GO-dsDNA-DOX 自身作為藥物載體時毒副作用較?。▓D5B）。一旦通過dsDNA 負載DOX，構建的GO-dsDNA-DOX 探針濃度增加對細胞存活率影響越來越大。隨著GO-dsDNA-DOX 質(zhì)量濃度增加至40 μg/mL，細胞的存活率低于50%，說明GO-dsDNA-DOX 濃度越大，釋放出來的DOX 越多，對細胞的殺傷作用越明顯。

2.5 細胞內(nèi)DOX釋放的熒光成像

將GO-dsDNA-DOX探針用于MCF-7細胞內(nèi)的ATP原位成像，結果如圖6所示。結果表明，游離的DOX組熒光較強，細胞出現(xiàn)較明顯的皺縮變圓，表明化療藥物DOX 使得細胞開始凋亡。將GO-dsDNA-DOX探針與MCF-7 細胞孵育后，細胞內(nèi)呈現(xiàn)更強的熒光，說明GO-dsDNA-DOX 比單獨的DOX 更容易進入細胞內(nèi)這是因為癌細胞內(nèi)過量的ATP 與GO-dsDNA-DOX 探針中的適配體特異性結合，雙鏈解鏈，使得DOX釋放，說明該探針能夠成功用于細胞內(nèi)ATP的成像及靶向藥物遞送。與對照組細胞的梭形形態(tài)相比，GO-dsDNA-DOX 探針組細胞形態(tài)更圓，進一步說明釋放出的DOX 能夠很好的發(fā)揮藥效，促進癌細胞的凋亡。為了證明DOX熒光釋放的確是由于ATP觸發(fā)的，以寡霉素處理的細胞為對照組進行對比。寡霉素作為ATP 酶的抑制劑［30］，可以抑制癌細胞內(nèi)ATP 酶的活性從而降低ATP 的濃度，使得GO-dsDNADOX探針與ATP結合的量減少，釋放出的DOX量也相應減少，熒光恢復降低。實驗結果表明，寡霉素處理的細胞熒光強度比未經(jīng)寡霉素處理組更弱，說明熒光恢復的量與ATP 濃度有關，癌細胞內(nèi)大量ATP觸發(fā)DOX的釋放，誘導癌細胞凋亡。

圖6 GO-dsDNA-DOX 在MCF-7 細胞中的熒光成像。第1 列：未處理的細胞； 第2 列：細胞與DOX 孵育； 第3列：細胞與GO-dsDNA-DOX孵育； 第4列：細胞與GO-dsDNA-DOX-oligomycin孵育Fig.6 Fluorescence images of the GO-dsDNA-DOX in MCF-7 cells. Line 1： control cells； Line 2： cells incubated with DOX； Line 3： cells incubated with GO-dsDNA-DOX； Line 4： cells incubated with GO-dsDNA-DOX-oligomycin

3 結 論

以GO 為載體，適配體為識別單元，dsDNA 的GC 堿基對負載抗癌藥物DOX，并猝滅其熒光，將dsDNA-DOX通過延伸序列poly A牢牢吸附在表面積較大的GO上，構建GO-dsDNA-DOX探針通過“off-on”實現(xiàn)ATP 的定量檢測，并通過癌細胞內(nèi)過量的ATP 觸發(fā)藥物DOX 釋放，實現(xiàn)靶向藥物遞送。該策略具有以下優(yōu)點： 1）該熒光法檢測ATP操作簡單、免修飾、成本低廉，且線性范圍廣、選擇性好； 2）利用poly A序列與GO 牢固的吸附作用構建的GO-dsDNA-DOX 探針光學性質(zhì)穩(wěn)定、抗酶解能力強，能極大程度地降低復雜環(huán)境中的物理吸附帶來的干擾問題，減少假陽性信號產(chǎn)生； 3）通過癌細胞內(nèi)過表達的ATP 觸發(fā)GO-dsDNA-DOX 納米探針中的DOX 釋放，可以實現(xiàn)選擇性的癌細胞內(nèi)藥物遞送，降低對正常細胞的毒副作用。結果表明，ATP 響應濃度范圍與癌細胞內(nèi)ATP 含量水平較一致，能用于細胞內(nèi)ATP 成像分析，且利用癌細胞內(nèi)過量的ATP觸發(fā)DOX釋放，對腫瘤細胞有較強的殺傷作用。該方法不僅為癌癥標志物檢測和靶向藥物遞送提供了思路，而且具有廣泛通用性，可進一步結合細胞內(nèi)凋亡標志物構建多靶物分析平臺，有望實現(xiàn)腫瘤診斷-治療-療效監(jiān)測一體化。